程妍 張守偉 李宜國

(1日照市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科,山東 日照 276800;2日照華方中醫(yī)?？漆t(yī)院內(nèi)分泌科;3日照市東港區(qū)三莊鎮(zhèn)衛(wèi)生院內(nèi)科)

糖尿病的患病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升的趨勢〔1〕。糖尿病骨質(zhì)疏松(DOP)是一種全身性、代謝性骨病,其骨組織中單位體積內(nèi)的骨量逐漸減少、導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)改變,從而引起骨強度逐漸降低、并使得骨脆性增加,容易引起糖尿病骨骼系統(tǒng)的并發(fā)癥,最終導(dǎo)致骨折的發(fā)生〔2,3〕。研究表明〔4〕,糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險高于非糖尿病患者,DOP發(fā)病與糖尿病患者年齡及病程直接相關(guān),其發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。黃精多糖(PSP)是中藥黃精的主要功能成分,具有抗氧化、抗炎、降低血糖血脂及抗衰老等藥理作用〔5,6〕。研究發(fā)現(xiàn)PSP能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨分化,并可抑制骨質(zhì)疏松大鼠模型的骨吸收、改善骨流失,起到防治骨質(zhì)疏松的作用〔7,8〕。此外,PSP還具有降低骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨鈣素(BGP)、抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)、白細(xì)胞介素(IL)-1和IL-6的陽性表達(dá)活性,降低成骨細(xì)胞凋亡率,抑制破骨細(xì)胞活性,促進(jìn)骨折愈合的作用〔9,10〕。本研究通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立DOP大鼠模型,并結(jié)合骨保護(hù)素(OPG)/核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)信號通路蛋白表達(dá),探究PSP對DOP大鼠骨代謝的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及實驗條件 選取2月齡SPF級雄性Wistar大鼠50只,平均體質(zhì)量(200±20)g,均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,動物質(zhì)量合格證號:SCXK桂2014-0002。所有動物在本院飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度控制在21～25 ℃,相對濕度為50%～60%,自然光照明,自由進(jìn)食進(jìn)水,保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔,適應(yīng)性飼喂1 w后進(jìn)行實驗分組和造模。

1.2實驗藥物與試劑 STZ購自美國Sigma公司,純度98%的PSP(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司),戊巴比妥鈉(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司),青霉素G(北京索寶來生物技術(shù)有限公司),血清磷(P)、鈣(Ca)、堿性磷酸酶(ALP)、尿Ca、P、肌酐(Cre)檢測試劑盒(寧波亞太試劑公司),骨鈣素(OC)、脫氧嘧啶啉(DPD)、TRAP、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司),OPG、RANKL及β-actin抗體及辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(美國Abcam生物公司)。

1.3實驗儀器 高速低溫離心機(MICROMAXRF,美國Thermo IEC公司),電泳儀(德國Biometro公司),HITACHI全自動生化分析儀(日本日立公司),RF-5301PC熒光分光光度計(日本島津),凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Alpha公司),雙能X線吸收骨密度(BMD)儀(美國GELUNAR公司)。

1.4實驗方法

1.4.1BMD大鼠模型建立 50只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機抽取10只大鼠作為對照組,其余大鼠禁食12 h 后,腹腔注射STZ 30 mg/kg(STZ溶解于0.1 mmol/L,pH4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中),對照組腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。注射后大鼠饑餓3 h,給予3%葡萄糖溶液預(yù)防大鼠低血糖,分別于3、7 d后測量大鼠血糖,隨機血糖含量≥16.7 mmol/L的大鼠為達(dá)到2型糖尿病造模標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病大鼠造模成功后與正常對照組大鼠繼續(xù)正常飼喂20 w,采用雙能X線BMD測量儀對正常對照組及糖尿病造模成功大鼠股骨BMD進(jìn)行測定。取BMD小于正常對照組大鼠平均BMD 2.5個標(biāo)準(zhǔn)差的作為DOP模型大鼠。

1.4.2實驗分組及給藥方法 將造模成功大鼠隨機分為DOP模型組和高、中、低劑量PSP干預(yù)(H-PSP、M-PSP、L-PSP)組各10只。對照組和模型組大鼠采用0.9%氯化鈉灌胃,10 ml/(kg·d),H-PSP、M-PSP、L-PSP組PSP灌胃量分別為700、400、200 mg/(kg·d),每周稱重并根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整灌胃量。

