康超　曾維軍　鄭旋　王萬(wàn)坤　楊玲　劉忠玄　王晶

摘要：以不同地區(qū)及連作土壤為研究對(duì)象，利用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，分析不同土壤細(xì)菌和真菌物種多樣性及群落組成，并結(jié)合土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)，探討羊肚菌菌絲與土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)關(guān)系。結(jié)果表明，栽培地中土壤細(xì)菌多樣性高于真菌，正常生長(zhǎng)羊肚菌可提高土壤堿解氮含量和降低土壤真菌多樣性。門(mén)水平下，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌為放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)，真菌為子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、被孢霉門(mén)；屬水平下，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬為節(jié)桿菌屬、鞘脂單胞菌屬，連作土壤中真菌優(yōu)勢(shì)屬為被孢霉屬、頭束霉屬、青霉屬；正常生長(zhǎng)土壤為被孢霉屬、羊肚菌屬、頭束霉屬。土壤全磷與節(jié)桿菌屬、被孢霉屬、頭束霉屬呈負(fù)相關(guān)，與鐮刀菌屬呈正相關(guān)，全鉀與頭束霉屬呈正相關(guān)，各理化因子與羊肚菌屬無(wú)明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：微生物多樣性；羊肚菌；覆土層；連作

中圖分類(lèi)號(hào)：S646.701文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）14-0221-08

土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，與其他微生物種群、動(dòng)植物、環(huán)境等因素相互作用，直接或間接地參與土壤物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換等［1-2］。隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和種植規(guī)模的擴(kuò)大，不同農(nóng)藝措施對(duì)土壤本底微生物造成了明顯影響［3-7］。食用菌產(chǎn)業(yè)是中國(guó)農(nóng)業(yè)的重要產(chǎn)業(yè)，部分種類(lèi)（雙孢蘑菇、大球蓋菇、竹蓀等）需要覆土才能出菇，其土壤理化性質(zhì)及微生物種類(lèi)對(duì)其菌絲生長(zhǎng)、原基分化、子實(shí)體形成具有重要作用，反之食用菌又影響著土壤理化性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)等［3，8］。研究表明，雙孢蘑菇連作可提高土壤真菌、細(xì)菌和纖維素降解菌及有機(jī)質(zhì)、pH值，放線(xiàn)菌則減少［9］，在其扭結(jié)期和出菇期時(shí)添加鞘氨醇單胞菌屬、Dongia、無(wú)色桿菌屬和假單胞菌可提高雙孢蘑菇產(chǎn)量［10］。竹蓀覆土層細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌數(shù)量隨時(shí)間增加，pH值、氮、磷、鉀、酶活性及肥力也相應(yīng)變化［11］，熟料栽培覆土層微生物多樣性減少［12］，連作則導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量、功能微生物數(shù)量、脲酶、過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶、蛋白酶等發(fā)生變化，從而影響竹蓀正常生長(zhǎng)［13］。研究表明［14］，卵孢長(zhǎng)根菇在采收期時(shí)，覆土層真菌數(shù)量最大，細(xì)菌呈下降趨勢(shì)，而病害發(fā)生時(shí)真菌細(xì)菌豐度、土壤營(yíng)養(yǎng)元素、pH值均降低。對(duì)天麻—冬蓀輪種覆土微生物進(jìn)行研究，冬蓀菌絲可通過(guò)抑制蜜環(huán)菌生長(zhǎng)，而保持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)［15］。

