邱宇馳 付伊萌

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是功能性胃腸道疾病,《2020年中國腸易激綜合征專家共識意見》[1](簡稱共識)強(qiáng)調(diào)了精神心理因素是防治腸易激綜合征的一個(gè)關(guān)鍵。重視精神心理是提高治療IBS療效的關(guān)鍵。中醫(yī)的五臟學(xué)說認(rèn)為“心主神”,心神失調(diào),會出現(xiàn)焦慮和抑郁等精神障礙。同時(shí)心神失調(diào)與IBS內(nèi)臟高敏感性密切聯(lián)系。《素問·至真要大論》曰:“諸痛癢瘡,皆屬于心”。心主神明便具有感知和應(yīng)對身體內(nèi)外刺激的能力,心神對疼痛刺激因素的反應(yīng)是形成疼痛的重要條件[2],故IBS的核心病理生理基礎(chǔ)之一內(nèi)臟高敏感性,在焦慮、抑郁等影響下會更加明顯,這與心神失調(diào)引起機(jī)體對疼痛程度的感受異常密切相關(guān)。

目前,針對IBS伴隨的焦慮、抑郁等情緒障礙西醫(yī)治療選用抗抑郁藥物[3],有一定的不良作用。中醫(yī)針灸作為綠色療法,是西醫(yī)治療IBS的重要的替代療法[4]。心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)主要由心房合成分泌,在疾病狀態(tài)下心房容量/壓力增加,刺激ANP釋放,具有調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)和焦慮等情緒狀態(tài)的作用[5]。研究報(bào)道,心理調(diào)適能夠通過改善患者的焦慮抑郁情緒,減少兒茶酚胺的含量、減輕腎素-血管緊張素-醛固酮的作用,進(jìn)而降低患者的B型利鈉尿肽(B-type natriuretic peptide,BNP)水平[6]。因此,筆者選用“調(diào)心神,固腸腑”的標(biāo)本配穴針灸,探究標(biāo)本配穴針灸是否能夠通過調(diào)控ANP、BNP表達(dá),從而改善IBS-D模型大鼠的焦慮、抑郁情緒。

1 材料

1.1 動物與分組SPF級3月齡雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量(300±20)g,隨機(jī)分為4組:對照組、模型組、標(biāo)本配穴組、常規(guī)配穴組,每組10只。購于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號:SCXK(鄂)2017-0012。在武漢體育學(xué)院飼養(yǎng),SPF級環(huán)境條件控制為溫度(22±2)℃、濕度(50±10)%,光照明/暗周期為12 h/12 h[7],適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,期間自由飲食、飲水。動物實(shí)驗(yàn)倫理審核批準(zhǔn)號:NO.00287500。嚴(yán)格遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》[8]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 主要儀器與試劑BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);微量移液器(Eppendorf);垂直電泳槽(北京六一儀器廠,DYCZ-24DN);電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,CPA);水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司,TS-1);磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器廠,T8-1);酶標(biāo)儀(Thermo,mμlISKANMK3);離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司,HI650)。生理鹽水(ASPEN,AS1087)戊巴比妥鈉(Sigma,DS179);一次性針灸針(0.30 mm×13 mm,華佗牌);水銀臺式血壓計(jì)(上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司);Rat ANP ELISA Kit(ELK5450,ELK Biotechnology);Rat BNP ELISA Kit(ELK5457,ELK Biotechnology)。

1.3 模型制備除對照組大鼠外,其他3組以急、慢性應(yīng)激相結(jié)合CAS方法制備IBS-D模型[9]。采取將大鼠暴露于7種不同的壓力源,分別是缺水24 h、食物剝奪24 h、痛苦的夾尾巴1 min、暴露于45 ℃環(huán)境5 min、在4 ℃水中游泳3 min,白天和夜晚倒置12 h/12 h,水平振動(120 r/min)45 min。連續(xù)2 d保證無重復(fù)特定的壓力源,若抓鬮的壓力源重復(fù)則重新抓取,共21 d。1周的休息之后,第28天,采取急性束縛應(yīng)激方法,包裹大鼠的肩部、上肢前肢和胸廓1 h。當(dāng)天測定內(nèi)臟疼痛閾值[10],若模型組大鼠內(nèi)臟疼痛閾值高于對照組(P<0.05),則提示造模成功[11]。

