陳國戶,李 廣,溫宏偉,尹 倩,吳思文,王 英,劉雪晴,趙龍龍,KHAN Afrasyab,桂尚枝,唐小燕,汪承剛,2,*

(1.安徽省園藝作物育種工程實(shí)驗(yàn)室,安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,安徽 合肥 230036; 2.安徽省皖江蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,安徽 馬鞍山 238253)

抽薹開花是十字花科植物生命周期中最重要的階段之一[1],受多種環(huán)境和內(nèi)源發(fā)育信號共同控制,其精確的抽薹開花時(shí)間機(jī)制可確保植物種子在各種環(huán)境中發(fā)育與傳播[2-3]。擬南芥中超過180個抽薹開花相關(guān)基因已被確定,參與春化與溫度、光周期與赤霉素、年齡與自主開花、脫落酸與油菜素甾醇等途徑中[4-5],并且各途徑相互交織,通過控制FLC(FLOWERINGLOCUSC)、SMZ(SCHLAFMüTZE)及TOEs(TARGETOFEATs)等開花抑制因子或SOC1(SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCO1)、FT(FLOWERINGTIME)及FD(FLOWERINGLOCUSD)等開花促進(jìn)因子的表達(dá)強(qiáng)度,精確調(diào)節(jié)下游花序分生組織和花器官特異基因的表達(dá),從而確定抽薹開花時(shí)間[1,4]。

春化途徑是十字花科植物抽薹開花誘導(dǎo)的重要途徑之一。春化途徑依賴于兩個顯性基因:FRI(FRIGIDA)和FLC[6]。甘藍(lán)(Brassicaoleraca)、油菜(B.napus)、大白菜(B.rapa)等作物FLC與FRI基因家族的表達(dá)具有組織特異性和生長發(fā)育階段特異性,在抽薹開花發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[7]。植物春化前,FRI通過與mRNA結(jié)合蛋白(mRNA binding protein)的相互作用,增強(qiáng)FLC轉(zhuǎn)錄水平,直接或形成復(fù)合體結(jié)合到FT、FD、SOC1基因位點(diǎn)并抑制其轉(zhuǎn)錄,從而減少光周期信號和其他調(diào)控途徑對這些基因的激活作用[8]。植物經(jīng)歷低溫春化后,VIVIPAROUSI/ABI3-LIKEfactor1(VAL1)等轉(zhuǎn)錄因子抑制FLC的表達(dá),從而促使植物在春季的有利條件下抽薹開花[9-10]。

在實(shí)際生產(chǎn)中,十字花科蔬菜過早抽薹可導(dǎo)致嚴(yán)重問題,降低其產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此,開花時(shí)間是十字花科蔬菜育種中一個重要性狀和選擇目標(biāo)。蘿卜(RaphanussativusL.)是十字花科重要的根莖類作物,肉質(zhì)直根,含有豐富的碳水化合物和多種維生素[11],在世界范圍內(nèi)廣泛種植,尤其是在中國、日本、韓國和東南亞等國種植面積較大。在秋冬季生產(chǎn)中,蘿卜完成春化過早抽薹,導(dǎo)致根系發(fā)育不良,從而影響產(chǎn)量、降低品質(zhì)[12-13]。近年來,對白菜等蕓薹屬蔬菜開花相關(guān)基因功能研究取得了進(jìn)展,但在蘿卜中研究較少。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)全基因組鑒定蘿卜抽薹開花相關(guān)基因;利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)及META分析技術(shù),篩選鑒定春化響應(yīng)關(guān)鍵基因;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù),分析關(guān)鍵基因的表達(dá)模式。研究結(jié)果將為進(jìn)一步探明蘿卜抽薹開花分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從蕓薹屬基因組數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.cn)下載蘿卜全基因組序列及其注釋文件(Rapsa_Xiang_V1.0/)。從TAIR數(shù)據(jù)庫(https://arabidopsis.org/)下載擬南芥全基因組氨基酸序列文件(TAIR10)。在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://ncbi.nlm.nih.gov/)下載蘿卜不同春化時(shí)間及不同組織器官RNA-Seq原始數(shù)據(jù)(PRJNA355048、PRJNA325876、PRJNA413464)[12,14-15]。RNA-Seq測序數(shù)據(jù)質(zhì)控后,獲得clean reads再比對到蘿卜參考基因組;基因表達(dá)豐度采用FPKM(fragments per kilobase of exon per million mapped reads)表示。利用DESeq2軟件包進(jìn)行差異表達(dá)基因分析,并利用omicshare(https://omicshare.com)在線工具進(jìn)行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)與Gene Ontology(GO)富集注釋。

