劉前程 劉鑫 楊端云 吳敏華 鄧湘雨 鐘文露 孟立鋒,2

(1廣西中醫(yī)藥大學,廣西 南寧 530023;2廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科)

腹膜透析(PD)是終末期腎臟病患者重要的腎臟替代治療方法之一,全球透析人口中有11%在PD〔1〕。與血透相比,PD成本更低,更有利于殘余腎功能的保護,但是PD并不能完全替代人體正常腎臟功能,患者進行PD的1～4年內(nèi)仍有3%～36%的患者出現(xiàn)腹膜損傷、腹膜纖維化(PF)致腹膜超濾功能衰竭,患者不得不退出PD。PF的始動環(huán)節(jié)是腹膜間皮細胞(PMC)損傷。因此,針對性干預PMC損傷是防治PF的重要靶點,開發(fā)保護PMC損傷的技術(shù)或藥物成為研究的重要課題。

線粒體損傷、功能障礙可以引起細胞供能障礙,最終導致細胞死亡。線粒體自噬可以清除損傷、功能障礙的線粒體,從而維持機體細胞的存活。線粒體損傷、功能障礙是引起自噬發(fā)生的主要原因之一。有報道指出,高糖腹膜透析液(PDS)能抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ及抗氧化物酶活性,進而導致PMC層通透性增高,引起PMC損傷〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)PINK1/Parkin通路調(diào)控線粒體自噬,對于線粒體的數(shù)量控制、質(zhì)量控制及正常功能的維持起到重要作用〔3〕。針對性干預PINK1/Parkin通路調(diào)控線粒體自噬可能是防治PMC發(fā)生的重要靶點。

PD尿毒癥患者的全身微炎癥、氧化應激狀態(tài)、反復發(fā)作的腹膜炎癥等是導致患者腹膜損傷的重要原因,目前臨床尚缺乏有效的防治措施。脾氣虧虛是PD相關(guān)腹膜早期病變的主要病機,而PMC損傷又是PF的起始環(huán)節(jié),脾胃是人體氣血生化之源,線粒體是細胞的動力工廠。在中醫(yī)藥理論指導下,結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學對PMC損傷的機制認識,從脾胃著手干預PMC線粒體功能障礙防治PDS誘導的PMC損傷,體現(xiàn)了中醫(yī)病證結(jié)合的辨治特色。研究表明〔4〕,具有健脾益氣功效的中藥單體如黃芪甲苷、葛根素等可能具有干預細胞線粒體損傷、功能障礙,進而防治PMC損傷、PF的作用。在目前尚未開發(fā)出有效保護腹膜結(jié)構(gòu)和功能藥物(包括新型透析液)的情況下,積極探索中醫(yī)藥防治PF、保護腹膜功能的有效干預方法及可能作用機制,對于預防治療PF、延長PD患者的腹透時間、提高其生存率具有重要的科學意義和社會意義。

1 PMC損傷是PF的始動因素

研究表明〔5〕,保持腹膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能的有效性,尿毒癥患者才能夠長期、有效地進行PD。而PMC是機體腹膜的主要組成部分,保護PMC不受非生理相容性腹透液、炎癥反應、氧化應激損傷,有助于維持腹膜正常結(jié)構(gòu)和功能。然而,長期PD過程中,腹膜長時間與高糖、高滲、低酸堿(pH)值等非生理相容的PDS接觸及反復發(fā)生的腹膜炎和腹腔積血等均可引起腹膜慢性炎癥及損傷,這些因素均會對腹腔的局部防御功能及腹膜的細胞成分造成損害,導致PMC出現(xiàn)間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)、新生血管形成等病理表現(xiàn),從而引起腹膜結(jié)構(gòu)和功能的變化,促進了PF的形成,最終導致腹膜超濾功能衰竭〔6〕。因此,PMC損傷是PF的始動因素,針對PMC損傷這個起始環(huán)節(jié)進行防治PF的研究,體現(xiàn)了中醫(yī)學既病防變的理念〔7〕。

高濃度葡萄糖PDS破壞了PMC結(jié)構(gòu),是導致PF的重要因素。盡管新型PDS不斷涌現(xiàn),但是基于葡萄糖的傳統(tǒng)透析液仍然是絕大多數(shù)PD患者的首選,在含糖腹透液的長期作用下,PMC脫落、缺失,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等基質(zhì)降解酶的產(chǎn)生減少,MMPs及其抑制劑平衡被破壞,抑制細胞外基質(zhì)的降解;同時增加纖維連接蛋白、活化蛋白的表達,促進PF〔8〕。有研究報道,高糖PDS對腹膜組織毒性作用早期體現(xiàn)在誘導細胞氧化損傷和線粒體功能障礙〔9〕。首先,高糖PDS能夠誘導PMC內(nèi)細胞活性氧(ROS)生成引起腹膜組織氧化應激損傷〔9〕。其次,生成的ROS促進了巨噬細胞極化,加重PMC損傷〔10〕,最終誘導腹膜炎癥反應、PMC發(fā)生EMT〔11〕。