1.4 干預(yù)方法標(biāo)本配穴組、常規(guī)配穴組大鼠在每日造模前,穿上自制合身的鼠衣,參照《實(shí)驗(yàn)動物常用穴位名稱與定位第2部分:大鼠》[12]。標(biāo)本配穴組選取“內(nèi)關(guān)、足三里、關(guān)元”予以針灸干預(yù),常規(guī)配穴組選取“上巨虛、天樞、足三里”予以針灸干預(yù),均使用0.30 mm×13 mm華佗牌毫針直刺,針刺得氣后進(jìn)行手法行針,平補(bǔ)平瀉,頻率120次/min,每隔4 min行針1 min;懸掛并進(jìn)行艾灸,自制艾條長12 cm,直徑7 mm,用支架固定,置于穴位旁 2～3 cm,保證大鼠在平靜的狀態(tài)下,留針及艾灸時(shí)間為15 min,1次/d,共28 d。對照組和模型組不給予任何干預(yù)。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 內(nèi)臟高敏感性測定測定內(nèi)臟高敏感性,即觀察腹壁撤退反射(Abdominal withdrawal reflex, AWR)。在造模前和第28天進(jìn)行檢測,檢測前1 d大鼠禁食不禁水,操作時(shí)一人固定大鼠及暴露肛門,另一人一手手持蘸有液體石蠟的棉簽,另一手順著棉簽的引入,將蘸有液體石蠟的自制氣囊導(dǎo)管從肛門插入直至到標(biāo)記位置(長度為4.5 cm處標(biāo)記),再用醫(yī)用膠帶將導(dǎo)管固定于尾巴根部,然后將大鼠放置操作臺上。待大鼠安靜后,一人用自制血壓計(jì)向氣囊內(nèi)緩慢平穩(wěn)加壓,另一人記錄大鼠腹部抬離地面時(shí)或背部拱起所對應(yīng)的壓力值,每次測量間隔約5 min,每只重復(fù)測量3次取平均值[13]。

1.5.2 大鼠的行為學(xué)觀察糖水偏好實(shí)驗(yàn)觀察:每籠給予200 ml 1%蔗糖水溶液和純化水各1瓶,12 h后對換1次2個(gè)瓶子位置,24 h后測量瓶內(nèi)液體的消耗,糖水偏好率(%)=糖水?dāng)z入(ml)/(糖水?dāng)z入+純水?dāng)z入)(ml)×100%[14]。曠場實(shí)驗(yàn)觀察:第28天通過曠場實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評估。實(shí)驗(yàn)員單獨(dú)在觀察室操作,環(huán)境要保證避光、安靜,采用專業(yè)的曠場箱,底為100 cm×100 cm,其底面為黑色并平均分為16格,攝像頭位于正中央,將大鼠放置曠場箱底部,觀察5 min內(nèi)大鼠的活動情況,并在每次結(jié)束后用酒精進(jìn)行消毒、清洗曠場箱內(nèi)部,以便影響下1只大鼠的自由活動,采用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行錄像記錄。

1.5.3 血清 心臟組織內(nèi)分泌肽檢測2%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)[15]腹腔注射麻醉,剖開胸腔,大鼠腹主動脈采血離心分離血清,-80 ℃低溫冰箱儲存?zhèn)溆?取出心臟組織,用生理鹽水洗凈,并放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。酶?lián)免疫吸附法(ELISA)定量檢測心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)、B型利鈉尿肽(B-type natriuretic peptide,BNP)含量,按試劑盒步驟說明操作。

