宋 煜,王雅楠,徐 於,王聿佳,熊 英△

陜西省康復醫(yī)院:1.檢驗科;2.兒科,陜西西安 710065

肺結核(PTB)是由結核分枝桿菌感染人體肺部引起的一種慢性傳染病,病情嚴重時可導致人死亡,是威脅人類生命健康安全的重大公共衛(wèi)生問題之一[1]。相關調查數據顯示,兒童PTB在所有PTB患者中比例為10%,且兒童存在不同于成年人的發(fā)病特點,包括免疫學發(fā)病機制、臨床癥狀及預后轉歸等[2]。由于兒童PTB臨床表現普遍不典型,且目前診斷技術有限,難以實現早期準確診斷,易導致病情延誤,不利于患兒預后[3]。因此,尋找一種新型的標志物進行PTB早期診斷成為亟待解決的難題。微小核糖核酸(miRNA)是近年來發(fā)現的一類非編碼單鏈內源性小分子RNA,主要通過與相關堿基配對來調節(jié)靶基因或(和)調控蛋白表達,進一步參與疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[4]。目前,國內外已有不少關于miRNA和PTB的研究[5-6],但主要集中在成人PTB中,關于兒童PTB和miRNA的關系研究鮮見報道。鑒于此,本研究通過分析PTB兒童外周血單個核細胞(PBMC)miRNA-31、miRNA-146a表達水平,以及上述指標與免疫細胞和炎癥因子的相關性,以期為兒童PTB的診斷和治療提供新的靶點和思路,現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年2月至2022年2月收治的75例PTB患兒作為觀察組,其中男45例,女30例;年齡3～12歲,平均(6.12±1.30)歲。另選取本院同期健康體檢的70例兒童作為對照組,其中男42例,女28例;年齡3～12歲,平均(6.09±1.32)歲。兩組年齡、性別比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。納入標準:(1)觀察組所有患兒均符合《兒童肺結核的臨床診斷標準和治療方案(試行)》[7]中的診斷標準,對照組兒童體檢各項指標和檢查結果均無異常;(2)年齡≤12歲;(3)入組前未接受相關治療;(4)臨床資料完整。排除標準:(1)神志異常;(2)合并重要臟器疾病;(3)伴有重大感染或免疫性疾病。所有研究對象監(jiān)護人均知情本研究,并簽署知情同意書。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2方法 (1)PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平檢測:采用無菌肝素抗凝真空采血管采集所有兒童靜脈血3 mL,以密度梯度離心法分離PBMC。采用Trizol法提取標本總RNA,遵循miRNA反轉錄試劑盒(購自北京Invitrogen公司)獲取cDNA保存至—80℃冰箱中備用,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平。miRNA-31引物序列如下:上游引物為5′-GCCGCAGGCAGATGCTG-3′;下游引物為5′-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3′。miRNA-146a引物序列如下:上游引物為5′-CATGATTGTATGACTGCACTC-3′;下游引物為5′-TCTTGCTAGGACTGACCA-3′。以U6作為miRNA內參,上游引物為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′;下游引物為5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-31、miRNA-146a表達水平。(2)免疫細胞檢測:采用FCM型流式細胞儀(購自常州必達科生物科技有限公司)檢測T淋巴細胞亞群,指標包括CD3+、CD4+、CD8+比例,并計算CD4+/CD8+比值。相關抗體均購自金斯瑞生物科技股份有限公司。(3)炎癥因子檢測:抽取所有受試者空腹靜脈血3 mL,離心半徑8 cm,3 500 r/min離心10 min獲取血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測白細胞介素(IL)-2、IL-6、IL-8水平。所有操作均按照試劑盒說明書進行,試劑盒均購自深圳晶美生物科技有限公司。

1.3觀察指標 比較兩組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平,以及T淋巴細胞亞群、炎癥因子水平;分析PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平與T淋巴細胞亞群、炎癥因子的相關性,評估PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平單獨及聯(lián)合檢測診斷兒童PTB的效能。

2 結 果

2.1兩組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平比較 與對照組比較,觀察組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平比較

2.2兩組T淋巴細胞亞群水平比較 與對照組比較,觀察組CD3+比例、CD4+比例、CD4+/CD8+比值均降低,而CD8+比例升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組T淋巴細胞亞群水平比較

