肖東琴 李文 段可 杜佳恒 向守剛 張波 李忠 馮剛1, 尹一然

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所,四川 南充 637000;2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院骨科,四川 南充 637000; 3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨與關(guān)節(jié)外科·四川省骨科置入器械研發(fā)及應(yīng)用技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,四川 瀘州 646000)

骨科手術(shù)廣泛使用鈦、鉭等金屬制造的永久性植入物,如人工關(guān)節(jié)等,這些植入物需要與周邊骨組織形成長期、牢固的力學(xué)固定才能行使其功能。鈦、鉭等金屬具有生物相容性,新生骨組織可以與這些金屬形成直接接觸(骨整合)而產(chǎn)生生物力學(xué)固定[1-3]。但是,這些金屬形成骨整合的速率和程度仍不理想,因此目前已提出多種表面改性方法以提升其骨整合能力[4-5]。人骨質(zhì)量的70%為磷酸鈣骨礦物,主要為非化學(xué)計(jì)量的羥基磷灰石(Hydroxyapatite, HA)。由于磷酸鈣與人骨的成分相似,因此具有良好的生物相容性,被廣泛用于骨缺損替代材料[6-8]。許多工作已研究使用磷酸鈣涂敷金屬植入物,并發(fā)現(xiàn)其能加快其骨整合[9-10]。目前,等離子噴涂磷酸鈣涂層的人工髖關(guān)節(jié)已廣泛應(yīng)用于臨床,隨訪發(fā)現(xiàn)其術(shù)后早期穩(wěn)定性和后期松動(dòng)率均顯著優(yōu)于無涂層的關(guān)節(jié)[11-12]。但是,由于其技術(shù)特性,等離子噴涂無法應(yīng)用于形狀復(fù)雜的植入物,如多孔髖臼杯等。為解決上述問題,已提出了多種新的磷酸鈣涂層方法,如溶膠-凝膠法,水熱沉積,電化學(xué)沉積等[13-15]。其中,電化學(xué)沉積法具有室溫操作、設(shè)備簡單、適用于多種金屬等特點(diǎn),因此得到了廣泛研究[16-17]。該方法是將金屬植入物浸沒于含有鈣、磷酸根離子的水溶液中,并與一電源負(fù)極相連。當(dāng)電源施加適當(dāng)電壓,負(fù)極(植入物)表面發(fā)生陰極反應(yīng)(如水分子還原產(chǎn)生氫氣和OH-離子),由于陰極反應(yīng),負(fù)極附近pH上升。該pH躍升使各種磷酸鈣相的離子積增加至超過其溶度積,磷酸鈣晶體從溶液中形成并附著在負(fù)極表面形成涂層。電化學(xué)磷酸鈣涂層的髖關(guān)節(jié)已開始進(jìn)入臨床應(yīng)用[18],近期許多研究也探索了利用電化學(xué)方法在可降解鎂合金表面制備磷酸鈣涂層以控制其腐蝕降解速率和提高生物相容性[19-20]。但是,現(xiàn)有磷酸鈣電化學(xué)涂層方法的研究缺乏系統(tǒng)性,如關(guān)鍵技術(shù)條件(濃度、電壓等)多僅依靠經(jīng)驗(yàn)或試差法確定[21]。此外,驅(qū)動(dòng)涂層形成的電極反應(yīng)、磷酸鈣形成-附著機(jī)理等仍未充分理解。這些不足不利于該方法的進(jìn)一步發(fā)展,如科學(xué)確定活性物質(zhì)對涂層摻雜的技術(shù)條件等[22-23]。因此,本文系統(tǒng)研究了磷酸鈣電化學(xué)沉積方法中關(guān)鍵條件的建立,以及涂層形成機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 市售純鈦板(厚度 2 mm)切割成20×20 mm片狀樣品,用碳化硅砂紙打磨至600目后在1%氫氟酸中腐蝕2 min,去離子水中超聲洗滌后干燥備用。圓柱狀多孔鉭樣品(Φ3.15×5 mm)由美國Zimmer-Biomet公司提供。Ca(NO3)2·4H2O、NH4H2PO4、NaOH、NaCl、乙醇、丙酮均為分析純。酸度計(jì)(美國Thermo Orion 410),電化學(xué)工作站(美國Gamry PCI4/300),飽和甘汞電極(SCE,美國Aldrich),掃描電子顯微鏡及配套能譜儀(SEM, 日本Hitachi 3000N),X射線衍射儀(XRD, Cu Kα, 日本Rigaku RotaFlex)。