1.2 蘿卜開花相關(guān)基因鑒定

以擬南芥開花基因[4]蛋白序列為種子序列,通過BLASTP工具全基因組搜索蘿卜基因組;篩選的候選序列比對至SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫,鑒定目標(biāo)序列(匹配度大于65%且E-value<1×10-20)[15];對每條目標(biāo)序列再利用MEGA7.0工具,采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹,確定目的序列(置信度高于60%且位于同一主支不同分支上的基因[15])。利用TBtools工具[16]進(jìn)行基因密度統(tǒng)計(jì)(BinSize:100 kb)及基因染色體定位分析。

1.3 蘿卜春化響應(yīng)關(guān)鍵基因篩選

利用NetworkAnalyst(https://networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/home.xhtml)對蘿卜每個春化RNA-Seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行質(zhì)檢、標(biāo)準(zhǔn)化處理[log2(counts)/million]以及春化前后差異表達(dá)基因分析(P<0.05);通過ComBat程序[17]消除批次差異。選擇Fisher’s method[-2×∑log(p)]進(jìn)行META分析(P_meta<0.05),獲得春化前后差異表達(dá)基因。結(jié)合比較轉(zhuǎn)錄組分析,篩選出蘿卜春化響應(yīng)關(guān)鍵基因[17]。

1.4 蘿卜春化響應(yīng)關(guān)鍵基因互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING(https://cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析;再利用Cytoscape工具及MCODE插件進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)分析[18]。

1.5 蘿卜春化響應(yīng)關(guān)鍵基因表達(dá)分析

以蘿卜NHFJ為試材(晚抽薹高代自交系,本實(shí)驗(yàn)室保存),1月苗齡時(shí)低溫春化0、15、30 d取幼嫩葉片組織用于RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄。采用Bio-Rad CFX96 RT-PCR儀(Bio-Rad, Hercules, USA)及ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,南京),以actin為內(nèi)參,對富集在春化與冷響應(yīng)、赤霉素生物合成以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑上的春化響應(yīng)關(guān)鍵基因,利用表1中的引物進(jìn)行qRT-PCR分析。

表1 qRT-PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜抽薹開花相關(guān)基因全基因組鑒定

根據(jù)擬南芥開花相關(guān)基因蛋白序列,對蘿卜基因組序列進(jìn)行全基因組BLASTP搜索,并經(jīng)多重篩選鑒定,共鑒定出272個開花相關(guān)基因;染色體分布分析(圖1),發(fā)現(xiàn)1號染色體上基因數(shù)量最多(53個)、6號染色體上最少(15個),另有7個基因(Rsa10000547、Rsa10000811、Rsa10000900、Rsa10003029、Rsa10001141、Rsa10001984、Rsa10003234)定位在不同的scaffold結(jié)構(gòu)中。