2 線粒體功能障礙是高糖PDS誘導PMC損傷的主要機制

線粒體功能障礙可表現(xiàn)為三磷酸腺苷(ATP)合成減少、ROS生成增加、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放等,是介導細胞凋亡、壞死的重要因素〔12〕。研究表明,線粒體功能障礙通過損傷足細胞、腎小管上皮細胞及內(nèi)皮細胞介導腎臟疾病〔13〕。此外,報道指出線粒體功能障礙在神經(jīng)退行性變、糖尿病等疾病過程中也具有重要作用〔14～16〕。

首先,線粒體功能障礙是PMC損傷的早期事件,可直接介導PMC凋亡。研究表明,在高糖PDS及其反應產(chǎn)物反復刺激下,PMC的ROS生成增多,清除相對不足,從而導致了細胞線粒體功能障礙、氧化應激和PMC凋亡,加速了PD尿毒癥患者的腹膜損傷、通透性改變的進程,最終導致腹膜超濾衰竭〔17,18〕。機體清除ROS、維持線粒體動態(tài)和能量代謝平衡、保護細胞存活的主要途徑為線粒體自噬。研究表明,高糖PDS可導致PMC線粒體損傷,進而導致線粒體自噬受阻,ROS積累越來越多,最終導致細胞凋亡壞死〔19〕。其次,高糖PDS還可能通過抑制過氧化物酶體增殖活化γ輔助活化因子(PGC)-1α蛋白的表達,抑制線粒體呼吸鏈活性及抗氧化物酶活性,促進ROS積聚,誘導細胞凋亡〔2〕。此外,PMC在高糖PDS長期作用下炎癥因子分泌增多,導致細胞長期處于慢性微炎癥狀態(tài),從而啟動新生血管的形成及PF過程〔20〕。最后,高糖PDS還可持續(xù)激活PMC核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRP)3-白細胞介素(IL)-1β,實時啟動線粒體自噬可能干預NLRP3-IL-1β持續(xù)激活,這可能成為延緩PD腹腔慢性炎癥及PF的治療靶點〔21〕。

綜上,高糖PDS造成腹膜線粒體損傷、功能障礙是PMC損傷的主要機制。線粒體自噬可清除受損的線粒體,緩解線粒體功能障礙,進而防治PMC損傷。因此,研究線粒體損傷、功能障礙在PF發(fā)生、發(fā)展中的具體作用,可以為闡明PF的發(fā)病機制及其臨床防治提供新思路。

3 PINK1/Parkin途徑依賴的線粒體自噬是防治PMC損傷的重要靶點

線粒體自噬在機體維持線粒體穩(wěn)態(tài)及功能中起到主要作用。線粒體損傷后,通過調(diào)節(jié)自噬小體特異性吞噬、降解和清除受損的線粒體,在維持線粒體功能和細胞存活中起到重要作用。適度水平的線粒體自噬有利于維持能量供應及細胞功能,對于細胞的新陳代謝及細胞凋亡等過程具有重要作用。然而,過度的線粒體自噬加重線粒體功能障礙,導致細胞死亡。

線粒體自噬的機制主要有Parkin依賴性及Parkin非依賴性,包括Parkin與PINK1介導的、線粒體自噬受體蛋白(FUNDC1)參與的缺氧介導的及腺病毒E1B相互作用蛋白(Bnip)3/Nip樣蛋白(Nix)介導的〔22〕。研究表明,Parkin依賴性的PINK1、Parkin及泛素協(xié)同在線粒體正常功能的維持、自噬的調(diào)控中起到主導作用〔3,23〕。PINK1被認為是線粒體損傷的主要探測器,Parkin被認為線粒體自噬信號的“增強子”,起到放大信號等重要作用〔24〕。生理狀態(tài)下,PINK1及Parkin都維持穩(wěn)定的低水平狀態(tài)。當線粒體受損時,負責降解PINK1的蛋白水解酶被抑制,PINK1在受損線粒體外膜聚集并誘導Parkin轉(zhuǎn)位到受損線粒體〔25〕。與此同時,Parkin的構(gòu)象發(fā)生變化,其E3泛素酶被激活,從而線粒體基質(zhì)蛋白泛素化,泛素化的自噬受體蛋白P62在去極化的線粒體基質(zhì)上積累,進而與微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈(LC)3結(jié)合,介導泛素化的底物進入自噬體,募集受損線粒體到溶酶體上,從而介導線粒體自噬的發(fā)生。PINK1/Parkin信號通路蛋白PINK1和Parkin是調(diào)節(jié)線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白,其表達水平的高低可以反映線粒體自噬水平的高低。