1.2 方法

1.2.1 滴定法確定磷酸鈣沉淀邊界 通過滴定法確定不同鈣、磷酸根離子濃度下的磷酸鈣沉淀邊界,用于選擇合適的電化學(xué)沉積溶液。用Ca(NO3)2·4H2O、NH4H2PO4配制系列溶液,其中Ca∶P (摩爾比)固定為0.5,Ca2+濃度為2～25 mM。取50 mL上述溶液,用0.1 M NaOH溶液滴定至目視見溶液失去澄清并保持30 s不變(初始沉淀),迅速測量此時(shí)溶液pH值;記錄消耗的NaOH溶液體積,相應(yīng)計(jì)算此時(shí)的Ca2+和磷酸根濃度。每個(gè)條件滴定3次并取平均值。

1.2.2 確定電化學(xué)沉積電位 采用三電極模式下線性掃描伏安法選擇電化學(xué)沉積中合適的電極電位。鈦片固定在實(shí)驗(yàn)室自制的3電極電解池上作為工作電極,對電極為白金箔,飽和甘汞電極為參比電極。所有電極均浸入所選電解液中。用電化學(xué)工作站控制鈦片電極電位從-0.3 V(相對SCE)起始,以20 mV/s速率線性掃描至-1.50 V,記錄通過的電流。

1.2.3 電化學(xué)沉積 將樣品固定在電解池中,浸入通過1.2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)選擇的溶液,用電化學(xué)工作站將其電極電位控制在根據(jù)1.2.2節(jié)實(shí)驗(yàn)選擇的電位,并保持0.5～8 h。結(jié)束后用去離子水反復(fù)沖洗樣品,空氣中干燥。

1.2.4 表征樣品 噴金后用掃描電鏡觀察表面形貌,并用所配的能譜儀分析表面化學(xué)成分。用X射線衍射分析相組成。

2 結(jié)果

2.1 沉淀邊界與電化學(xué)沉積溶液條件 滴定得到的磷酸鈣沉淀邊界曲線見圖1。該邊界pH隨鈣、總磷酸根離子濃度減小而上升,且當(dāng)Ca2+< 5 mM后其斜率快速上升。沉淀邊界將溶液條件劃分為兩個(gè)區(qū)域。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),條件(濃度、pH)位于沉淀邊界曲線上方的溶液立即發(fā)生沉淀。溶液條件位于邊界曲線下方,但pH接近邊界的溶液則在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)生沉淀;如,當(dāng)溶液pH距邊界<0.2時(shí),均在2 h內(nèi)發(fā)生沉淀。當(dāng)溶液pH遠(yuǎn)低于邊界值時(shí)(如,pH距邊界>2.0),溶液在較長時(shí)間內(nèi)(>4周)均無沉淀。合理的電化學(xué)沉積工作溶液條件必須位于沉淀邊界以下以避免自發(fā)沉淀,但也應(yīng)盡量靠近該邊界使陰極電流造成的局部pH上升足以穿越該邊界。觀察發(fā)現(xiàn),鈣、總磷酸根離子濃度范圍內(nèi),當(dāng)溶液pH低于邊界0.7～1.2時(shí),溶液可保持>3 d不發(fā)生沉淀且可以穩(wěn)定形成涂層。因此,本研究在曲線濃度范圍內(nèi)選擇4種溶液條件,其pH均位于邊界以下1.0,分別命名為溶液1至4(表1)。

表1 四種電化學(xué)沉積溶液離子濃度

圖1 磷酸鈣沉淀邊界曲線(Ca∶P摩爾比固定為1∶2)

