張 麗,王媛媛,王 瑞,劉麗霞

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex, MHC)是一組緊密連鎖的基因簇,MHC基因的遺傳多樣性水平降低可導(dǎo)致畜禽種群內(nèi)個(gè)體對(duì)突發(fā)性、傳染性病原體的易感性增高,致使畜禽抗病能力單一、生存力下降[1]。牛MHC又稱牛白細(xì)胞抗原(bovine leucocyte antigen, BoLA),是一類高度多態(tài)的基因座位組成的細(xì)胞表面轉(zhuǎn)膜蛋白,通過(guò)向T細(xì)胞提供抗原,從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),在疾病抵抗中起主要作用,與牛的疾病呈強(qiáng)相關(guān)[2]。MHC可分為MHCⅠ類、MHCⅡ類和MHCⅢ類抗原基因[3],MHCⅡ類抗原基因是由編碼Ⅱ類抗原α鏈的DA基因和編碼β鏈的DB基因構(gòu)成,DA基因含有DRA、DQA、DMA、DNA和DYA共5個(gè)基因座位,其中DRA基因既是一個(gè)高度表達(dá)的基因座位,又是MHCⅡ類抗原最主要的組成部分,主要負(fù)責(zé)編碼α鏈。大多數(shù)MHC基因具有豐富的多態(tài)性,但DRA基因較保守[4]。

大通牦牛是生長(zhǎng)于高寒高海拔地區(qū)的唯一一個(gè)培育品種,具有明顯的野牦牛特征,在生理生化、行為生態(tài)等方面與同海拔的其他牦牛亞種相比,表現(xiàn)出一定的特殊性,其產(chǎn)肉性能、繁殖性能、抗逆性能等均優(yōu)于一般家養(yǎng)牦牛,遺傳性能更加穩(wěn)定。為了解和找出高寒高海拔地區(qū)牦牛抗病性的遺傳基礎(chǔ),本研究對(duì)大通牦牛MHCⅡ類DRA基因編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序,篩查該基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)突變位點(diǎn),通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)大通牦牛DRA基因突變前后編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行對(duì)比分析,為全面解析牦牛MHCⅡ類基因結(jié)構(gòu)與功能的研究奠定基礎(chǔ),為牦牛遺傳育種方面研究提供基因方面的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血樣采集及全基因組DNA提取

青海省大通種牛場(chǎng)采集大通牦牛血樣55份,醫(yī)用采血管保存。全基因組DNA提取采用傳統(tǒng)苯酚-氯仿抽提法進(jìn)行全基因組DNA提取,去離子水溶解稀釋。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果,用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)每個(gè)樣品DNA濃度,加蒸餾水調(diào)整樣品DNA濃度至100 ng·μL-1,每20個(gè)DNA構(gòu)建1個(gè)總DNA池,-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中DRA基因序列(登錄號(hào)AJ505000和M30120),利用NCBI在線軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物如表1,送至蘇州金唯智生物有限公司合成。

表1 大通牦牛DRA基因引物序列

1.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

PCR反應(yīng)體系為20 μL:2×TaqPCR Master Mix 11 μL,上、下游引物各0.4 μL,基因組DNA 0.8 μL,雙蒸水7.4 μL。PCR擴(kuò)增步驟為:94 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,退火30 s(退火溫度見表1),72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4℃保存。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像儀拍照并記錄結(jié)果。檢驗(yàn)良好的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收后直接送至蘇州金唯智生物有限公司進(jìn)行正反雙向測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用Lasergene7.0軟件比對(duì)、校正,最終獲得大通牦牛DRA基因序列,結(jié)合BLAST分析并確定SNPs位點(diǎn)。

1.4 克隆測(cè)序

為保證結(jié)果準(zhǔn)確性,將清晰無(wú)雜帶的PCR產(chǎn)物用凝膠純化回收試劑盒純化回收后連接到T載體,并轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α細(xì)胞內(nèi),陽(yáng)性菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,經(jīng)轉(zhuǎn)化后的克隆菌液送至杭州金唯智有限公司進(jìn)行測(cè)序。使用BioEdit和Lasergene軟件分析測(cè)序峰圖并判斷突變位點(diǎn)及突變方式。