羊肚菌屬典型覆土食用菌，為羊肚菌科羊肚菌屬真菌［16］。2003年，外援營(yíng)養(yǎng)袋技術(shù)助推了羊肚菌商業(yè)化栽培，栽培種類(lèi)主要為梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌［17］。研究表明，不同海拔地區(qū)羊肚菌根際土壤變形菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，且變形菌門(mén)與土壤含水量、養(yǎng)分和海拔呈正相關(guān)，與pH值、Ca、Mg含量呈負(fù)相關(guān)；放線(xiàn)菌門(mén)與Mg含量、脲酶和芳基硫酸酯酶呈正相關(guān)，與Fe、Se、速效鉀、土壤脫氫酶和堿性磷酸酶呈負(fù)相關(guān)［18］。不同土層中，以10～20 cm土層細(xì)菌多樣性最高，但多數(shù)種類(lèi)豐度較低，以變形菌門(mén)、固氮菌為主［19］。熊川等對(duì)涼山州野生羊肚菌發(fā)生地土樣進(jìn)行分析，其菌塘土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐度均高于非菌塘，以Thermosporotrichaceae、黏球菌科和紅螺菌科為主要類(lèi)群［20］。Longley等研究堆肥基質(zhì)栽培紅褐羊肚菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，其分生孢子期（菌霜期）、原基、衰退3個(gè)時(shí)期，細(xì)菌以芽孢桿菌屬、擬桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌；原基衰退和子實(shí)體期，真菌優(yōu)勢(shì)菌分別為Gilmaniella和頭孢霉［21］。比較未栽羊肚菌、正常生長(zhǎng)、染病羊肚菌土壤真菌多樣性變化，正常栽培后微生物多樣性降低，發(fā)霉病則增加［22］。以上文獻(xiàn)主要考察不同地區(qū)野生羊肚菌、不同栽培期及病害發(fā)生是栽培羊肚菌根際微生物變化情況，關(guān)于不同地區(qū)及連作對(duì)土壤微生物多樣性研究較少。因此，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同栽培地羊肚菌覆土層根際及羊肚菌連作土樣微生物群落組成、多樣性等特征進(jìn)行分析，并結(jié)合土壤理化性質(zhì)變化，探討羊肚菌菌絲與根際微生物之間的相互關(guān)系，為羊肚菌高效栽培提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2021年12月3日，在貴州省銅仁市石阡縣和碧江區(qū)羊肚菌栽培基地分別設(shè)置樣地，標(biāo)記為石阡縣試驗(yàn)組（SQS，羊肚菌連作第2年）、碧江區(qū)試驗(yàn)組（BJS，羊肚菌種植第1年），分別以不栽培羊肚菌的土壤為對(duì)照組，標(biāo)記為石阡縣對(duì)照組（CKS）、碧江區(qū)對(duì)照組（CKB）。2022年12月13日，每個(gè)樣地隨機(jī)設(shè)置20 m×20 m樣方，采用5點(diǎn)取樣法，每個(gè)樣點(diǎn)直接鉆取5～10 cm土層并混合，將土樣過(guò)2 mm篩網(wǎng)去雜質(zhì)，保存于4 ℃冰箱和-80 ℃冰箱中，用于土壤理化性質(zhì)和土壤DNA測(cè)定分析。

1.1.2 試劑

FastPfu Polymerase（TransGen，中國(guó)）；agArose瓊脂糖（Biowest，西班牙）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen，美國(guó)）；NEXTFLEX[KG-*5] Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)試劑盒（Bioo Scientific，美國(guó)）；MiSeq Reagent Kit v3測(cè)序試劑盒（Illumina，美國(guó)）。土壤基本營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)檢測(cè)的相關(guān)試劑（分析純）均購(gòu)置于成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

根據(jù) FastDNA[KG-*5] Spin Kit for Soil DNA抽提試劑盒（MP Biomedicals，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)逐步進(jìn)行土樣微生物群落總DNA抽提，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2 000（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）測(cè)定DNA濃度和純度。以提取的總DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用真菌通用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對(duì)ITS1基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，再在10 ℃進(jìn)行保存。338F-806R引物PCR反應(yīng)體系為：5×FastPfu Buffer 緩沖液 4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，上游引物（5 mmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase DNA聚合酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O補(bǔ)足至 20.0 μL。ITS1F-ITS2R引物PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer緩沖液2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs? 2.0 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。

1.2.3 Illumina Miseq測(cè)序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，美國(guó)）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用QuantusTM Fluorometer（Promega，美國(guó)）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，美國(guó)）進(jìn)行建庫(kù)：（1）接頭鏈接；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；（4）磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)（Illumina，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 土壤理化指標(biāo)測(cè)定

土壤全氮、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀、pH值分別按照NY/T 53—1987、GB/T 9837—1988、NY/T 87—1988、NY/T 1121.7—2014、NY/T 1849—2010、NY/T 1241—1999進(jìn)行測(cè)定；土壤堿解氮按照《土壤學(xué)實(shí)驗(yàn)》中的堿解擴(kuò)散法［23］進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Uparse7.0.1090進(jìn)行OTU分析，聚類(lèi)方式采用USEARCH7-uparse算法，OTU序列相似度為0.97，物種分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)為unite8.0/its_fungi，分類(lèi)置信度為0.7。使用mothur v.1.30.2計(jì)算Shannon指數(shù)，并對(duì)組間Shannon指數(shù)差異進(jìn)行t檢驗(yàn)。使用R語(yǔ)言3.3.1制作群落柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤樣本理化性質(zhì)變化