2.2 伏安曲線與電化學(xué)沉積電位 上述4種溶液中測得的線性伏安曲線均出現(xiàn)共同特征:電流在約-0.5 V處出現(xiàn)階躍,在約-0.9 V處達(dá)到峰值形成平臺(tái),并在-1.2 V處出現(xiàn)劇烈上升(圖2A)。為確定這些陰極電流信號的歸屬,用不含鈣、磷酸鹽的150 mM NaCl溶液中進(jìn)行了線性伏安掃描,所測得的伏安曲線也具有同樣特征,再用150 mM NaOH溶液進(jìn)行伏安掃描并比較,發(fā)現(xiàn)-0.5～-0.9 V的電流階躍消失,而-1.2 V處的電流上升仍存在(圖2B)。

圖2 以鈦片為工作電極在不同溶液中測得的線性伏安曲線

2.3 溶液條件對涂層形貌和結(jié)構(gòu)的影響 在-1.15 V下電化學(xué)沉積>0.5 h后,溶液1至4中均得到均勻覆蓋的涂層。沉積1 h后得到的涂層形貌見圖3。溶液1、2中所得涂層的表面散布一些長100～200 μm,寬50 μm的針狀晶體,為透磷鈣石(CaHPO4·2H2O, DCPD)晶體的典型形貌;DCPD晶體下層是由長度1～2 μm,寬度<1 μm磷酸鈣晶體連接形成的微孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),孔徑1 μm。溶液3中所得涂層無DCPD晶體,由0.5～1 μm 片狀晶體連接為微孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),孔徑0.5 μm。溶液4中所得涂層形貌與之相似,但構(gòu)成晶體和孔徑均僅0.2 μm大小;此外,溶液4所得涂層厚度很薄,其下層的鈦基體的劃痕和腐蝕坑仍清晰可見。上述涂層的X射線衍射譜見圖4。溶液1所得涂層均在11.7°、21.0°、23.4°和29.3°產(chǎn)生強(qiáng)衍射峰,分別為DCPD的(020)、(021)、(040)和(041)晶面。溶液2所得涂層也產(chǎn)生前2個(gè)峰,但未見后2個(gè)峰,其原因與其表面DCPD晶體數(shù)量相對較少(圖3B),無充分?jǐn)?shù)量適合朝向的晶體滿足這些晶面的衍射條件。溶液2所得涂層在26.0°出現(xiàn)1弱峰,對應(yīng)磷酸八鈣(Ca8(HPO4)2·(PO4)4·5H2O, OCP)的(002)晶面衍射。這提示,溶液1、2中所得涂層中(圖3A、B),DCPD晶體下方的微孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由OCP晶體構(gòu)成。溶液3所得涂層無DCPD的峰,但在26.0°出現(xiàn)明顯的衍射峰,證實(shí)其微孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為OCP晶體。溶液4所得涂層厚度過薄,未產(chǎn)生鈦基體之外的衍射峰,因此其相組成尚待進(jìn)一步研究。

圖3 在不同溶液中-1.15 V(相對SCE)下沉積1 h所得涂層的掃描電鏡照片

圖4 溶液1至4中在-1.15 V(相對SCE)下沉積1 h所得涂層的X射線衍射譜

2.4 電化學(xué)沉積電流與機(jī)理 在4種溶液中電化學(xué)沉積過程中鈦片表面通過的電流-時(shí)間曲線見圖5A。各溶液中電流變化均可分為2個(gè)階段:第1階段為0至約300 s,電流迅速下降;第2階段約300 s至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,期間電流基本保持不變。將電流與時(shí)間-1/2作圖發(fā)現(xiàn),二者在0.07～0.5區(qū)間(即2～200 s)呈線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.97(圖5B)。此外,電流曲線上還可觀察到一些較小的電流突升(圖5A)。這些突升的原因尚未完全理解,但可能與多種因素有關(guān),如通過電流情況下溶液的溫度上升,鈦電極表面氧化層在陰極條件下的部分去氧化等。

