朱冰玉，蔣琪

口腔黏膜下纖維性變（OSF）是一種慢性炎癥疾病，可影響口腔黏膜的任何部位，被認(rèn)為是一種嚴(yán)重的潛在惡性口腔疾病。OSF 病理是以慢性炎癥和萎縮性上皮為特征的病理損害，伴隨結(jié)締組織膠原纖維的異常堆積和血管狹窄或者閉塞為特征[1]。咀嚼檳榔已被認(rèn)為是OSF 發(fā)病的主要病因，檳榔堿作為檳榔的重要成分之一，己經(jīng)被證實(shí)是OSF 發(fā)病的主要病原性因素[2]。OSF 大鼠模型顯示檳榔堿溶液長期局部應(yīng)用導(dǎo)致上皮萎縮，成纖維細(xì)胞的增殖和膠原纖維的堆積，最終導(dǎo)致OSF[3]?？谇火つこ霈F(xiàn)上皮萎縮后，黏膜的保護(hù)性屏障消失，檳榔堿等致癌因子容易滲入變薄的上皮，與上皮下層甚至基底細(xì)胞相互作用，使其發(fā)生惡變。

自噬和細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡（PCD）的兩種形式，許多研究表明它們之間存在復(fù)雜的關(guān)系[4]。最近已有研究表明在檳榔堿處理的人口腔成纖維細(xì)胞中，自噬可通過上調(diào)TGF- 來誘導(dǎo)細(xì)胞膠原分泌增加[5]，但檳榔堿能否誘導(dǎo)OSF 中上皮細(xì)胞的自噬與凋亡目前仍不明了。角質(zhì)形成細(xì)胞是上皮的主要構(gòu)成細(xì)胞，數(shù)量占上皮細(xì)胞的80%以上，因此本研究檢測檳榔堿對人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞（HOKs）中自噬相關(guān)蛋白LC3、P62 和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 表達(dá)差異，以及細(xì)胞凋亡情況，探討檳榔堿誘導(dǎo)HOKs 細(xì)胞自噬和凋亡的影響，并探討其作用，為OSF 上皮組織病變的發(fā)病機(jī)制和治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗細(xì)胞、試劑與儀器 HOKs 購于美國培養(yǎng)物保藏所（American type culture collection,ATCC），檳榔堿（購自美國Abcam 公司）、MTT（美國Sigma 公司）、兔抗人LC3 單克隆抗體和Caspase-3 兔抗鼠多克隆抗體（購自美國CST 公司）、兔抗人P62 單克隆抗體和-actin 鼠抗鼠單克隆抗體（購自美國proteintech 公司）、胎牛血清（購自美國Gibco 公司）、DMEM養(yǎng)基（購自美國HyClone 公司）、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（購自江蘇凱基生物）、BCA protein assay kit（購自美國Thermo Fisher）、細(xì)胞流式細(xì)胞儀（購自美國BD 公司）、SDS-PAGE 垂直電泳儀（購自美國Bio-rad 公司）。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 HOKs 在含有10%FBS、青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將HOKs 接種于培養(yǎng)基輕輕吹打混勻后，放入37 ℃、5%CO2和潮濕的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)，隨時注意細(xì)胞的生長狀況。

1.3 MTT實(shí)驗 將HOKs接種到96 孔培養(yǎng)板中并且每孔大約1×104個細(xì)胞。（1）加入含檳榔堿濃度分別為0、7.5、15、30、60 和120g/ml 的培養(yǎng)基，各組均設(shè)5 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。（2）小心倒掉舊培養(yǎng)液，向每個孔中加入5 mg/ml MTT 和200l DMSO，分別在恒溫箱中培養(yǎng)4 h。（3）記錄490 nm 在酶標(biāo)儀測量的吸光度。

1.4 評估不同時間檳榔堿對HOKs 的影響 實(shí)驗分別用含15g/ml 檳榔堿培養(yǎng)液培養(yǎng)HOKs 至0、3、6、12 和24 h。