圖1 蘿卜開花相關(guān)基因染色體定位

2.2 蘿卜開花相關(guān)基因表達(dá)模式分析

利用不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析開花相關(guān)基因在根、莖、葉、花、角果及愈傷組織等組織中的表達(dá)特征(圖2)。結(jié)果顯示:大部分蘿卜抽薹開花相關(guān)基因在各組織中表達(dá)量不高;共有26個基因在不同組織中均高表達(dá)(FPKM>500[19],根中14個、莖中18個、葉中8個、花中15個、角果中12個、愈傷中11個),其中Rsa10007621(UBC2a)、Rsa10015570(UBC2b)、Rsa10007767(CDF3)、Rsa10028941(GRP7)、Rsa10021738(SLY1)在各組織中均高表達(dá)。

圖中的色標(biāo)表示log2(FPKM)值。

2.3 蘿卜春化轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

對蘿卜材料NHJS1、NHJS2和2#的不同春化時(shí)間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析(圖3)。結(jié)果顯示,同一材料各生物學(xué)重復(fù)組之間相關(guān)系數(shù)于0.90,不同春化階段之間相關(guān)系數(shù)高于0.82,不同材料同一春化階段相關(guān)系數(shù)均高于0.80,表明這些RNA-Seq數(shù)據(jù)可靠性較高,且不同材料基因?qū)Υ夯憫?yīng)趨勢類似。

圖3 蘿卜不同材料、不同春化時(shí)間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

2.4 蘿卜春化關(guān)鍵基因鑒定及其表達(dá)模式分析

對蘿卜不同材料及不同春化時(shí)間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行重分析,共獲得上調(diào)基因5 803個、下調(diào)基因5 649個(圖4-A),共有差異表達(dá)基因(DEG)3 839個(圖4-B)。在這些DEG中,共篩選出26個開花相關(guān)基因(圖4-C);利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析其表達(dá)趨勢,發(fā)現(xiàn)這些基因隨著春化時(shí)間的延長,其表達(dá)量呈現(xiàn)顯著的差異(圖4-D);并且這些基因在3個材料中的表達(dá)趨勢相似。表明這些差異表達(dá)開花相關(guān)基因可能響應(yīng)春化反應(yīng),參與春化調(diào)控途徑。

A, 蘿卜不同材料、不同春化時(shí)間轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因(DEG)分析。B,不同材料差異表達(dá)基因韋恩圖分析。C,VRG,春化反應(yīng)相關(guān)基因;FRG,開花相關(guān)基因,T-DEG,不同材料差異表達(dá)基因。D,春化相關(guān)基因表達(dá)趨勢;RT,室溫春化開始時(shí);VE,春化處理早期;VL,春化處理后期。

2.5 META分析

對蘿卜不同材料、不同春化時(shí)間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行META分析(圖5-A),共獲得7 136個DEG;其中,抽薹開花相關(guān)基因51個(圖5-B)。結(jié)合比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析數(shù)據(jù),共獲得春化關(guān)鍵基因25個(圖5-B),表明這些基因?yàn)樘}卜春化響應(yīng)關(guān)鍵基因。

A,META分析維恩圖;RT,室溫春化開始時(shí);VE,春化處理早期;VL,春化處理后期。B,春化關(guān)鍵基因韋恩圖;FRG,開花相關(guān)基因;VRG,轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析獲得的春化響應(yīng)相關(guān)基因;M-DEG,META分析獲得的差異表達(dá)基因。

2.6 功能富集分析

對上述獲得的25個春化響應(yīng)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO功能富集分析(圖6-)。結(jié)果顯示,絕大部分基因富集在分生組織從營養(yǎng)生長向生殖生長過渡相關(guān)的途徑(GO:0010228)、生物過程調(diào)控途徑(GO:0050789)、光周期途徑(GO:0009648)、赤霉素合成(GO:0009685)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(GO:0010476)。只有Rsa10024990(FLC1)、Rsa10036313(FLC2)兩個基因富集在春化響應(yīng)途徑(GO:0010219)(圖8-A)。對25個春化響應(yīng)關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG功能富集分析,結(jié)果(圖6-B、C)顯示,絕大部分基因富集在與外界環(huán)境(溫度、光照等)適應(yīng)相關(guān)的晝夜節(jié)律途徑(ko04712)和二萜類化合物生物合成途徑(ko00904)。以上結(jié)果表明(表2),這些關(guān)鍵基因參與多種途徑應(yīng)答春化反應(yīng)。