圖5 不同溶液中-1.15 V下沉積過程中的電流-時(shí)間曲線

2.5 時(shí)間對涂層形貌和結(jié)構(gòu)的影響 時(shí)間也是電化學(xué)沉積的影響因素,在沉積過程中電極表面鈣、磷酸根、氫離子濃度均在變化,因此可能影響涂層的理化性質(zhì)。由于溶液3中涂層晶體物相均一(無DCPD)且生長速率較快(圖3),本實(shí)驗(yàn)選擇在溶液3中制備涂層并研究時(shí)間對涂層形貌、結(jié)構(gòu)的影響。在溶液3中電化學(xué)沉積(-1.15 V)0.5～8 h所得涂層的形貌見圖6。沉積0.5～2 h的涂層均為網(wǎng)狀多孔形貌,但孔壁逐漸增厚增長(圖6A～C)。沉積3 、8 h的涂層的孔壁發(fā)育為葉片狀形貌(圖6D～E)。將8 h樣品彎折后暴露涂層的橫截面,可見涂層厚度15 μm,且組成涂層的晶體從底部到表面逐漸增大(圖6F)。各涂層的XRD譜見圖7。可見OCP的衍射峰(4.8°、9.6°、16.3°)隨時(shí)間增強(qiáng),對應(yīng)涂層厚度增加。由于HA的衍射峰與OCP嚴(yán)重重疊,因此在OCP存在下無法判斷是否存在HA晶體。

圖6 溶液3中在-1.15 V(相對SCE)下沉積不同時(shí)間所得涂層的掃描電鏡照片

圖7 在溶液3中沉積1～8 h所得涂層的X射線衍射譜

2.6 鉭表面電化學(xué)沉積 本文研發(fā)的電化學(xué)沉積方法可推廣至其他骨科植入器械金屬,并易于采用廉價(jià)的兩電極電源。鉭表面的伏安曲線,可見氫離子還原的平臺(tái)電位區(qū)間較鈦更窄(圖8A)。根據(jù)同樣的原理,電化學(xué)沉積電位選取為-1.48 V,該電極電位下工作電極-對電極之間電壓為-2.5 V。在-2.5 V工作電壓下在多孔鉭表面制備的磷酸鈣涂層,可見涂層均勻覆蓋整個(gè)多孔結(jié)構(gòu)(圖8B)。

圖8 以純鉭為電極在溶液3中測得的線性伏安曲線及涂層的掃描電鏡照片

3 討論

電化學(xué)涂層技術(shù)包括電極反應(yīng)驅(qū)動(dòng)局部pH上升,pH上升引起磷酸鈣晶體形成以及新生磷酸鈣晶體與電極的附著形成涂層三個(gè)基本過程。本研究通過滴定和伏安掃描分別研究了前兩個(gè)過程,并建立了根據(jù)機(jī)理確定最佳溶液條件和電極電位的方法。

沉淀邊界曲線描述了在一定鈣、總磷酸根離子濃度溶液中恰產(chǎn)生磷酸鈣沉淀的pH值。根據(jù)結(jié)晶學(xué)原理,該曲線代表溶液中形成磷酸鈣晶體(沉淀)的臨界過飽和度,而非熱力學(xué)溶解度[24]。因此,當(dāng)溶液條件位于曲線下方(低于臨界過飽和度),但接近該曲線,溶液條件仍可能超過磷酸鈣相的熱力學(xué)溶解度,此時(shí)沉淀仍會(huì)形成,但需要不同時(shí)間(誘導(dǎo)期)才可觀察到。在給定鈣、磷酸根濃度下,最佳的溶液pH應(yīng)盡量靠近邊界曲線以提供足夠的結(jié)晶驅(qū)動(dòng)力,但同時(shí)需要足夠遠(yuǎn)離該曲線以避免涂層溶液發(fā)生自發(fā)沉淀。在本研究所用的鈣/磷酸根摩爾比下,pH低于邊界0.7～1.2可保證溶液超過3天不沉淀,因此我們選擇的4種溶液均位于邊界以下1.0。