1.5 等位基因頻率的估算及生物信息學(xué)分析

利用Bioedit軟件查看測(cè)序結(jié)果,并運(yùn)用MWSnap軟件對(duì)各SNPs等位基因峰高進(jìn)行測(cè)量。按照文獻(xiàn)[5-7]中介紹的在線軟件對(duì)大通牦牛DRA基因編碼區(qū)進(jìn)行突變前后的生物信息學(xué)分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 大通牦牛DRA基因擴(kuò)增瓊脂糖電泳圖

大通牦牛DRA基因4個(gè)外顯子PCR擴(kuò)增片段條帶清晰,特異性較好,片段大小與理論大小符合,如圖1所示。

M,DL2000 marker;泳道1～4,BoLA-DRA基因Exon1-Exon4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 大通牦牛DRA基因測(cè)序峰圖結(jié)果

各SNPs測(cè)序峰圖如圖2所示。序列測(cè)序結(jié)果表明,大通牦牛DRA基因共有3個(gè)SNPs,以該基因全序列第1個(gè)堿基為基準(zhǔn),在DRA基因的第2 376 bp處存在C→T突變,位于第2外顯子;第2 851 bp處存在C→G突變,位于第2內(nèi)含子;第3 016 bp處存在C→A突變,位于第3外顯子,分別命名為g.2376C>T、g.2851C>G、g.3016C>A。其中g(shù).3016C>A突變?yōu)殄e(cuò)義突變(圖3),使第162位原來(lái)的亮氨酸(Leu)變成蛋氨酸(Met)。g.2376C>T屬于沉默突變,不影響氨基酸的表達(dá)。BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn),所得大通牦牛DRA基因核苷酸序列和氨基酸序列與NCBI中黃牛序列同源性達(dá)到了99%以上。

圖2 大通牦牛DRA基因SNPs測(cè)序峰圖

圖3 大通牦牛DRA基因編碼蛋白質(zhì)突變前氨基酸對(duì)比

2.3 突變前后大通牦牛DRA基因編碼蛋白基本信息比較

大通牦牛DRA基因發(fā)生g.3016C>A堿基突變后,編碼蛋白質(zhì)第162位氨基酸由亮氨酸(Leu)突變?yōu)榈鞍彼?Met),其蛋白的分子量增加了18.03 u,原子組成是C1304H2028N330O361S10,原子總數(shù)減少了2個(gè),脂肪系數(shù)減少了1.54,不穩(wěn)定系數(shù)增加了0.97,總平均親水性減少了0.007,其他基本信息未發(fā)生改變(表2)。突變前后DRA基因編碼蛋白均為疏水蛋白,且均為穩(wěn)定蛋白。

表2 大通牦牛DRA基因突變前后編碼蛋白基本信息比較

2.4 等位基因頻率估算

大通牦牛DRA基因各SNPs等位基因頻率估算結(jié)果見表3,等位基因頻率在突變前后有較大差異。

表3 大通牦牛DRA基因SNPs等位基因估算結(jié)果

2.5 大通牦牛DRA基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)引起突變的2個(gè)SNPs進(jìn)行mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,大通牦牛DRA基因突變前mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能為-241.80 kcal·mol-1,突變后g.2376C>T和g.3016C>A的最小自由能分別為-240.00 kcal·mol-1、-239.40 kcal·mol-1。由此可見,g.2376C>T和g.3016C>A降低了大通牦牛DRA基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(圖4)。

圖4 大通牦牛DRA基因SNPs突變前后mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比

2.6 大通牦牛DRA編碼蛋白質(zhì)突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

對(duì)引起錯(cuò)義突變的第162位亮氨酸(Leu)→蛋氨酸(Met)蛋白質(zhì)突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明,無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)在突變前后所占的比例均最高,是大通牦牛DRA基因突變前后編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件。其次是β折疊(Ee)、α螺旋(Hh)和β轉(zhuǎn)角(Tt),均分散在整個(gè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中。α螺旋(Hh)和β轉(zhuǎn)角(Tt)在突變前后所占比例相同,無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)和β折疊(Ee)所占比例在突變前后有明顯差異(表4),突變后DRA基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)β折疊(Ee)減少了8.54%,無(wú)規(guī)則卷曲增加了2.77%。

