張?chǎng)?張瑛 李娜 鄭敏 吳虹 孫湛

元素是人體生理機(jī)能和代謝必不可少的重要組成部分，在人體血液中保持著一定濃度，通過(guò)參與合成人體中維生素、核酸、生物酶以及激素等，影響人體健康及多種疾病的變化和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，人體的元素含量變化與諸多疾病密切相關(guān)[1]。人體血液作為最重要的生物樣本，其元素水平能直接反映體內(nèi)元素變化，是臨床診斷和治療的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。隨著儀器分析技術(shù)的發(fā)展，金屬微量元素分析方法也日趨先進(jìn)，如溶出伏安法、X射線熒光法、原子吸收光譜法（atomic absorption spectroscopy，AAS）、原子熒光光譜法（atomic fluorescence spectrometry，AFS）、電感耦合等離子光譜法（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES）和電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）等[2-8]。其中ICP-MS具有分析速度快、線性范圍寬、靈敏度高以及能實(shí)現(xiàn)多元素同時(shí)檢測(cè)已成為元素分析技術(shù)最新常用方法。但對(duì)于血液樣品分析ICP-MS仍然存在很多問(wèn)題，其原因是血液樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、小分子化合物和無(wú)機(jī)鹽等成分，對(duì)快速、準(zhǔn)確測(cè)定產(chǎn)生了影響。同時(shí)血液樣品前處理技術(shù)如微波消解、水浴消解等能消除大部分基質(zhì)干擾的影響，但耗時(shí)長(zhǎng)、試劑用量大、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)，均不適應(yīng)大規(guī)模樣品的處理。當(dāng)前人體血液中元素的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)不多，如2022年1月實(shí)施的《血清中碘的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn) 電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（WS/T 783-2021）、2000年5月實(shí)施的《血中鉛、鎘的石墨爐原子吸收光譜測(cè)定方法》（WS/T 174-1999）等，這些多以血液樣本中單元素測(cè)定為主。因此，建立人體血液中多元素，同時(shí)、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)醫(yī)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)建立了ICP-MS測(cè)定人體血液中鉻（chromium，Cr）、錳（manganese，Mn）、鈷（cobalt，Co）、鎳（nickel，Ni）、銅（copper，Cu）、砷（arsenic，As）、硒（selenium，Se）、鍶（strontium，Sr）、鉬（molybdenum，Mo）、鎘（cadmium，Cd）、錫（stannum，Sn）、銻（antimony，Sb）、鋇（barium，Ba）、鉈（thallium，TI）和鉛（lead，Pb）等15種元素的快速測(cè)定方法，優(yōu)化了分析條件及測(cè)定模式，簡(jiǎn)化了前處理分析步驟，節(jié)省了試劑和分析時(shí)間，為人體生物監(jiān)測(cè)項(xiàng)目大批量、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定人體全血樣品中的金屬元素提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

Thermo Fisher iCAP Q型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；CR22N型高速離心機(jī)（日本Hitachi公司）；Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器（美國(guó)Scientific Industries公司）；TYMR-Ⅲ型血液混勻器（上海旌派儀器有限公司）；Direct-Q型純水機(jī)（德國(guó)Merck Millipore公司）。

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

硝酸（55%，電子AA-10級(jí)，日本Tama Chemicals公司）；TritonX-100[生化試劑級(jí)，阿拉丁試劑（上海）有限公司]。多元素金屬混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL，PECAL2-ASL-1，美國(guó)AccuStandard 公司）；多元素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液（10 μg/mL，AG-INTSTD-ASL-1美國(guó)AccuStandard公司）；凍干全血有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Trace Elements Whole Blood L-1，挪威Seronorm公司）；ICP-MS質(zhì)譜調(diào)諧液（美國(guó)Thermo Fisher公司）；氬氣（Ar，＞99.999%）和氦氣（He，＞99.999%）（濟(jì)南德洋氣體公司）。

1.3 樣品來(lái)源與研究時(shí)間

選取2022年2—6月200名在濟(jì)南市醫(yī)院保健門診健康體檢人群作為研究對(duì)象。年齡38～73歲，平均（60.29±5.87）歲。采取血樣放置于-80℃保存。研究工作時(shí)間為2022年7月—2023年1月。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

取冷凍血液樣品放置到室溫，置于血液混勻器混勻15 min，準(zhǔn)確吸取樣品0.50 mL于15 mL離心管內(nèi)，加入9.50 mL 0.1%HNO3+0.01%Triton X-100稀釋液，在渦旋振蕩器渦旋混勻30 s，同時(shí)做試劑空白，以3 500 r/min（離心半徑11.3 cm）離心5 min，取上清液，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)系列與內(nèi)標(biāo)溶液的配制