2 結(jié)果

2.1 大鼠內(nèi)臟疼痛閾值比較在造模前,4組大鼠進(jìn)行內(nèi)臟疼痛閾值測定比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后,模型組大鼠內(nèi)臟疼痛閾值低于對照組(P<0.01),提示造模成功。標(biāo)本配穴組、常規(guī)配穴組大鼠內(nèi)臟疼痛閾值高于模型組(P<0.01)。見圖1。

注:與對照組比較,****P<0.01;與模型組比較,※※※※P<0.01。圖1 大鼠內(nèi)臟疼痛閾值比較

2.2 大鼠糖水偏好率比較模型組大鼠的糖水偏好率明顯高于對照組(P<0.01),標(biāo)本配穴組、常規(guī)配穴組大鼠的糖水偏好率低于模型組(P<0.01)。常規(guī)配穴組與標(biāo)本配穴組大鼠比較糖水偏好率,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 大鼠糖水偏好率比較

2.3 大鼠曠場實(shí)驗(yàn)比較對照組大鼠的運(yùn)動軌跡自由且總路程長,模型組大鼠的運(yùn)動軌跡多在外圍且總路程短;標(biāo)本配穴組大鼠、常規(guī)配穴組大鼠較模型組運(yùn)動軌跡范圍更廣且總路程增加。見圖2。

注:圖2A為對照組大鼠的5 min內(nèi)的行動軌跡路徑;圖2B為模型組大鼠的5 min內(nèi)的行動軌跡路徑;圖2C為標(biāo)本配穴組大鼠的5 min內(nèi)的行動軌跡路徑;圖2D為常規(guī)配穴組大鼠的5 min內(nèi)的行動軌跡路徑。圖2 各組大鼠行動軌跡圖

2.4 大鼠血清 心臟組織ANP BNP含量比較模型組大鼠血清中ANP、BNP含量高于對照組(P<0.01);標(biāo)本配穴組大鼠血清中ANP、BNP含量低于模型組(P<0.01);常規(guī)配穴組大鼠與模型組大鼠比較血清中ANP、BNP含量,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);但標(biāo)本配穴組大鼠與常規(guī)配穴組大鼠比較血清中ANP、BNP含量,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3A。模型組大鼠心臟組織中ANP、BNP含量高于對照組(P<0.05);常規(guī)配穴組大鼠心臟組織中ANP、BNP含量高于標(biāo)本配穴組(P<0.05)。見圖3B。

注:圖3A、B為大鼠血清、心臟ANP、BNP含量變化。與對照組比較,****P<0.01,*P<0.05;與模型組比較,※※※※P<0.01;與標(biāo)本配穴組比較,####P<0.01,#P<0.05。圖3 大鼠血清 心臟ANP BNP含量變化

3 討論

IBS屬于中醫(yī)學(xué)“腸郁”范疇,病因是心神失調(diào),腸腑失司。在中醫(yī)治病求本思想和標(biāo)本理論的指導(dǎo)下,根據(jù)“病位在腸腑,臟腑為本,通調(diào)腸腑;病邪為標(biāo),祛除邪氣,調(diào)養(yǎng)心神”理論,提出以標(biāo)本配穴針灸防治IBS,以固護(hù)腸腑為主,調(diào)理心神為輔,標(biāo)本兼治。標(biāo)本配穴針灸對IBS的治療,是重視心神不寧對腸腑功能的影響。認(rèn)為該病是因心神不安,氣機(jī)失調(diào),導(dǎo)致腸腑失司。取內(nèi)關(guān),可充分發(fā)揮其寧心安神、調(diào)神定志之功效,改善焦慮、抑郁的狀態(tài),減輕心神失調(diào)對腸道的影響。陳慧君[16]探析焦慮癥的針灸臨床治療及選穴特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)對焦慮癥的治療一般是“從腦論治”和“從心論治”。而百會、內(nèi)關(guān)及神門穴治療焦慮癥具有特殊療效,是關(guān)鍵穴位。內(nèi)關(guān)穴在治療焦慮癥中多用補(bǔ)法加灸[16]。研究發(fā)現(xiàn),氟哌噻噸美利曲辛聯(lián)合針刺內(nèi)關(guān)穴能顯著緩解老年冠心病患者PCI術(shù)后焦慮抑郁狀態(tài)[17]。對針灸治療卒中后焦慮癥的取穴規(guī)律進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,發(fā)現(xiàn)經(jīng)脈的選擇以督脈、手少陰心包經(jīng)、手厥陰心經(jīng)為多,而選穴多以百會、內(nèi)關(guān)、神門、印堂[18]。