分別在石阡縣和碧江區(qū)羊肚菌栽培基地采集土樣35份，其中，石阡縣14份，碧江區(qū)21份。石阡縣土樣為羊肚菌連作土壤，播種羊肚菌后菌絲萌發(fā)緩慢，竄土能力差，外援營(yíng)養(yǎng)袋吃料慢，污染率高；碧江區(qū)土樣為第1年羊肚菌栽培土壤，其菌絲萌發(fā)快，生長(zhǎng)旺盛，營(yíng)養(yǎng)袋吃料快，污染率低。對(duì)不同土壤理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表1）表明，石阡縣土樣全氮含量、全鉀含量、pH值高于碧江區(qū)（P<0.05），全磷、有效磷、速效鉀含量低于碧江區(qū)（P<0.05），2個(gè)樣地試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著。碧江區(qū)試驗(yàn)組堿解氮含量最高，明顯高于對(duì)照組（P<0.05），而所有樣品有機(jī)質(zhì)差異不顯著。

2.2 不同土壤樣本中細(xì)菌、真菌物種多樣性分析

對(duì)不同土壤樣品細(xì)菌和真菌DNA進(jìn)行抽提和測(cè)序，高通量分析后，獲得8 613個(gè)細(xì)菌物種OTU，屬于45個(gè)門(mén)和1 159個(gè)屬，總序列數(shù) 1 572 726 條，各樣本序列平均數(shù)38 989～49 520條，序列平均長(zhǎng)度為407 bp；獲得4 411個(gè)真菌物種OTU，屬于16個(gè)門(mén)和780個(gè)屬，總序列數(shù)2 503 140條，各樣本序列數(shù)范圍為66 151～76 349條，序列平均長(zhǎng)度為 2 391 bp（表2）。由表2可知，碧江區(qū)土樣細(xì)菌Shannon指數(shù)高于石阡縣土樣，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)差異不明顯；真菌Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)則存在差異，碧江區(qū)對(duì)照組最高，試驗(yàn)組降低，與對(duì)照組差異明顯（P<0.05），石阡縣也低于對(duì)照組，差異不顯著；碧江區(qū)土樣ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)高于石阡縣，2個(gè)土樣試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不明顯。結(jié)果表明，羊肚菌栽培前后細(xì)菌多樣性和真菌多樣性均降低，菌絲正常生長(zhǎng)前后真菌變化顯著，連作前后細(xì)菌和真菌多樣性變化不明顯，推測(cè)土壤中真菌多樣性與羊肚菌菌絲長(zhǎng)勢(shì)有關(guān)。

2.3 不同土壤環(huán)境中微生物物種組成

2.3.1 細(xì)菌真菌門(mén)水平下物種相對(duì)豐度

由圖1-a 可知，門(mén)水平下放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、酸桿菌門(mén)為各土樣土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，以放線(xiàn)菌門(mén)占比最高，其4個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)相對(duì)豐度平均值分別為35.07%、21.83%、12.89%、11.39%，石阡縣樣地放線(xiàn)菌門(mén)豐度高于碧江區(qū)樣地，碧江區(qū)試驗(yàn)組高于對(duì)照組。由圖1-b可知，門(mén)水平下子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌、被孢霉門(mén)為各土樣土壤優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)，以子囊菌門(mén)占比最高，其3個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén)類(lèi)相對(duì)豐度平均值分別為66.10%、20.62%、10.32%，石阡縣（連作土壤）子囊菌門(mén)物種豐度減少，擔(dān)子菌門(mén)、被孢霉門(mén)增加，碧江區(qū)（正常生長(zhǎng)）羊肚菌樣地3個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)物種豐度差異不明顯。