1.5 Western blot 檢測LC3、P62 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平 各組HOKs 細(xì)胞用冰浴后的PBS 沖洗細(xì)胞2 次，用RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)SDS-PAGE 電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜和封閉。用TBST 稀釋抗體，分別按照LC3（1∶1000）、Caspase-3（1∶1000）、P62（1∶1 000）和-actin（1∶5 000）配制一抗，孵育1 ～2 h。然后將NC 膜與兔二抗（1∶6 000）和鼠二抗（1∶5 000）一起，室溫孵育90 min。顯色和曝光后通過Quantity one軟件分析蛋白質(zhì)的相對量，并將-actin設(shè)置為對照蛋白。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測HOKs細(xì)胞凋亡 收集處理后的細(xì)胞（每組細(xì)胞數(shù)約1×105個），37 ℃下用離心機(jī)2 000 r/min 離心5 min。向每組樣本中依次加入5l Annexin V-FITC 后，再加入5l PI 充分混合，在黑暗中反應(yīng)15min。滴注200l 的Bindingbuffer，并在1h內(nèi)使用BD FACSCalibur 流式儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析（one-wayANOVA），P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度檳榔堿對HOKs 細(xì)胞活力的影響MTT檢測發(fā)現(xiàn)檳榔堿以劑量依賴性方式抑制HOKs細(xì)胞活力，并且檳榔堿的抑制作用隨著濃度的增加而增加。由于15g/ml 的檳榔堿處理的細(xì)胞顯示出接近50%的抑制，因此該劑量用于進(jìn)一步實(shí)驗，見圖1。

圖1 MTT 法檢測HOKs 細(xì)胞活力

2.2 HOKs自噬相關(guān)蛋白LC3 和P62 的表達(dá) 15g/ml的檳榔堿刺激HOKs，結(jié)果顯示LC3-I 至LC3-II 轉(zhuǎn)化水平隨著時間的增加而上升（均P＜0.05），而P62的表達(dá)隨著時間的增加而下降（P ＜0.05）。 -actin為陽性對照，0 h 為陰性對照，見圖2。

圖2 HOKs 自噬相關(guān)蛋白LC3 和P62 的表達(dá)

2.3 HOKs 凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表達(dá) 用15g /ml 的檳榔堿刺激HOKs，結(jié)果顯示細(xì)胞中Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表達(dá)隨著時間的增加而上升（P ＜0.05），見圖3。

圖3 HOKs 凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表達(dá)

2.4 HOKs 細(xì)胞凋亡率 0 h 組的細(xì)胞凋亡率為（3.64±0.65）%，3 h 組的細(xì)胞凋亡率為（3.98±0.84）%，6 h組的細(xì)胞凋亡率為（4.87±0.96）%，12h 組的細(xì)胞凋亡率為（6.23±1.35）%，24h 組的細(xì)胞凋亡率為（7.65±2.26）%，檳榔堿能夠刺激HOKS 細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且凋亡率隨著時間的增加而上升（P ＜0.05），見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測HOKs 細(xì)胞凋亡率

3 討論

咀嚼檳榔習(xí)性是OSF 的主要病因，而檳榔堿是檳榔中含量最豐富的生物堿，對人口腔上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，能夠增加DNA 鏈斷裂，微核形成，提高基因突變和提高染色體畸變[6]。上皮組織作為口腔黏膜最外層的保護(hù)屏障，受到檳榔的長期刺激，首先引起上皮細(xì)胞的變化，受損的上皮細(xì)胞釋放出多種細(xì)胞因子，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使得成纖維細(xì)胞膠原蛋白分泌增加，膠原降解減少，從而導(dǎo)致纖維化形成。并且固有層膠原纖維堆積，將導(dǎo)致血管閉塞，加重上皮層缺血、缺氧和營養(yǎng)供給障礙，形成惡性循環(huán)[7]。本研究結(jié)果顯示，隨著檳榔堿濃度的增加，HOKs 的細(xì)胞增殖能力逐漸下降，進(jìn)一步證實(shí)檳榔堿對上皮組織的損傷，促進(jìn)了OSF 的發(fā)生發(fā)展。