A,GO富集分析;B,KEGG富集分析;C,赤霉素生物合成通路。A和B中,第一圈表示富集到的GO條目和KO號,第二圈表示富集到該通路的背景基因,第三圈表示富集到該通路上下調(diào)基因數(shù)目,第四圈表示富集因子。

表2 光周期、春化、赤霉素生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上的春化響應(yīng)關(guān)鍵基因

2.7 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

為了分析上述春化響應(yīng)關(guān)鍵基因之間的聯(lián)系,利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)(圖7-A)。結(jié)果顯示,FLC、TOC1、PHYB、AGL20與其他基因之間的連接度最高,是網(wǎng)絡(luò)中最重要的節(jié)點(diǎn)基因;并且與春化、光周期、赤霉素代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物過程調(diào)控、萜類化合物代謝等途徑相關(guān)的蛋白高度聚集(圖7-B、圖7-C),進(jìn)一步表明這些基因是蘿卜應(yīng)答春化反應(yīng)關(guān)鍵基因。

2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證(qRT-PCR)

對富集在光周期、春化、赤霉素生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上的春化響應(yīng)關(guān)鍵基因(表2)進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果(圖8)顯示,RsGA2ox1、RsPHYB、RsCDF1、RsGA1、RsGI、RsGID1B、RsPRR5、RsPRR9、RsKS、RsTOC1等基因顯著上調(diào)表達(dá),而RsFLC3、RsGA2ox6等基因顯著下調(diào)表達(dá)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

一般而言,十字花科植物抽薹開花屬于多基因控制的數(shù)量遺傳性狀,多種調(diào)控途徑相互交織形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[4]。春化途徑是十字花科植物抽薹開花誘導(dǎo)的重要途徑之一,可加速植物從營養(yǎng)期到生殖期的發(fā)育。植物春化作用受多基因調(diào)控,可通過調(diào)節(jié)植物激素合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或春化相關(guān)途徑代謝物水平影響開花時(shí)間[20-22]。本研究利用序列同源比對及系統(tǒng)發(fā)育分析技術(shù),全基因組鑒定了蘿卜272個抽薹開花相關(guān)基因(圖1)。利用蘿卜組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析抽薹開花相關(guān)基因的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)UBC2(Rsa10007621、Rsa10015570)、SLY1(Rsa10021738)等少數(shù)基因在蘿卜多個組織中高表達(dá)(圖2)。據(jù)報(bào)道,玉米UBC2基因參與低氮脅迫[23],表明這些基因在蘿卜抽薹開花等多個生長發(fā)育過程中具有重要的作用。

利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)與META分析技術(shù),共鑒定出25個蘿卜開花相關(guān)DEG(圖5-B),推測這些基因可能作為響應(yīng)春化的關(guān)鍵因子,參與調(diào)控蘿卜抽薹開花過程。對其表達(dá)趨勢分析(圖4-D),發(fā)現(xiàn)多數(shù)開花相關(guān)基因隨著春化時(shí)間延長,其表達(dá)水平逐漸升高;該結(jié)果與Liu等[12]的結(jié)果一致。對這些春化響應(yīng)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO與KEGG富集分析(圖6),發(fā)現(xiàn)大部分基因富集在分生組織從營養(yǎng)生長向生殖生長過渡途徑(GO:0010228)、光周期途徑(GO:0009648)和晝夜節(jié)律途徑(ko04712)以及赤霉素生物合成(GO:0009685)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(GO:0010476)中,其中Rsa10024990(FLC1)、Rsa10036313(FLC2)兩個基因富集在春化響應(yīng)途徑,表明這些途徑關(guān)鍵基因參與了蘿卜春化響應(yīng)。