表4 蛋白質(zhì)突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.7 大通牦牛DRA編碼蛋白質(zhì)突變前后三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

為了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能,對(duì)引起錯(cuò)義突變的亮氨酸(Leu)→蛋氨酸(Met)編碼蛋白突變前后三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明,1個(gè)氨基酸的改變對(duì)大通牦牛DRA基因編碼蛋白質(zhì)突變前后三維結(jié)構(gòu)影響不大(圖5)。

圖5 蛋白質(zhì)突變前后三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比

3 討論

MHC基因與反芻動(dòng)物如牛、羊的許多疾病的抗性和易感性相關(guān)[8-9]。MHCⅡ類抗原基因最主要的組成部分是高度表達(dá)的DRA基因座,由于這類基因編碼的功能區(qū)能形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(antigen-binding site, ABS),其多態(tài)性直接與各種疾病的發(fā)生率有關(guān)。牛DRA基因編碼MHCⅡ類抗原基因DR分子的α鏈,其第2外顯子編碼的抗原結(jié)合區(qū)在抗原呈遞中發(fā)揮重要作用[10]。因此,對(duì)牛DRA基因多態(tài)性的研究主要集中在第2外顯子區(qū)域。李彥清等[11]研究發(fā)現(xiàn),牦牛和奶牛DRA基因第2外顯子區(qū)域內(nèi)存在2個(gè)SNPs(以第2外顯子的第一個(gè)堿基為基準(zhǔn)分別命名為116G>A和197T>C),內(nèi)含子2區(qū)域存在3個(gè)突變位點(diǎn)(A>G、T>C和C>T突變)。安添午[12]分析甘南牦牛和天祝白牦牛DRA基因序列發(fā)現(xiàn),存在5個(gè)不同類型的等位基因,其中Bogr-DRA*01015是新發(fā)現(xiàn)的等位基因,其他4個(gè)等位基因與其他?？苿?dòng)物共享,這一點(diǎn)也說(shuō)明BoLA-DRA具有明顯的跨種保守性。付保強(qiáng)等[13]研究發(fā)現(xiàn),奶牛DRA基因第1外顯子第1位和第2位之間存在1個(gè)堿基T的插入。高樹新等[14]研究認(rèn)為,中國(guó)西門塔爾牛、三河牛DRA基因第2外顯子兩個(gè)突變位點(diǎn)形成6個(gè)基因型,其中CC基因型可能與這兩種牛的乳房炎易感性有關(guān),BC基因型可能與這兩種牛的乳房炎抗性有關(guān)。對(duì)大通牦牛MHCⅡ類DRA基因擴(kuò)增序列測(cè)序結(jié)果表明,第2外顯子存在1個(gè)C→T轉(zhuǎn)換(g.2376C>T),第2內(nèi)含子存在1個(gè)C→G顛換(g.2851C>G),第3外顯子存在1個(gè)C→A顛換(g.3016C>A)。各突變位點(diǎn)等位基因頻率在突變前后有較大差異。其中g(shù).2376C>T與李彥清等[11]在牦牛和奶牛DRA基因第2外顯子上197T>C轉(zhuǎn)換為同一突變位點(diǎn)。DNA序列上3 016 bp上發(fā)生C>A的顛換導(dǎo)致大通牦牛MHCⅡ類DRA編碼蛋白質(zhì)第162位一個(gè)氨基酸的改變(L→M)。g.2376C>T是在大通牦牛亞種群中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)沉默突變,不影響氨基酸的表達(dá)。大通牦牛DRA基因沒有太多變異,這與Sena等[4]早期闡明的DRA基因在所有哺乳動(dòng)物尤其是反芻動(dòng)物中高度保守的觀點(diǎn)是一致的。