1.5指標(biāo)檢測

1.5.1股骨BMD檢測 給藥8 w后,3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,采用雙能X線BMD儀掃描各組大鼠左側(cè)股骨。

1.5.2骨代謝指標(biāo)檢測 給藥8 w后,毛細(xì)玻璃管進(jìn)行眼底靜脈叢取血,靜置2 h后高速冷凍離心機離心(3 000 r/mim,15 min)獲得血清,-20 ℃保存?zhèn)溆?。大鼠禁?4 h收集尿液,離心(3 000 r/mim,10 min)獲得大鼠尿液上清液。采用ELISA測定血清中OC、TRAP及尿液中DPD含量。血清ALP、Ca、P及尿Ca、P和Cre含量采用全自動生化儀檢測。

1.5.3大鼠股骨組織學(xué)檢測 深度麻醉后處死大鼠,取下各組右側(cè)股骨組織,用10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣3 w后,4%甲醛化學(xué)固定48 h,分級乙醇脫水,二甲苯清洗,60 ℃石蠟熔融浸泡過夜,包埋于蠟塊內(nèi),4 μm切片,采用蘇木素-伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察大鼠股骨組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5.4Western印跡檢測DOP大鼠股骨OPG、RANKL蛋白表達(dá) 給藥8 w后,將各組大鼠深度麻醉后處死,取下左側(cè)股骨,剔除附著在脛骨兩端和骨干上的肌肉和結(jié)締組織,液氮冷凍30 min后將股骨研磨成粉末。將大鼠股骨粉末中加入蛋白裂解液,高速冷凍離心(12 000 r/min,15 min)收集上清液獲取脛骨蛋白,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,加入OPG、RANKL及β-actin一抗室溫孵育1 h,隨即加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,加入NCIP/NBT顯色,采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗,繪圖采用Graphpad Prism5.0。

2 結(jié) 果

2.1PSP對DOP大鼠體質(zhì)量的影響 各組造模前體質(zhì)量無顯著差異(P>0.05),造模后,DOP模型組及不同劑量PSP組體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)。給藥4～8 w后,H-PSP、M-PSP組體質(zhì)量均較DOP模型組明顯降低(P<0.01,P<0.05),見表1。

2.2PSP對DOP大鼠BMD的影響 給藥8 w后,與對照組相比,DOP模型組全身BMD顯著降低(P<0.01),PSP各給藥組全身BMD均較DOP模型組明顯增加,并隨PSP藥物濃度的增加而增加,其中H-PSP、M-PSP組BMD較DOP模型組顯著增加(P<0.01,P<0.05),見表2。

表2 PSP對DOP大鼠BMD、骨代謝生化指標(biāo)的影響

2.3PSP對DOP大鼠骨代謝生化指標(biāo)的影響 給藥8 w后,與對照組相比,DOP模型組血清ALP、OC、TRAP、Ca和P含量顯著升高(P<0.05)。不同PSP劑量組骨代謝生化指標(biāo)變化不同,各組血清Ca、OC含量均較DOP模型組顯著降低(P<0.05),H-PSP組血清ALP、TRAP和P含量均較DOP模型組顯著降低(P<0.05),M-PSP組、TRAP、P含量較DOP模型組顯著降低(P>0.05),見表2。

2.4PSP對DOP大鼠尿Ca、P及DPD/Cre水平的影響 與對照組相比,DOP模型組尿Ca/Cre、P/Cre及DPD/Cre水平顯著升高(P<0.05);與DOP模型組比較,PSP給藥組尿Ca/Cre、P/Cre及DPD/Cre水平均顯著降低(P<0.05),見表3。

表3 PSP對DOP大鼠Ca、P、DPD/Cre水平及PANKL、OPG蛋白表達(dá)的影響

2.5PSP對OPG/RANKL信號通路蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較,DOP模型組股骨組織中RANKL蛋白表達(dá)水平顯著升高,而OPG蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。PSP給藥處理后,PSP各組股骨組織中RANKL蛋白表達(dá)水平均較DOP模型組顯著降低(P<0.05);H-PSP、M-PSP組股骨組織OPG蛋白表達(dá)水平較DOP模型組明顯升高(P<0.05),見表3、圖1。

圖1 Western印跡檢測各組股骨組織RANKL、OPG蛋白表達(dá)