據(jù)報(bào)道,春化途徑、光周期/晝夜節(jié)律途徑、赤霉素生物合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑彼此獨(dú)立又相互交織,協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)對植物開花的精細(xì)調(diào)控[24-25]。本研究鑒定的蘿卜響應(yīng)春化反應(yīng)關(guān)鍵基因富集于上述途徑中(圖6),彼此之間具有緊密的聯(lián)系(圖7),協(xié)同作用共同響應(yīng)春化,從而調(diào)控蘿卜抽薹開花(圖9)。春化途徑關(guān)鍵基因FLC通過抑制開花整合因子FLOWERINGLOCUST(FT)的表達(dá)調(diào)控開花[26],該基因在蘿卜基因組中共有3個拷貝[27];本研究共鑒定到2個拷貝,且經(jīng)過春化后均下調(diào)表達(dá),而FLC3(Rsa10013589)可能不參與春化響應(yīng),或其表達(dá)量較低未被檢測到[12]。VERNALIZATIONINSENSITIVE3(VIN3)基因是FLC的上游調(diào)控因子[28],其轉(zhuǎn)錄在春化后被CIRCADIANCLOCK-ASSOCIATED1(CCA1)/LATE-ELONGATEDHYPOCOTYL(LHY)激活,抑制FLC的表達(dá),共同調(diào)控蘿卜花芽分化,促使蘿卜由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變[28-29]。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示(圖7-A),TIMINGOFCABEXPRESSION1(TOC1)基因作為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)與VIN3基因可能存在相互作用,共同調(diào)控FLC1的表達(dá)水平。除FLC外,擬南芥中還有分別依賴AGL24與AGL19的獨(dú)立春化途徑,其中AGL24可正向調(diào)控SOC1的表達(dá),AGL18與AGL24基序相似(LXLXL)且相互作用[2],因此AGL18也可能直接調(diào)控SOC1(圖9)。

圖9 春化響應(yīng)關(guān)鍵基因調(diào)控蘿卜抽薹開花

內(nèi)源激素赤霉素(GAs)在需低溫春化植物抽薹開花過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,當(dāng)春化不足以誘導(dǎo)SOC1激活時(shí),GA在短日照條件下通過激活SOC1而起到關(guān)鍵作用,促進(jìn)早熟抽薹和開花[30-31]。蘿卜幼苗春化過程中噴施GA,發(fā)現(xiàn)GA分別通過RsLHY、RsGI和RsTEM1作為激活子和抑制子調(diào)控蘿卜抽薹開花[11]。本研究中也發(fā)現(xiàn)赤霉素合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因可響應(yīng)春化反應(yīng)(表2),RsGA3ox2、RsGA2/KS、RsGID1B基因在春化過程中的表達(dá)量均有顯著變化(圖8)。此外,我們還發(fā)現(xiàn)光周期及晝夜節(jié)律途徑相關(guān)基因也參與了春化響應(yīng)(圖9),其表達(dá)水平在春化過程中也有顯著變化(圖8)。轉(zhuǎn)錄因子CONSTANS(CO)是光周期及晝夜節(jié)律途徑的中樞基因,晝夜節(jié)律核心組分PSEUDO-RESPONSEREGULATOR(PRR)在特定時(shí)間階段與CO相互作用,通過誘導(dǎo)FT基因的表達(dá)來調(diào)控抽薹開花[8,32]。GI是CCA1/LHY夜間表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[33]。除PRP外,核心組分ELF3與COP1相互作用,以降解GI蛋白,進(jìn)而調(diào)節(jié)開花時(shí)間[13]。光信號途徑中光敏色素PHYA、PHYB可通過CO蛋白來調(diào)節(jié)FT基因的表達(dá)[34]。因此,春化、赤霉素及光周期與晝夜節(jié)律途徑相關(guān)基因均參與了春化反應(yīng)響應(yīng)過程(圖9),共同調(diào)控蘿卜抽薹開花時(shí)間[14,35]。