由圖2-a可知，在細(xì)菌主要屬水平下共有35個(gè)屬相對(duì)豐度>1%，其中，石阡縣樣地節(jié)桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、類(lèi)諾卡氏菌、Gaiella和Vicinamibacterales、Galellales中不能注釋的屬物種豐度占比較高，均>2%，以節(jié)桿菌屬占比最高，對(duì)照組和試驗(yàn)組分別達(dá)到12.33%和13.90%；碧江區(qū)樣地物種占比相對(duì)均勻，僅試驗(yàn)組節(jié)桿菌屬占比較高（3.85%）。結(jié)果表明，2個(gè)樣地中節(jié)桿菌屬物種豐度差異大，連作土壤占比大，且播種羊肚菌后，節(jié)桿菌屬占比有一定提高。由圖2-b可知，在真菌屬水平上共有33個(gè)屬相對(duì)豐度>1%，石阡縣樣地中被孢霉屬、頭束霉屬、青霉屬物種豐度占比最大，可看出栽培羊肚菌后，被孢霉屬豐度明顯增加，頭束霉屬豐度則明顯降低、青霉屬豐度變化不大，羊肚菌屬豐度差異不顯著。碧江區(qū)樣地中被孢霉屬占比較大，栽培羊肚菌后豐度有所減少；試驗(yàn)組中羊肚菌屬物種豐度占比最大（21.15%），因羊肚菌栽培第1年，故對(duì)照組未檢測(cè)出羊肚菌屬；青霉屬物種豐度無(wú)明顯變化。碧江區(qū)土樣與對(duì)照組頭束霉屬豐度較低，差異不明顯，但明顯低于石阡縣樣地。

2.3.2 不同土壤環(huán)境真菌、細(xì)菌β多樣性分析

對(duì)樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA），結(jié)果（圖3）表明，4個(gè)分組細(xì)菌、真菌物種基本匯聚在一起，同樣地對(duì)照組和試驗(yàn)組物種均有交叉，表明對(duì)照組和試驗(yàn)組間物種存在相似性，但栽培羊肚菌之后，樣地中物種組成發(fā)生了變化，樣本之間物種差異變大。2個(gè)樣地細(xì)菌真菌相對(duì)獨(dú)立匯聚在一起，樣本間距離遠(yuǎn)，表明2個(gè)樣地間物種組成差異大，且碧江區(qū)樣地物種多樣性差異大于石阡縣樣地。表明樣地間物種多樣性差異要大于組內(nèi)物種多樣性。

2.3.3 不同土壤環(huán)境主要真菌、細(xì)菌物種差異分析

對(duì)2個(gè)樣地土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬進(jìn)行組間差異分析，結(jié)果（圖4-a）表明，不同處理間主要物種有顯著或極顯著差異（Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，P<0.05，P<0.01），Top 10已知物種分別為節(jié)桿菌屬、芽單胞菌屬、小單孢菌屬、溶桿菌屬，其他物種暫不能注釋?zhuān)虼丝疾烨?優(yōu)勢(shì)屬物種在不同分組間的差異性。由圖4-b、圖4-d可知，石阡縣試驗(yàn)組中節(jié)桿菌屬、小單孢菌屬豐度最高，明顯高于碧江區(qū)樣地物種豐度（P<0.01），略高于對(duì)照組，但不顯著；由圖 4-c 可知，碧江區(qū)試驗(yàn)組芽單胞菌屬豐度明顯高于石阡縣樣地（P<0.01），略高于對(duì)照組，但不顯著。

對(duì)2個(gè)樣地土壤真菌優(yōu)勢(shì)屬進(jìn)行組間差異分析，結(jié)果（圖5-a）表明，不同處理間主要物種有顯著或極顯著差異（Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，P<0.05，P<0.01），Top 10已知物種分別為被孢霉屬、頭束霉屬、羊肚菌屬、鐮刀菌屬、籃狀菌屬、毛殼屬、Gibellulopsis、Albifimbria、芽枝霉屬，1個(gè)種類(lèi)暫無(wú)明確分類(lèi)地位，因此考察前3優(yōu)勢(shì)屬物種在不同分組間的差異性，由圖5-b可知，石阡縣試驗(yàn)組中被孢霉屬豐度最高。由圖5-d可知，石阡縣對(duì)照組頭束霉屬豐度最高，兩者明顯高于碧江區(qū)樣地物種豐度（P<0.01）；由圖5-c可知，碧江區(qū)試驗(yàn)組羊肚菌屬豐度明顯高于石阡縣樣地（P<0.01）。