2.3兩組炎癥因子水平比較 與對照組比較,觀察組IL-2、IL-6及IL-8水平均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組炎癥因子水平比較

2.4PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平與T淋巴細胞亞群、炎癥因子水平的相關性分析 Pearson相關分析發(fā)現,PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平與CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均呈負相關(P<0.05),與CD8+比例及IL-2、IL-6、IL-8水平均呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平與T淋巴細胞亞群、炎癥因子的相關性分析

2.5PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平檢測診斷兒童PTB的效能 ROC曲線分析結果顯示,PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平聯(lián)合檢測診斷兒童PTB的曲線下面積(AUC)均大于單項檢測,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5、圖1。

圖1 PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平檢測診斷兒童PTB的ROC曲線

表5 PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平檢測診斷兒童PTB的效能

3 討 論

結核病為常見的慢性傳染病之一,伴隨著病情的日益進展,可累及多個器官,且以PTB最多見,患者往往存在嚴重的肺組織損傷,進而導致肺功能降低,嚴重威脅健康及生命[8-10]。因此,早期實現有效診斷與及時治療PTB是國內外研究的熱點。miRNA不但扮演細胞內基因調控網絡關鍵分子的角色,亦是多種病理狀態(tài)下的重要生物標志物。近年來,已有不少研究報道證實,血液循環(huán)中的多種miRNA均可作為肺癌及肺炎等疾病的生物標志物[11-13]。血清中PBMC或PBMC中的miRNA檢測為疾病診斷、療效評估及個性化治療均提供了操作簡便的無創(chuàng)性檢測手段。因此,本研究通過分析兒童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平,以及上述指標與T淋巴細胞亞群和炎癥因子的相關性,對兒童PTB的診斷價值,旨在為上述兩項指標作為兒童PTB的臨床診斷標志物提供理論依據。

本研究結果表明,觀察組PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平明顯高于對照組,這提示兒童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a均存在異常高表達?？赡苁怯捎趍iRNA-31主要介導Janus激酶/信號與轉錄激活子(JAK/STAT)及絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等多種結核感染有關信號通路,并通過對上述相關信號通路活性的調控,進一步抑制機體的免疫應答,最終引發(fā)結核分枝桿菌的感染[14]。miRNA-146a高表達會提升巨噬細胞對細胞內結核分枝桿菌的滅殺能力,進而抑制該致病菌的生長、繁殖,是機體應對結核分枝桿菌感染時的自然應答[15]。ROC曲線分析結果顯示,PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平聯(lián)合檢測診斷兒童PTB的AUC均高于單項檢測,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示臨床工作中可通過對上述兩項指標表達水平進行聯(lián)合檢測實現對兒童PTB的輔助診斷。此外,與對照組比較,觀察組CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均降低,而CD8+比例升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示結核免疫屬于細胞免疫,主要是由單核巨噬細胞介導的復雜免疫應答過程,而CD3+、CD4+、CD8+比例及CD4+/CD8+比值均是細胞免疫的重要指標。而PTB的發(fā)生會對患兒肺組織產生一定的損傷,進而影響免疫應答,最終導致上述指標的異常表達[16]。另外,與對照組比較,觀察組IL-2、IL-6及IL-8水平均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示IL-2、IL-6及IL-8均是臨床上應用較為廣泛的炎癥因子,在機體出現創(chuàng)傷、感染等狀況時,其在血清中水平急劇升高,可能對兒童PTB具有一定的輔助診斷作用。PTB患兒因肺組織遭受不同程度的損傷,進而導致上述指標出現應激性升高,并參與疾病的進展過程[17]。此外,Pearson相關分析發(fā)現,PTB患兒PBMC miRNA-31、miRNA-146a表達水平與CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值水平均呈負相關(P<0.05),與CD8+、IL-2、IL-6、IL-8水平均呈正相關(P<0.05)。說明miRNA-31、miRNA-146a可能是通過靶向調控MAPK及JAK/STAT等信號通路,從而發(fā)揮炎癥免疫調控作用,進而參與PTB的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述,兒童PTB PBMC miRNA-31、miRNA-146a均存在明顯高表達,且與細胞免疫、炎癥因子均密切相關,可作為輔助診斷PTB的潛在生物學標志物,值得臨床重點關注。