取多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使用0.1%HNO3+0.01%Triton X-100稀釋液依次配制成0.10、0.50、1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列；吸取100 μL多元素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液于1 000 mL容量瓶中，用1% HNO3溶液定容得濃度10.0 μg/L混合內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4.3 儀器工作條件

使用ICP-MS質(zhì)譜調(diào)諧液調(diào)諧儀器至最佳使用狀態(tài)，滿足普通標(biāo)準(zhǔn)（STD）模式下，鋰（7Li）、59Co、銦（115In）和鈾（238U）元素響應(yīng)值≥50 000、100 000、200 000和300 000；氦氣碰撞（kinetic energy discrimination，KED）模式下，59Co≥30 000和59Co/35Cl.16O＞18。射頻發(fā)生器功率為1 500 W，霧化器流速為1.05 L/min，輔助氣流速為0.80 L/min，冷卻氣體流速為14.0 L/min，碰撞氦氣流速為5.00 mL/min，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為40 r/min，掃描次數(shù)為20次，采樣錐和截取錐均為鎳錐。

2 結(jié)果

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1 稀釋劑的選擇

選擇3種不同稀釋劑[A：1%硝酸（V/V）；B：0.1%硝酸（V/V）；C：0.1%硝酸（V/V）+0.1%Triton100（V/V）]對(duì)人體血樣進(jìn)行直接稀釋，并通過(guò)加標(biāo)回收率分析其對(duì)元素檢測(cè)的影響。從圖1中能看到稀釋劑C的加標(biāo)回收率最好，能保證樣品分析的準(zhǔn)確性。這源于接近中性的溶液更接近人體的酸堿性；0.1%Triton100的加入降低了血液的黏度，同時(shí)又對(duì)較好的碳補(bǔ)償劑起到一定增敏的作用。

圖1 不同稀釋劑加標(biāo)回收率

2.1.2 內(nèi)標(biāo)元素的選擇

儀器不穩(wěn)定或非質(zhì)譜干擾引起的信號(hào)不穩(wěn)定通常選擇內(nèi)標(biāo)元素來(lái)校正。根據(jù)內(nèi)標(biāo)元素的選擇原則，本實(shí)驗(yàn)選擇鍺（74Ge）用作低質(zhì)量數(shù)元素Cr、Mn、Ni、Co、As、Se、Sr和Cu等的內(nèi)標(biāo)元素，115In被用作Mo、Sn、Cd、Sb和Ba等的內(nèi)標(biāo)元素，鉍（209Bi）被用作TI和Pb等的內(nèi)標(biāo)元素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，42Sc回收率變化較大，因此選擇其不作為本實(shí)驗(yàn)內(nèi)標(biāo)元素。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在線加標(biāo)的方式將混合內(nèi)標(biāo)溶液引入進(jìn)樣系統(tǒng)中。

2.1.3 質(zhì)譜干擾的優(yōu)化

ICP-MS在多元素測(cè)定時(shí)，氧化物和雙電荷離子干擾、同量異位素干擾、多原子離子干擾等為主要的質(zhì)譜干擾，其中最主要的干擾來(lái)源是多原子離子干擾。通過(guò)干擾校正方程、儀器優(yōu)化以及碰撞反應(yīng)池技術(shù)能有效降低多原子離子帶來(lái)的干擾，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)中分析元素Cr干擾來(lái)自40Ar12C+和37Cl15O+、As干擾來(lái)自40Ar35Cl+，利用KED模式能有效降低多原子離子能量，明顯降低對(duì)待測(cè)元素的干擾；分析元素Cd和Pb干擾主要為同量異位素干擾，通過(guò)干擾校正方程和選擇次靈敏度的質(zhì)量數(shù)分析能最大程度上消除同量異位素干擾的影響。非質(zhì)譜型干擾程度與樣品基體性質(zhì)有關(guān)，可通過(guò)對(duì)樣品稀釋、內(nèi)標(biāo)法或標(biāo)準(zhǔn)加入法等降低干擾，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)血樣樣本稀釋20倍以及選擇合適內(nèi)標(biāo)，能有效降低非質(zhì)譜型干擾?？紤]實(shí)驗(yàn)時(shí)間和大批量檢測(cè)的要求本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一選擇常用的He氣作為KED模式對(duì)血樣樣本稀釋20倍進(jìn)行測(cè)定。

2.2 方法性能指標(biāo)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和線性范圍

本實(shí)驗(yàn)各分析元素標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均＞0.999，平行測(cè)定11次空白溶液各分析元素的結(jié)果3倍和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差其對(duì)應(yīng)的濃度來(lái)確定檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）。見表1。