2.4 不同土壤環(huán)境微生物群落與土壤營(yíng)養(yǎng)的相關(guān)性分析

考察土壤理化性質(zhì)與土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系，為確定共線(xiàn)性較小的環(huán)境因子，分別對(duì)細(xì)菌物種和真菌物種進(jìn)行方差膨脹因子（VIF）分析?；诤Y選出的主要土壤營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行RDA/CCA分析，結(jié)果（圖6-a）表明，速效鉀、有效磷、堿解氮、有機(jī)質(zhì)與碧江區(qū)土樣細(xì)菌群落組成呈正相關(guān)，pH值、全鉀與石阡縣土樣細(xì)菌群落組成呈正相關(guān)。速效鉀、有效磷、堿解氮、有機(jī)質(zhì)之間呈正相關(guān)，與全磷、全鉀呈負(fù)相關(guān)，以全鉀對(duì)石阡縣試驗(yàn)組細(xì)菌群落組成影響最大，以速效鉀、有效磷對(duì)碧江區(qū)群落組成影響最大。由圖6-b可知，全鉀、pH值與石阡縣對(duì)照組真菌群落組成呈正相關(guān)，速效鉀、有效磷與碧江區(qū)試驗(yàn)組真菌群落組成呈正相關(guān)，有效磷、速效鉀與全鉀、pH值之間呈負(fù)相關(guān)，彼此之間呈負(fù)相關(guān)，以有效磷對(duì)碧江區(qū)真菌群落組成影響最大。

2.5 不同土壤環(huán)境中土壤微生物物種與土壤營(yíng)養(yǎng)的相關(guān)性分析

由圖7可知，不同樣地中的理化性質(zhì)指標(biāo)均與相對(duì)基因豐度排名前10的細(xì)菌屬有一定相關(guān)性，其中細(xì)菌屬中速效鉀與Vicinamibacterales無(wú)法注釋的屬呈正相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)為48.29%，有效磷與節(jié)桿菌屬呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）（圖7-a），真菌屬中有效磷與鐮刀菌屬、青霉屬、籃狀菌屬，全鉀與毛殼屬、頭束霉屬均呈正相關(guān)（P<0.01，P<0.05），速效鉀與毛殼屬、沙蜥屬，有效磷與被孢霉屬、頭束霉屬呈負(fù)相關(guān)（P<0.01，P<0.05）（圖7-b），其他理化性質(zhì)與物種之間無(wú)相關(guān)性或呈弱相關(guān)性。結(jié)果表明，土壤中理化性質(zhì)對(duì)物種豐度影響較小。