伏安曲線代表不同電極電位下發(fā)生的界面電極反應(yīng)。4種工作溶液以及NaCl溶液中得到的伏安曲線均具有共同特征:-0.9 V出現(xiàn)電流平臺(tái)、<-1.2 V后電流劇烈上升。這顯示這些陰極電流信號與鈣、磷酸根離子無關(guān),僅來源于水的陰極反應(yīng),即氫離子和未電離水分子的還原:

約-0.5 V: H++e →1/2 H2

(Eq.1)

<-1.2 V: H2O+e→1/2 H2+OH-

(Eq.2)。

NaOH溶液與溶液1至4相比,主要差別在于氫離子濃度極低,因此其伏安曲線的差異證實(shí),-0.5 ～-0.9 V出現(xiàn)的電流階躍屬于氫離子的還原反應(yīng)(Eq. 1)。而約-1.2 V起始的劇烈電流上升則歸屬于未電離水分子的還原(Eq. 2)。根據(jù)熱力學(xué),二者的電極電位相等。但考慮到動(dòng)力學(xué)因素,由于前者本身具有電荷,因此在電極表面雙電層作用下較后者更易于接受電子形成H原子,相應(yīng)其出現(xiàn)電流階躍的電位較后者更高。

溶液1至4及NaCl溶液中氫離子的還原電流均在約-0.9 V出現(xiàn)平臺(tái),表明在電極電位達(dá)到一定值后該反應(yīng)受擴(kuò)散控制。隨著電極電位向負(fù)電位方向掃描,電極界面電位差決定的電流強(qiáng)度項(xiàng)呈指數(shù)增加(Butler-Volmer方程)[25],而電極表面可還原的氫離子濃度卻被不斷消耗下降。當(dāng)電位達(dá)到一定值時(shí),電極表面的氫離子濃度小于Butler-Volmer方程給出的電流所對應(yīng)的濃度時(shí),電極表面實(shí)際通過的電流由氫離子向電極表面的擴(kuò)散速率決定,電流不再增長,伏安曲線相應(yīng)出現(xiàn)平臺(tái)[26]。相反,-1.2 V處的強(qiáng)烈電流上升在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)不形成平臺(tái),這是由于水溶液中水分子的濃度不可能出現(xiàn)擴(kuò)散控制。但是,在電位<1.2 V后,電極表面出現(xiàn)大量氣泡,氣泡對于電極有覆蓋作用,因此部分伏安曲線出現(xiàn)一定波動(dòng),如溶液3。

合理的電化學(xué)沉積電位應(yīng)滿足兩重要求:①應(yīng)產(chǎn)生足夠高的電流密度,以驅(qū)動(dòng)電極表面局部pH上升并穿過沉淀邊界,引發(fā)磷酸鈣沉積。②電位產(chǎn)生的電流密度應(yīng)盡可能低,以減小電極表面氫氣泡的產(chǎn)生,避免干擾磷酸鈣晶體與電極的附著。由于這兩個(gè)相反的要求,-1.0～-1.2 V為合理的電化學(xué)沉積電位區(qū)間,其原因如下:①在該區(qū)間,氫離子還原電流處于平臺(tái)區(qū),在擴(kuò)散控制下,表面氫離子濃度大幅降低,即pH顯著上升。②該區(qū)間的上限接近未電離水分子發(fā)生分解還原的“閾值”約-1.2 V,因此電位微小波動(dòng)對電流的影響仍較小。因此,本研究選擇-1.15 V為電化學(xué)沉積的工作電位。

