崔璨 宋瑋 田華 侯文雁

(商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 1診斷教研室,河南 商丘 476000;2生化教研室)

2000～2019年糖尿病相關(guān)死亡率增加70%〔1,2〕。長期患有糖尿病的患者往往出現(xiàn)代謝和實驗室生化指標(biāo)的改變,引發(fā)先天性免疫反應(yīng),導(dǎo)致血管并發(fā)癥。糖尿病腎病(DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,已成為全球最常見的導(dǎo)致終末期腎病的原發(fā)性疾病〔3〕。DN是由長期糖尿病相關(guān)的代謝和血流動力學(xué)紊亂引起的〔4,5〕,既往研究證實了腎小管損傷在DN進(jìn)展中的重要性,隨著腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)展,最終導(dǎo)致終末期腎病、腎衰竭、透析或腎臟移植等。鑒于腎小管損傷在DN發(fā)病機(jī)制中的重要性,臨床亟待尋找新型藥物以減輕腎小管損傷并延緩DN的發(fā)展。白皮杉醇(Pic)是一種主要存在于種子、葡萄酒和水果中的天然二苯乙烯〔6～8〕。據(jù)報道,Pic對多種疾病具有保護(hù)作用,如代謝性心肌病、缺血性心肌病等,并具有抗癌功能〔9～11〕。研究表明,由于Pic抗炎、抗氧化特性,其在調(diào)節(jié)多種生理過程中起關(guān)鍵作用〔12,13〕。Pic通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)途徑抑制氧化應(yīng)激,減輕年齡相關(guān)性黃斑變性小鼠的黃斑視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞變性〔14〕;調(diào)節(jié)核因子(NF)E2相關(guān)因子(Nrf)2/血紅素氧化酶(HO)-1和NF-κB通路,減輕糖尿病心肌病中的炎癥和氧化應(yīng)激損傷〔12〕。此外,Pic還可通過激活沉默調(diào)節(jié)蛋白(Sirt)1/叉頭框蛋白(Fox)O1信號通路,在腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的凋亡和氧化應(yīng)激中發(fā)揮保護(hù)性作用〔15〕。目前關(guān)于Pic對DN腎小管損傷影響的相關(guān)研究較少,且具體作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在通過探討Pic對DN腎小管間質(zhì)纖維化、腎小管凋亡的影響,研究其可能的作用通路,為臨床應(yīng)用Pic治療DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 健康8周齡,24 g左右體質(zhì)量的C57BL/6雄性小鼠,共40只,購自河南省實驗動物中心,將小鼠飼養(yǎng)于相對恒溫、恒濕的環(huán)境中,自由進(jìn)食和飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2購自上海富衡生物科技有限公司。Pic購自樂美天醫(yī)藥。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma-Aldrich公司。D-葡萄糖購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗(100×)、磷酸鹽緩沖液、乙二胺四乙酸(EDTA)-胰蛋白酶消化液、DMEM/F12培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。Sirt1(ab110304)、FoxO1(ab179450)、磷酸化FoxO1(p-FoxO1,ab47326)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3(ab184787)、裂解(Cleaved) Caspase-3(ab32042)、(Bax,ab32503)、E-cadherin(ab231303)、α-平滑肌動蛋白(SMA,ab5694)及β-肌動蛋白(actin,ab8226)抗體購于英國abcam公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、放射免疫沉淀法(RIPA)強(qiáng)裂解液、4%多聚甲醛、封閉液、一抗和二抗稀釋液、二抗均購自碧云天生物科技有限公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司。