3 討論與結(jié)論

土壤微生物多樣性和外源微生物的種類(lèi)和數(shù)量呈正相關(guān)［7，24］，本研究考察不同地區(qū)連作羊肚菌覆土層土壤，未栽培羊肚菌（對(duì)照組）和栽培羊肚菌（試驗(yàn)組）之間土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌真菌多樣性變化情況。結(jié)果表明，碧江區(qū)試驗(yàn)組覆土層堿解氮明顯增加，可能在于正常生長(zhǎng)羊肚菌菌絲多，活力強(qiáng)，可轉(zhuǎn)變土壤中氮素形態(tài)，增加效養(yǎng)分含量［25-26］。比較不同樣地細(xì)菌、真菌多樣性差異，細(xì)菌多樣性高于真菌多樣性，同一樣地試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)菌多樣性差異不大。碧江區(qū)樣地（正常生長(zhǎng)）真菌多樣性低于對(duì)照組，可能在于連作時(shí)本底微生物及理化性質(zhì)抑制了羊肚菌菌絲生長(zhǎng)，則真菌多樣性變化不大，而羊肚菌菌絲正常生長(zhǎng)，成為優(yōu)勢(shì)菌群，從而抑制了本底微生多樣性，與前人研究［22，27］一致。對(duì)不同樣地土壤微生物主要屬水平物種進(jìn)行分析，石阡縣和碧江區(qū)樣地差異較大，即地域之間物種差異性大于栽培前后差異性。連作土壤中細(xì)菌主要物種為節(jié)桿菌屬，且對(duì)照組和試驗(yàn)組物種豐度分別達(dá)12.33%和13.90%。從2個(gè)樣地栽培前后看，羊肚菌栽培后節(jié)桿菌屬豐度均有一定程度的增加，表明羊肚菌栽培及連作可增加節(jié)桿菌屬豐度，且是連作過(guò)程中的代表物種［28-29］。屬水平下真菌物種主要有被孢霉屬、頭束霉屬、羊肚菌屬。針對(duì)被孢霉屬物種豐度，石阡縣樣地明顯高于碧江區(qū)，前者在連作后物種豐度增加，后者則有一定降低，但不明顯。研究表明，頭束霉屬在羊肚菌原基退化時(shí)有明顯豐度［21］，本研究發(fā)現(xiàn)連作土樣中該物種占比很大，對(duì)其原基分化有明顯影響，栽培結(jié)果表明石阡縣土樣在原基分化后無(wú)法正常生長(zhǎng)，或衰退，或無(wú)法形成成熟子實(shí)體。Longley等發(fā)現(xiàn)，在羊肚菌菌絲生長(zhǎng)和成熟時(shí)期，芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、Gilmaniella是覆土層優(yōu)勢(shì)菌［21］，本研究則未發(fā)現(xiàn)這2個(gè)種類(lèi)，與文獻(xiàn)有差異。鐮刀菌被認(rèn)為是一類(lèi)重要植物病原菌類(lèi)群，具有隨著栽植代數(shù)增加而顯著增加的趨勢(shì)［27，30］，本研究發(fā)現(xiàn)連作后鐮刀菌豐度與對(duì)照物種豐度差異不明顯，原因可能在于地區(qū)及土壤生態(tài)系統(tǒng)中物種的差異影響，有待進(jìn)一步研究。而栽培羊肚菌，碧江區(qū)對(duì)照組鐮刀菌屬物種豐度明顯降低，推測(cè)羊肚菌菌絲有抑制鐮刀菌屬真菌的作用，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究通過(guò)對(duì)不同地區(qū)和連作土壤理化性質(zhì)、微生物（真菌、細(xì)菌）群落組成結(jié)構(gòu)、多樣性等特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)羊肚菌屬物種豐度可轉(zhuǎn)變土壤中氮素，提高堿解氮含量。不同土樣細(xì)菌多樣性高于真菌，連作土壤細(xì)菌、真菌多樣性差異不顯著，正常生長(zhǎng)羊肚菌可降低真菌多樣性。在門(mén)水平下，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)物種為放線(xiàn)菌門(mén)、變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)，真菌優(yōu)勢(shì)物種為子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、被孢霉門(mén)。屬水平下，細(xì)菌優(yōu)勢(shì)物種為節(jié)桿菌屬、鞘脂單胞菌屬；連作土壤中真菌優(yōu)勢(shì)屬為被孢霉屬、頭束霉屬、青霉屬；碧江區(qū)樣地為被孢霉屬、羊肚菌屬、青霉屬。相關(guān)分析表明，全磷與節(jié)桿菌屬呈負(fù)相關(guān)，與鐮刀菌屬呈正相關(guān)，全鉀與頭束霉屬均呈正相關(guān)，全磷與被孢霉屬、頭束霉屬呈負(fù)相關(guān)，各理化因子與羊肚菌屬無(wú)明顯相關(guān)性。

參考文獻(xiàn)：

［1］張 青，王 辰，孫宗湜，等. 土壤微生物生物量及多樣性影響因素研究進(jìn)展［J］. 北方園藝，2022（8）：116-121.

［2］Sokol N W，Slessarev E，Marschmann G L，et al. Life and death in the soil microbiome：how ecological processes influence biogeochemistry［J］. Nature Reviews Microbiology，2022，20（7）：415-430.

［3］莊 巖，吳鳳芝. 不同農(nóng)藝措施對(duì)土壤微生物的影響研究進(jìn)展［J］. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（6）：136-140.

［4］Cozzolino V，di Meo V，Monda H，et al. The molecular characteristics of compost affect plant growth，arbuscular mycorrhizal fungi，and soil microbial community composition［J］. Biology and Fertility of Soils，2016，52（1）：15-29.

［5］Jia T，Cao M W，Jing J H，et al. Endophytic fungi and soil microbial community characteristics over different years of phytoremediation in a copper tailings dam of Shanxi，China［J］. Science of the Total Environment，2017，574：881-888.

［6］Hestrin R，Hammer E C，Mueller C W，et al. Synergies between mycorrhizal fungi and soil microbial communities increase plant nitrogen acquisition［J］. Communications Biology，2019，2：233.

［7］周 璇，李玉明，叢 聰，等. 外源腐解微生物的物種組合對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝活性的影響［J］. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，26（7）：1056-1066.

［8］劉培田. 食用菌覆土栽培機(jī)制及效應(yīng)［J］. 中國(guó)食用菌，1995，14（2）：22-25.

［9］黃 敏，李登煜，陳 強(qiáng)，等. 雙孢蘑菇連作土壤微生物區(qū)系初步分析［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2005，18：153-155.