細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、運動和死亡等多種細胞程序進程都有線粒體自噬的參與。因此,明確PMC線粒體功能變化與自噬的關(guān)系及線粒體自噬相關(guān)分子機制,將成為高糖PDS誘導PMC損傷的突破口。有研究表明,PMC能抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅲ活性,進而導致PMC層通透性增高,引起PMC損傷〔2〕。新的研究表明PINK1/Parkin通路介導的線粒體自噬可緩解高血壓腦出血后腦損傷程度〔26〕。因此推測PINK1/Parkin通路介導的線粒體自噬可能是高糖PDS誘導PMC損傷發(fā)生的主要機制。調(diào)控PINK1/Parkin通路影響PMC線粒體功能及其介導的自噬活性,激活其適應性保護機制,可能是保護PMC損傷、防治PF的新靶點。

4 PMC線粒體功能障礙及其誘導的線粒體自噬與中醫(yī)脾氣虧虛密切相關(guān)

PD利用腹膜的屏障作用作為半透膜,PD能長期而有效地進行,很大程度上取決于腹膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能的有效性,但腹膜過度使用也會導致PMC結(jié)構(gòu)和功能損傷?！端貑枴嵴摗分刑岢觥捌⒅鞔蟾埂?明確指出腹膜的結(jié)構(gòu)和功能與脾臟功能強弱有密切關(guān)系〔5〕。

4.1中醫(yī)脾-線粒體密切相關(guān) 宏觀上,中醫(yī)學認為,脾具有“主運化”的作用,與肝合為人體樞紐;微觀上,線粒體是機體物質(zhì)代謝和能量轉(zhuǎn)化的中心,是機體進行各項生命活動的樞紐。所以,從人體宏觀以及微觀的角度,均可認為脾-線粒體共同作為機體“后天之本”“氣血生化之源”。

4.2PMC線粒體功能障礙及其誘導的自噬與中醫(yī)脾氣虧虛密切相關(guān) 通過對全國8個省市2 546例PD患者進行中醫(yī)證型分析,發(fā)現(xiàn)PD初期脾腎氣虛證的比例最大〔27,28〕。脾虛證通常伴隨著機體線粒體結(jié)構(gòu)或功能損傷,脾虛證與線粒體氧化損傷相關(guān),并影響能量代謝過程〔29〕。研究表明〔30～32〕,補脾中藥和復方可以通過改善脾氣虛導致的線粒體功能障礙。首先,四君子湯可明顯升高脾虛證大鼠骨骼肌線粒體超氧化物歧化酶(SOD)、Ca-Mg-ATP等酶活性,降低丙二醛(MDA)含量;其次,四君子湯明顯升高心衰大鼠心肌組織肌球蛋白輕鏈2、琥珀酰輔酶A連接酶(Suclg)2蛋白,下調(diào)絲氨酸蛋白酶抑制劑A3N、丙酮酸脫氫酶復合體,表明健脾益氣中藥可減輕線粒體氧化損傷,調(diào)節(jié)能量代謝,改善骨骼、心臟功能〔30,31〕。林海鳴等〔32〕通過制備水濕困脾動物病理模型,發(fā)現(xiàn)培土制水方能清除模型大鼠ROS,減少水濕困脾證大鼠心肌及小腸細胞線粒體的損傷,起到保護細胞的作用。

線粒體自噬活性與脾氣是否充足密切相關(guān)。通過觀察脾氣虛大鼠海馬神經(jīng)元線粒體自噬水平及PINK1/Parkin途徑的變化,發(fā)現(xiàn)脾氣虛的發(fā)生可能與PINK1/Parkin途徑抑制所致的海馬神經(jīng)元線粒體自噬水平下降有關(guān)〔33〕?？梢?中醫(yī)脾氣虧虛與線粒體功能障礙-自噬存在密切相關(guān)性。因此,健脾益氣法可能通過調(diào)控PINK1/Parkin通路影響PMC線粒體功能及其介導的自噬活性,激活其適應性保護機制,起到保護PMC損傷、防治PF的作用。

綜上,線粒體功能障礙可能是從脾論治PF的生物學基礎(chǔ)。從脾氣虛、線粒體功能相關(guān)指標及脾與腹膜組織線粒體的結(jié)構(gòu)變化等方面探討從脾論治PF的療效機制,研究具有健脾益氣、活血祛瘀和絡(luò)的健脾益氣方能否調(diào)控PINK1/Parkin通路影響PMC線粒體功能及其介導的自噬活性,激活其適應性保護機制,可能是保護PMC損傷、防治PF的新靶點。本研究從調(diào)養(yǎng)后天之本出發(fā),以期豐富脾-腹膜臟象理論,為PF的防治提供參考和依據(jù)。