凋亡，又稱I型程序性細(xì)胞死亡，是機(jī)體清除衰老及異常細(xì)胞來維持組織器官穩(wěn)定的過程[8]。在凋亡過程中，活化的半胱天冬酶（Caspase）能夠切割多種底物，通過一系列的信號傳導(dǎo)途徑最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化[9]。Caspase-3 是其中最關(guān)鍵的蛋白酶，一旦通過外源性（死亡配體）和內(nèi)源性（線粒體）途徑被啟動，凋亡便不可逆轉(zhuǎn)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿刺激HOKs后，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 和cleaved Caspase-3 的表達(dá)及凋亡率均隨著檳榔堿作用時間增加而逐漸上升，說明檳榔堿呈時間依賴性誘導(dǎo)HOKs細(xì)胞凋亡。Chang 等[11]研究也表明，檳榔堿通過阻滯S 期和G2/M 期的細(xì)胞來抑制上皮細(xì)胞的增殖，從而破壞上皮組織的修復(fù)過程。因此，筆者推測上皮細(xì)胞凋亡增加和抑制細(xì)胞增殖可能是上皮萎縮的潛在發(fā)病機(jī)制，而這一過程與檳榔堿的細(xì)胞毒性有關(guān)。

自噬，又稱II型程序性細(xì)胞死亡，是對胞內(nèi)異常大分子物質(zhì)和細(xì)胞器的自我降解和再循環(huán)的過程，因此自噬對于維持真核細(xì)胞中的細(xì)胞代謝和體內(nèi)平衡至關(guān)重要。最近的研究表明，自噬在上皮細(xì)胞的生存和死亡中起著關(guān)鍵作用，并且在纖維化相關(guān)疾病中受到越來越多的關(guān)注[12]。Li 等[13]的研究表明，自噬在OSF中起重要作用，抑制自噬可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的凋亡，同時減少膠原纖維的合成。然而，自噬在OSF 上皮組織中的作用尚不明確。LC3 是形成自噬體必不可少的蛋白，Atg4 內(nèi)肽酶切割LC3 以轉(zhuǎn)變成LC3-I。在哺乳動物中，LC3-I 可以通過與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3-II，始終存在于自噬體的內(nèi)外膜上[14]。P62 也是自噬標(biāo)志性蛋白之一，具有多種細(xì)胞功能，對于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的降解十分重要。P62 蛋白與泛素化的蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬體中作為底物被降解[15]。當(dāng)自噬發(fā)生時，自噬體中的P62 蛋白被降解減少，而自噬受到抑制時P62 逐漸累積增多。因此，本研究選用LC3 和P62 作為反應(yīng)自噬活性的相關(guān)蛋白。Western blot 檢測結(jié)果顯示LC3-II/LC3-I 比率隨著檳榔堿刺激時間的增加而增加，P62 的表達(dá)隨著檳榔堿刺激時間增加而逐漸下降，說明檳榔堿呈時間依賴性誘導(dǎo)HOKs發(fā)生自噬。

自噬和細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)兩個重要的分解代謝過程，有助于維護(hù)細(xì)胞和組織的體內(nèi)平衡。自噬是更新異常大分子物質(zhì)和細(xì)胞器的主要機(jī)制，而細(xì)胞凋亡是將不需要的細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)吞噬，并從生物體中消除的主要機(jī)制。盡管這兩種途徑之間存在顯著差異，但它們在確定細(xì)胞命運(yùn)方面具有高度相關(guān)性，既能夠互相拮抗促進(jìn)細(xì)胞生存，也能夠互相協(xié)同共同促進(jìn)細(xì)胞死亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及凋亡率均與自噬活性的表達(dá)相同，隨著檳榔堿作用時間的增加而上升。著說明自噬和凋亡均與OSF發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可能有協(xié)同作用。筆者推測檳榔堿長時間刺激口腔黏膜，導(dǎo)致更高的細(xì)胞毒性作用于外層上皮細(xì)胞，使得自噬活性升高，促進(jìn)細(xì)胞顯著凋亡。

總之，本研究表明檳榔堿可以誘導(dǎo)HOKs 的細(xì)胞凋亡和自噬，但確切的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。筆者認(rèn)為研究檳榔堿對上皮細(xì)胞的自噬和凋亡對OSF的發(fā)病機(jī)制有重要意義，可以通過抑制自噬和凋亡從而緩解檳榔堿對上皮細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步探討OSF 上皮萎縮的病因和治療提供新的思路。