［10］任鵬飛，曲 玲，盧 瀟，等. 通過(guò)調(diào)整覆土中的微生物以促進(jìn)雙孢蘑菇增產(chǎn)的方法：CN111820075A［P］. 2020-10-27.

［11］蘇德偉，林 輝，林春梅，等. 不同生長(zhǎng)時(shí)期竹蓀覆土層土壤微生物、理化性質(zhì)及其酶活性的變化研究［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27（3）：1170-1174.

［12］吳紅萍，陳喜蓉，甫秋燕，等. Biolog-ECO解析長(zhǎng)裙竹蓀栽培種覆土層土壤微生物群落功能多樣性特征［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，36（10）：4223-4228.

［13］呂楊蘭. 竹蓀連作障礙成因分析［D］. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

［14］詹穎馨，方 亮，付圣麟，等. 卵孢長(zhǎng)根菇不同生長(zhǎng)期覆土層微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022，53（4）：1143-1151.

［15］徐 嬌，歐小宏，江維克，等. 天麻—冬蓀輪種模式對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響［J］. 中國(guó)中藥雜志，2020，45（3）：463-471.

［16］吳興亮，卯曉嵐，圖力古爾.中國(guó)藥用真菌［M］. 北京：科學(xué)出版社，2013：1-939.

［17］賀新生. 羊肚菌生物學(xué)基礎(chǔ)、菌種分離制作與高產(chǎn)栽培技術(shù)［M］. 北京：科學(xué)出版社，2017：1-232.

［18］趙玉卉，路等學(xué)，金 輝，等. 甘肅省野生羊肚菌根際細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子相關(guān)性研究［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2022，49（2）：514-528.

［19］楊曉絨，賴(lài)曉輝，吾爾恩·阿合別爾迪，等. 昭蘇縣野生羊肚菌根際土壤細(xì)菌多樣性研究［J］. 微生物學(xué)雜志，2020，40（4）：24-33.

［20］熊 川，李小林，李 強(qiáng)，等. 羊肚菌菌塘土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)及多樣性［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，41（4）：428-434.

［21］Longley R，Benucci G M N，Mills G，et al. Fungal and bacterial community dynamics in substrates during the cultivation of morels （Morchella rufobrunnea） indoors［J］. FEMS Microbiology Letters，2019，366（17）：fnz215.

［22］陳 誠(chéng)，李 強(qiáng)，黃文麗，等. 羊肚菌白霉病發(fā)生對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2017，44（11）：2652-2659.

［23］呂貽忠，李保國(guó). 土壤學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：1-238.

［24］許 楠，刑軍會(huì)，隋 心，等. 土地利用方式對(duì)高寒地區(qū)濕地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（24）：233-240.

［25］白 瑩，周柳婷，張 晨，等. 外源微生物對(duì)木麻黃幼苗生長(zhǎng)和土壤微生物群落的影響［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2021，32（8）：2939-2948.

［26］祝 英，彭軼楠，鞏曉芳，等. 不同微生物菌劑對(duì)當(dāng)歸苗生長(zhǎng)及根際土微生物和養(yǎng)分的影響［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2017，23（3）：511-519.

［27］沈 洪，汪 虹，趙永昌，等. 采用變性梯度凝膠電泳研究羊肚菌土壤真菌群落結(jié)構(gòu)［J］. 食用菌學(xué)報(bào)，2009，16（2）：6-12.

［28］譚雪蓮，郭天文，胡新元，等. 黃土高原旱作區(qū)馬鈴薯連作根際土壤微生物群落變化特征［J］. 作物學(xué)報(bào)，2022，48（3）：682-694.

［29］姚小東，李孝剛，丁昌峰，等. 連作和輪作模式下花生土壤微生物群落不同微域分布特征［J］. 土壤學(xué)報(bào)，2019，56（4）：975-985.

［30］羅 揚(yáng)，劉書(shū)影，周柳婷，等. 連栽杉木根際土壤鐮刀菌屬真菌群落變化規(guī)律［J］. 生態(tài)學(xué)雜志，2020，39（9）：2921-2929.

收稿日期：2022-10-05

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：黔科合支撐［2022］114、黔科合服企［2019］4007-6）。

作者簡(jiǎn)介：康 超（1987—），男，貴州仁懷人，碩士，高級(jí)工程師，從事食藥用菌菌種繁育及栽培技術(shù)研究。E-mail：464286916@qq.com。