本研究選用CAS造模方法建立伴有精神障礙的IBS模型大鼠,并依據(jù)中醫(yī)針灸治病求本思想,應(yīng)用標(biāo)本配穴法,選取“關(guān)元、足三里、內(nèi)關(guān)”三穴進(jìn)行腧穴配伍治療,探究IBS與心相關(guān)的情緒心理的變化。模型組大鼠的內(nèi)臟高敏感性高于對照組,為造模成功。標(biāo)本配穴組和常規(guī)配穴組大鼠內(nèi)臟高敏感性均低于模型組,說明標(biāo)本配穴針灸和常規(guī)配穴針灸均能減輕大鼠的腹痛,減輕焦慮、抑郁的程度。抑郁樣行為一般通過糖水偏好實(shí)驗(yàn)觀察,糖水偏好率直接反映大腦的獎(jiǎng)賞反應(yīng)程度,而獎(jiǎng)賞反應(yīng)程度與快感缺失密切相關(guān)。焦慮樣行為通常是通過曠場實(shí)驗(yàn)觀察,反應(yīng)其自由活動度。本實(shí)驗(yàn)中糖水偏好實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果顯示,IBS模型大鼠快感度缺失、自主活動度降低,情緒心理行為異常改變,處于焦慮、抑郁的狀態(tài)。標(biāo)本配穴組和常規(guī)配穴組糖水偏好率均高于模型組大鼠,說明標(biāo)本配穴針灸和常規(guī)配穴針灸均能一定程度地改善大鼠快感度缺失程度,但標(biāo)本配穴組的數(shù)值更趨向于對照組,效果更佳。曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,標(biāo)本配穴組和常規(guī)配穴組大鼠的行為學(xué)均有一定的改善,但標(biāo)本配穴針灸更能改善焦慮狀態(tài),增加其活動自由度。

研究發(fā)現(xiàn),ANP與焦慮障礙的發(fā)病密切相關(guān),是聯(lián)系心臟和焦慮行為的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清、心臟組織ANP含量均增加,一方面說明IBS-D大鼠處于焦慮狀態(tài),另一方面說明IBS-D大鼠在壓力刺激下心臟相關(guān)物質(zhì)產(chǎn)生了變化。也有研究提出,BNP與兒茶酚胺水平中度相關(guān)[20]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清、心臟組織中BNP含量均升高,可能是模型大鼠處于焦慮狀態(tài),刺激了兒茶酚胺的釋放,加強(qiáng)了腎素-血管緊張素-醛固酮的作用,升高了BNP水平。標(biāo)本配穴組大鼠血清中ANP、BNP含量均低于模型組,常規(guī)配穴組大鼠血清中僅BNP含量下降;而在心臟組織中,標(biāo)本配穴組大鼠ANP、BNP含量均下降,常規(guī)配穴組大鼠ANP、BNP含量均上升,說明標(biāo)本配穴針灸更能夠下調(diào)血清和心臟組織ANP含量,改善其焦慮情緒,并能減輕應(yīng)激反應(yīng)程度,減少血清和心臟組織BNP的分泌,而達(dá)到保護(hù)心臟的作用。

綜上,標(biāo)本配穴針灸能夠通過降低血清、心臟ANP、BNP的表達(dá),改善焦慮抑郁情緒,推測標(biāo)本配穴針灸可能通過抑制ANP、BNP活性,從而調(diào)節(jié)IBS-D模型大鼠的焦慮、抑郁情緒。