表1 全血中15種元素線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限

2.2.2 精密度和加標(biāo)回收率

選取5份實(shí)際血液樣品混合后測(cè)定，按照加標(biāo)量為樣品中原含量的0.5～2倍分別加入高、中和低3種濃度的目標(biāo)元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測(cè)定6次計(jì)算各元素的加標(biāo)回收率和精密度。所測(cè)元素的加標(biāo)回收率為87%～118%，對(duì)每個(gè)加標(biāo)后樣本重復(fù)測(cè)定6次計(jì)算各目標(biāo)元素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），其值為0.8%～4.2%。

2.2.3 全血標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測(cè)

為了更直觀評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性，對(duì)全血有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。向凍干全血有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入3.00 mL水，手動(dòng)搖勻30 min；準(zhǔn)確吸取0.50 mL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)3份與血液樣品前處理同步驟操作，測(cè)定各分析元素的含量，檢測(cè)結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各元素的檢測(cè)值與證書給出的參考值具有很好的吻合度，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法可以滿足血液樣品中元素的準(zhǔn)確定量。

表2 全血中15種元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果（μg/L）

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)采集于2022年上半年濟(jì)南市65歲以下和以上健康人群的全血樣品各100份，各分析元素的含量結(jié)果見圖2～圖3。從圖中能發(fā)現(xiàn)血液中各分析元素的含量分布，Cu元素含量較高，平均濃度在900 μg/L左右。Se元素次之，平均濃度在100 μg/L左右。Ba、Mn、Pb、Sr等元素的平均濃度在10～50 μg/L，As和Sb元素的平均濃度約為4 μg/L，Cr、Co、Ni、Mo、Cd、Sn、TI等元素含量較低，平均濃度均低于1 μg/L。通過(guò)兩組圖對(duì)比，發(fā)現(xiàn)65歲以下和以上健康人群各元素平均含量近似，僅有Pb元素平均含量65歲以下低于65歲以上人群約5 μg/L。

圖2 65歲以下健康人群的全血樣品15種元素箱式圖

圖3 65歲以上健康人群的全血樣品15種元素箱式圖

3 討論

目前對(duì)于ICP-MS生物樣品的前處理方法以消解法為主，微波消解、水浴消解為主導(dǎo)方法。消解法能減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾，提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，但消解法操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、試劑消耗多、環(huán)境污染大，同時(shí)易于引入外源性污染等問(wèn)題，不能滿足生物樣品元素含量低、取樣量小和樣本量大的檢測(cè)需求。因此，對(duì)于生物樣品，特別是血液樣本，發(fā)展基于直接稀釋的樣品前處理方法，采用合適的稀釋劑和質(zhì)譜工作條件來(lái)滿足樣品中元素的準(zhǔn)確定量以及簡(jiǎn)化前處理流程的需求就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用接近中性的弱酸溶液更接近人體的酸堿性，Triton100的加入降低了血液的黏度并提高元素分析的靈敏度，保證了血液樣本更好的分散性[9]。干擾問(wèn)題一直是ICP-MS研究的難點(diǎn)，質(zhì)譜干擾以多原子離子干擾為主，目前消除多原子離子干擾的主流方法是利用碰撞/反應(yīng)池技術(shù)[10]。在碰撞/反應(yīng)池技術(shù)中氦氣常作為碰撞氣體。氦氣為惰性氣體，在碰撞/反應(yīng)池中不會(huì)形成新的干擾物，待測(cè)元素也不因副反應(yīng)而有損失，反應(yīng)池中沒(méi)有新的副反應(yīng)離子，因此無(wú)需動(dòng)態(tài)掃描去消除副反應(yīng)產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)人體血液樣品中基質(zhì)效應(yīng)的探討，選擇碰撞/反應(yīng)池技術(shù)以氦氣作為碰撞氣確立了Cr、Mn、Co、Ni、Cu、As、Se、Sr、Mo、Cd、Sn、Sb、Ba、TI和Pb等15種金屬元素檢測(cè)方法，通過(guò)選擇合適的氦氣流量有效地消除血液中干擾效應(yīng)同時(shí)又保證了待測(cè)元素的靈敏度。通過(guò)方法學(xué)評(píng)價(jià)，驗(yàn)證了該方法對(duì)人體血液樣品中15種金屬元素分析的可行性。該方法取樣量小、操作簡(jiǎn)便、實(shí)際消耗少、環(huán)境污染低，能滿足大批量血液樣品的檢測(cè)需求。利用該方法對(duì)200名兩個(gè)年齡段的健康人體血液樣本檢測(cè)分析，得出了部分健康人體血液中15種微量元素的基本分布情況，其結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11-12]。因此，該方法可以為進(jìn)一步探索人體血液中基本元素的變化規(guī)律提供必要的參考。