1.2動物模型的制作和分組 將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組,分別為正常對照(Control)組、模型(Model)組、Pic低劑量(Low-Pic)組、Pic中劑量(Mid-Pic)組及Pic高劑量(High-Pic)組各8只,除Control組外,其他組進(jìn)行高糖高脂飲食,并配合STZ腹腔注射誘導(dǎo)構(gòu)建DN小鼠模型,小鼠尾靜脈空腹血糖>16.65 mmol/L、24 h尿蛋白定量≥20 mg提示DN模型成功建立。Low-Pic、Mid-Pic及High-Pic組,DN造模成功后,分別給予Pic 10、20及40 mg/kg灌胃2 w,Control組及Model組給予等量生理鹽水灌胃處理。在相應(yīng)處理結(jié)束后,小鼠眼眶采血,室溫、5 000 r/min離心20 min留取血清保存于-80 ℃冰箱待用,頸椎脫臼法處死小鼠,解剖留取雙側(cè)腎臟組織,使用磷酸鹽緩沖液清洗后,保存?zhèn)溆?。本研究所涉及動物的所有實驗方法及操作已?jīng)醫(yī)院倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組 使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基,在恒溫、恒濕、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中對HK-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。將HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為5組,分別為Control組、Model組、Low-Pic組、Mid-Pic組及High-Pic組。除Control組外,使用30 mmol/L D-葡萄糖對其他組處理72 h后,對Low-Pic組、Mid-Pic組及High-Pic組分別進(jìn)行Pic 10、20及40 μmol/L處理24 h〔16〕。

1.4檢測小鼠腎功能及血糖指標(biāo) 采用全自動生化分析儀檢測小鼠空腹血糖、血清肌酐、尿素氮及24 h尿總蛋白。

1.5Western印跡法測定細(xì)胞蛋白表達(dá) 使用RIPA強(qiáng)裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min后,4 ℃、12 000 r/min離心20 min,留取蛋白上清,使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量。制備10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)凝膠,每孔上樣15 μg 蛋白樣本進(jìn)行電泳分離,并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。室溫、25 r/min封閉PVDF膜1 h后分別加入對應(yīng)一抗Sirt1(1∶2 000)、FoxO1(1∶2 000)、p-FoxO1(1∶1 000)、Caspase-3(1∶2 000)、Cleaved Caspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)、E-cadherin(1∶2 000)、α-SMA(1∶2 000)及β-actin(1∶3 000),4 ℃、25 r/min孵育過夜,次日使用對應(yīng)二抗在室溫條件下孵育1 h后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液,在Bio-Rad熒光成像系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白條帶發(fā)光成像,并用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組空腹血糖及腎功能指標(biāo)比較 與Model組相比,Low-Pic、Mid-Pic、High-Pic組腎損傷指標(biāo)、空腹血糖顯著降低,且呈顯著劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 各組空腹血糖及腎功能指標(biāo)比較

2.2各組纖維化及凋亡蛋白表達(dá)水平比較 與Control組相比,Model組E-cadherin蛋白顯著減少,而α-SMA、Cleaved Caspase-3及Bax蛋白水平顯著增加,Low-Pic、Mid-Pic、High-Pic組可顯著逆轉(zhuǎn)上述變化,且Pic呈顯著劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

表2 各組纖維化、凋亡蛋白、Sirt1、p-FoxO1表達(dá)水平比較

2.3各組Sirt1、p-FoxO1表達(dá)水平比較 與Control組相比,Model組Sirt1及p-FoxO1蛋白顯著減少,Low-Pic、Mid-Pic、High-Pic可顯著逆轉(zhuǎn)上述變化且呈顯著劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

3 討 論

Pic是白藜蘆醇羥基化衍生物及代謝物,廣泛存在于植物中。Pic具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用〔12,13,17〕。張云霞等〔18〕發(fā)現(xiàn)PIC可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活,抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生,從而減輕DN引起的腎小球內(nèi)皮損傷。

本研究中Pic逆轉(zhuǎn)作用呈濃度依賴性,提示高劑量Pic治療有望減輕DN情況下腎小管上皮細(xì)胞損傷。Sirt1是一種蛋白質(zhì)脫乙酰酶,是細(xì)胞能量代謝和衰老的重要調(diào)節(jié)劑〔19〕。有研究證實,Sirt1可抑制腎損傷發(fā)生腎纖維化〔20〕。FoxO1由Sirt1調(diào)節(jié),并在DN的抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用〔21〕。本研究提示Pic發(fā)揮保護(hù)性作用可能是通過調(diào)節(jié)Sirt1/FoxO1加以實現(xiàn)。