2.6PSP對DOP大鼠病理學(xué)形態(tài)改變的影響 給藥8 w后,骨切片鏡檢結(jié)果顯示,對照組骨小梁完整,排列整齊、致密,膠原纖維排列整齊。與對照組比較,DOP模型組骨松質(zhì)部分骨小梁數(shù)量明顯減少,骨組織內(nèi)存在大量間隙;與DOP模型組比較,PSP組骨小梁數(shù)量增加,排列較規(guī)則、緊湊、飽滿,PSP處理劑量越高,骨小梁的排列、連續(xù)性和完整性越好,見圖2。

圖2 各組股骨病理學(xué)形態(tài)(HE染色,×400)

3 討 論

糖尿病是由遺傳易感因素、免疫功能紊亂、精神因素等多種致病因子共同作用于機體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)紊亂的一種代謝綜合征,主要特點為胰島素絕對或相對不足。骨質(zhì)疏松是由多種原因引起的一種以單位體積內(nèi)骨量減少為特點的額骨代謝障礙性疾病,常以骨折為首發(fā)癥狀。Albright等〔11〕于1941年首次報道了糖代謝與骨代謝之間的關(guān)系,證明血糖長期未得到控制的患者容易發(fā)生骨質(zhì)疏松。目前1型糖尿病(T1DM)導(dǎo)致骨量減少已得到證實,而2型糖尿病(T2DM)對骨量及BMD的影響尚無明確定論,國內(nèi)外對T2DM患者骨代謝的研究得出了BMD正常、增加或降低的結(jié)論〔12～14〕,但T2DM患者骨折發(fā)生率明顯增加已得到證實,其骨質(zhì)疏松發(fā)病率為20%～60%〔15〕。還有研究表明,T2DM患者中女性患者患骨質(zhì)疏松的概率明顯高于男性,這與女性絕經(jīng)后雌激素水平下降明顯有關(guān)〔4,6〕。T2DM在中老年群體中發(fā)病率較高,骨質(zhì)疏松為其慢性并發(fā)癥,二者并發(fā)將加速、加重骨質(zhì)疏松的發(fā)生,其導(dǎo)致的病理性骨質(zhì),嚴(yán)重影響糖尿病患者的治療和預(yù)后,影響患者的生存質(zhì)量。

本研究表明,PSP可使骨重建閾值降低,骨吸收與骨形成激活比率降低,同時骨形成大于骨吸收過程,骨丟失減少。BMD是臨床診斷骨質(zhì)疏松的基本依據(jù)之一,本實驗結(jié)果提示糖尿病骨質(zhì)疏松造模成功。表明PSP能降低DOP大鼠高骨轉(zhuǎn)換率,減少骨量丟失,增加大鼠骨量和BMD,達(dá)到治療。

骨Ca和P是骨礦化的基本物質(zhì)、是評價骨礦代謝重要的生化指標(biāo),骨質(zhì)疏松患者普遍表現(xiàn)為骨Ca和骨P含量降低,血清Ca和P含量增加。ALP是反映骨形成的生化指標(biāo),DOP大鼠模型中,成骨細(xì)胞分泌的ALP增加。OC是由成骨細(xì)胞合成的成熟骨基質(zhì)蛋白,參與骨礦化過程。TRAP為骨吸收標(biāo)志性敏感物,是破骨細(xì)胞的標(biāo)注酶。PSP可降低去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清Ca和P含量,通過增加骨對Ca和P的吸收或減少骨礦溶解過程〔6〕。本研究結(jié)果提示DOP模型大鼠骨轉(zhuǎn)換率升高、骨吸收增強。表明PSP可對抗DOP大鼠的高骨轉(zhuǎn)換和溶解過程,降低高骨代謝,降低骨轉(zhuǎn)換率。

目前的研究普遍認(rèn)為,OPG/RANKL/RANK信號通路是破骨細(xì)胞激活和分化的主要信號通路〔16〕。OPG廣泛分布于人骨髓、心、肝、脾、肺、腎等器官中,成骨細(xì)胞或骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌OPG和RANKL競爭破骨細(xì)胞或破骨前體細(xì)胞上RANK受體,抑制破骨細(xì)胞分化和降低骨吸收〔17〕,OPG和RANKL蛋白表達(dá)的比例在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用〔18〕。嚴(yán)芳娜等〔6〕研究表明,PSP可提高OPG和降低RANKL蛋白表達(dá),抑制破骨細(xì)胞活化。何基琛等〔18〕研究發(fā)現(xiàn),PSP能抑制小鼠骨髓巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化成熟。本研究結(jié)果提示,PSP可通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL信號通路從而起到抑制破骨細(xì)胞的作用。