大通牦牛是適應(yīng)高海拔地區(qū)的新品種,具有較強(qiáng)的耐寒性和很好的適應(yīng)性,是我國(guó)重要的牦牛遺傳資源。然而,一些重要性狀的遺傳基礎(chǔ)在牦牛中尚待探索。當(dāng)前還沒有對(duì)大通牦牛DRA基因研究的相關(guān)報(bào)道,但是對(duì)牦牛BoLA-DRA基因進(jìn)行全面系統(tǒng)的遺傳多態(tài)性研究十分有必要,可為牦牛BoLA-DRA基因遺傳變異分析提供分子基礎(chǔ)。本研究成功地利用DNA混合池?cái)U(kuò)增和直接測(cè)序法獲得大通牦牛DRA基因4個(gè)外顯子約779 bp,組合序列包含762 bp的開放閱讀框(open reading frame, ORF)完整序列,編碼253個(gè)氨基酸產(chǎn)物,該結(jié)果與蒲蘭屏等[15]在犏牛上的研究結(jié)果完全一致。開放閱讀框、外顯子邊界和外顯子大小類似于普通牛DRA基因。開放閱讀框以起始密碼子ATG在核苷酸位置(20～22 bp)開始,終止密碼子TGA在核苷酸位置(779 bp)終止。大通牦牛與黃牛MHCⅡ類DRA基因762 bp的編碼區(qū)同源性為99%,表現(xiàn)出高度同源。蒲蘭屏等[15]表明,犏牛與黃牛MHCⅡ類DRA基因編碼區(qū)同源性高達(dá)99%,Swathi等[16]發(fā)現(xiàn),印度Deoni牛與水牛的DRA基因同源性達(dá)到了97.38%,Sakaram等[17]認(rèn)為,水牛DRA基因的編碼區(qū)與黃牛的同源性為98%。牦牛DRA基因具有跨種特性,這一重要研究結(jié)果支持了牦牛與普通牛、瘤牛和野牛都?xì)w為牛屬的觀點(diǎn)。

DRA基因多態(tài)性的貧乏或許與BoLA-DRA基因第2外顯子是構(gòu)成其蛋白分子的最基本的骨架有關(guān),也可能是由于包括牦牛在內(nèi)的反芻動(dòng)物在進(jìn)化過(guò)程中較近物種的分離以及反芻動(dòng)物在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷的相似性。大通牦牛DRA基因編碼蛋白質(zhì)第162位氨基酸發(fā)生了錯(cuò)義突變,氨基酸由突變前的亮氨酸(Leu)突變?yōu)榈鞍彼?Met),其蛋白質(zhì)的分子量28 425.04 u,原子總數(shù)4 033,脂肪系數(shù)98.62(越高越穩(wěn)定),蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)39.78(小于閾值40),總平均親水性0.049,其中親水性氨基酸49.01%,疏水性氨基酸50.99%,為疏水性穩(wěn)定蛋白,有利于其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)功能,結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí),功能也隨之發(fā)生改變。因此,推測(cè)該位點(diǎn)可能影響牦牛DRA蛋白的生物學(xué)功能。對(duì)大通牦牛DRA基因編碼區(qū)突變的2個(gè)SNPs進(jìn)行mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明,g.2376C>T和g.3016C>A自由能由突變前的-241.80 kal·mol-1減小到突變后的-240.00 kal·mol-1和-239.40 kal·mol-1。由此可知,編碼區(qū)的2個(gè)堿基突變降低了大通牦牛DRA基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。對(duì)引起錯(cuò)義突變的編碼蛋白質(zhì)突變前后二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明,無(wú)規(guī)則卷曲在突變前后所占的比例均最高,是大通牦牛DRA編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件,β-折疊、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角分散在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中。這一結(jié)果與劉麗霞等[18]在豬SLA-DRA基因上的研究結(jié)果一致;其編碼氨基酸在NCBI BLAST結(jié)果顯示與黃牛相似度高達(dá)99%,三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明1個(gè)氨基酸的改變對(duì)大通牦牛DRA編碼蛋白質(zhì)突變前后三維結(jié)構(gòu)影響不大。綜上所述,BoLA-DRA基因是MHC基因家族中高度保守的基因,本研究結(jié)果豐富了BoLA-DRA基因序列庫(kù),是對(duì)前人研究結(jié)果的補(bǔ)充,可為深入研究牦牛DRA基因結(jié)構(gòu)和功能提供理論基礎(chǔ)。