電化學(xué)沉積過程中,電流在前300 s內(nèi)迅速下降至接近穩(wěn)定,且從4～200 s期間電流與時(shí)間-1/2呈線性關(guān)系。這反映沉積過程中兩個(gè)電極反應(yīng)的不同貢獻(xiàn)。在所選擇的電位-1.15 V下,主要發(fā)生氫離子還原和水分子還原兩個(gè)反應(yīng)(Eq. 1、2)。電流與時(shí)間-1/2的線性關(guān)系符合Cottrel方程描述的恒電位和擴(kuò)散控制條件下的電流變化規(guī)律,即沉積開始后,電極表面的氫離子濃度迅速降低,約4 s后進(jìn)入擴(kuò)散控制(電極表面氫離子濃度遠(yuǎn)小于溶液本體氫離子濃度)[27]。此時(shí),電極表面的一薄層(稱為氫離子的“耗盡層”)內(nèi)溶液pH顯著上升,磷酸鈣在該層內(nèi)發(fā)生結(jié)晶、并附著在鈦電極表面。該“耗盡層”的厚度隨著時(shí)間不斷增加,氫離子從溶液本體擴(kuò)散到電極表面所需的距離也持續(xù)增加。因此,氫離子擴(kuò)散到電極表面的流量持續(xù)下降,氫離子還原電流也就不斷下降(第1階段)。在此期間,未電離水分子也發(fā)生還原(Eq. 2),但其貢獻(xiàn)的電流小于氫離子還原電流。到約200 s,氫離子還原電流開始與水分子還原電流相當(dāng),并隨時(shí)間進(jìn)行而變得小于后者。此時(shí),電流變化進(jìn)入第2階段,電流基本來自水分子還原,而氫離子還原的電流可以忽略;由于溶液中水分子固定在濃度,電流基本維持恒定。因此,本研究中的電化學(xué)沉積過程可簡要總結(jié)為初始200 s電極表面主要發(fā)生氫離子還原,其電流為引發(fā)磷酸鈣結(jié)晶提供了所需的pH上升和過飽和度;未電離水分子的還原為后期涂層生長提供了持續(xù)的驅(qū)動(dòng)力。

OCP被認(rèn)為是人骨礦化過程早期的骨礦物,且是具有良好骨生物活性的生物陶瓷[28]。本研究工作條件范圍內(nèi)均形成OCP晶體,而未得到純的HA涂層,其原因可以從沉淀邊界解釋。溶液1至4對應(yīng)的沉淀邊界pH為5.6～7.1,在此范圍內(nèi)磷酸根主要以HPO42-形式存在,PO43-和OH-濃度均很低,因此HA的晶體生長速率被抑制。這一結(jié)果和其他研究中報(bào)道,在接近中性條件下OCP快速生長一致[29]。此外,沉淀邊界曲線預(yù)測,如果需要通過電化學(xué)沉積制備HA涂層,則邊界pH必須上升,因此工作溶液的濃度需要向低濃度方向移動(dòng)。而邊界曲線顯示,當(dāng)鈣、總磷酸根濃度低于溶液4后,曲線的斜率隨濃度下降急劇上升,工作溶液濃度發(fā)生微小下降(如電極表面涂層生長對應(yīng)的離子消耗)會(huì)引起沉淀邊界pH的較大上升,使得溶液條件遠(yuǎn)離沉淀?xiàng)l件。因此,低濃度的工作溶液在技術(shù)上不穩(wěn)定,沉積速率也必然很低,這是室溫下電化學(xué)沉積HA涂層面臨的固有缺點(diǎn),非室溫下是否能克服這些問題尚有待研究。

本研究仍存在一些局限:①由于欠缺表征手段,未研究新生磷酸鈣晶體的形成位置,及其與電極的附著機(jī)理。②溶液4中制備的涂層過薄,未能用XRD確定其物相。③由于HA和OCP的XRD譜高度接近,溶液1至3中制備的涂層是否含有HA相無法確定。這需要開展進(jìn)一步研究減小這些局限。此外,還要結(jié)合機(jī)理認(rèn)識探索磷酸鈣與生物活性物質(zhì)的共沉積技術(shù)。

4 結(jié)論

將pH控制在沉淀邊界以下(～1.0),電極電位選擇在氫離子還原的擴(kuò)散控制區(qū),可得到均勻的磷酸八鈣為主要相的涂層。氫離子還原為涂層沉積提供了初始過飽和度,水分子還原為涂層生長提供持續(xù)的驅(qū)動(dòng)力。本文報(bào)道的方法也成功推廣至鉭金屬,可望應(yīng)用于各種骨科金屬植入表面制備均勻的磷酸鈣涂層以增進(jìn)其與骨組織的整合。