蘭 煜 ,范國棟,王 婷,吳 歡,李澤庚,李 平,陳 楊

(1.安徽中醫(yī)藥大學,安徽 合肥 230012;2.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科,安徽 合肥 230022;3.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230031)

巨噬細胞是單核吞噬系統(tǒng)中一類高度分化的成熟免疫細胞,在維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用［1］。近些年來,巨噬細胞極化備受關(guān)注,巨噬細胞可極化為抗腫瘤M1型(CD16/32+)和促腫瘤M2型(CD206+)巨噬細胞,其中M1型主要產(chǎn)生白細胞介素(interleukin, IL)-12、IL-1和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthases,iNOS)等因子,M2型主要分泌精氨酸酶1(arginase,Arg1)、 FIZZ1、IL-10等因子［2］。研究［3］表明,若調(diào)控誘導條件,二者可相互逆轉(zhuǎn)。巨噬細胞極化與腫瘤發(fā)生發(fā)展及腫瘤免疫治療關(guān)系密切,因此,對巨噬細胞亞型誘導因素及功能的研究對于腫瘤免疫治療的思路創(chuàng)新有著重要的意義,如何誘導巨噬細胞由M2型向M1型極化,從而發(fā)揮抗腫瘤效應已成為現(xiàn)今研究的熱點之一。

芪玉三龍湯是治療肺癌的有效驗方,其應用于臨床已有20余年,可改善肺癌患者生活質(zhì)量,穩(wěn)定瘤體［4］。既往研究顯示,芪玉三龍湯能夠平衡肺癌小鼠Th1/Th2漂移,抑制腫瘤細胞免疫逃逸［5］,方中有21種與肺癌發(fā)病相關(guān)的潛在生物標志物,其中鞘脂代謝途徑與Th1介導的抗腫瘤免疫顯著相關(guān)［6］。然而,芪玉三龍湯對巨噬細胞極化及其對CD4+、CD8+T細胞的影響目前未見報道。本研究擬通過檢測芪玉三龍湯處理的小鼠腹腔巨噬細胞膜表面分子、分泌的細胞因子及其對T細胞表面分子的作用,探討芪玉三龍湯對巨噬細胞極化及其對CD4+、CD8+T細胞的影響,為該方通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤效應的機制提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 6～8周齡的雄性SPF級C57BL/6小鼠10只,體質(zhì)量(20±2)g,購自常州卡文斯實驗動物有限公司［生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2011-0003］,飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學新安醫(yī)學教育部重點實驗室動物房,使用許可證號:SYXK(皖)2020-0060。本研究由安徽中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準,批準號:AHUCM-mouse-2019013。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(批號分別為NAA1321)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;NZJ5374):美國Hyclone公司;青霉素和鏈霉素(批號 68060600):Biosharp公司;胰酶(批號 F410BA0015):生工生物工程股份有限公司;三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇和甲醇(批號 20180904、20150513、20190529、20190812):國藥集團化學試劑有限公司;巰乙基淀粉肉湯(批號 70157100G):美國Sigma公司;Trizol(批號 87801):美國Invitrogen公司;Anti-mouse-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-F4/80(批號 70AM048005)、Anti-mouse-藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)-CD11b(批號 B2018137)、Anti-mouse-別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)-CD16/32(批號 70AM01601100)、Anti-mouse-APC-CD206(批號 SZB13607)、Anti-mouse-PE-PD-L1(批號 SZB18013)、Anti-mouse-PE-Cy7-Galectin-9(批號 BS2417)、Anti-mouse-FITC-CD4(批號 100405)、Anti-mouse-FITC-CD8(批號 100701)抗體:美國Biolegend公司;Anti-mouse-APC-CD155(批號 B335690)、Anti-mouse-APC-TIGIT(批號 B217242)抗體:美國eBioscience;IL-4(批號 E-21403):美國Peprotech公司。

1.3 主要實驗儀器 倒置顯微鏡:日本Olympus公司;移液器:德國Eppendof公司;超凈工作臺:蘇州凈化公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱、低溫高速離心機:美國Thermo Fisher公司;紫外可見分光光度計:美國METTLER TOLEDO UV5公司;流式細胞儀:美國Beckman公司;ABI 7500熒光實時定量PCR儀:美國ABI公司。

2 方法

2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)及純度鑒定 C57BL/6小鼠每天腹腔注射1次4%巰乙基淀粉肉湯,每次2 mL。3 d后,頸椎脫臼處死小鼠,置于75%乙醇中浸泡3～5 min,于無菌環(huán)境中向腹部注射含3% FBS和雙抗(100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素)的DMEM培養(yǎng)基5 mL,按摩腹部約3 min,靜置5 min后,鑷子拎起上腹部,剪開小口,抽出腹腔液于離心管中,1 300 r/min常溫離心8 min,棄上清,用含雙抗的DMEM洗滌1遍。用含10% FBS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞,取1×106個細胞進行FITC-F4/80和PE-CD11b染色,流式細胞儀鑒定細胞的純度。剩余的細胞接種于培養(yǎng)瓶中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后,棄上清,DMEM培養(yǎng)基洗滌2遍,再加入10% FBS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.2 芪玉三龍湯濃縮液的制備 將黃芪30 g,龍葵、白花蛇舌草、薏苡仁各20 g,玉竹、莪術(shù)、貝母各10 g,壁虎、地龍、澤漆各6 g加入10倍量的蒸餾水,浸泡1 h,武火煮沸后,文火慢煎90 min。將提取液過濾,殘渣再加入1.07 L的蒸餾水,武火煮沸,文火慢煎40 min。過濾提取液。將兩次提取液在50 ℃真空中混合濃縮至2 g/mL,制得芪玉三龍湯濃縮液［7］。

2.3 M2型巨噬細胞體外誘導及芪玉三龍湯處理 將上述分離鑒定的巨噬細胞,以每孔4×105個種植于6孔板中,3個重復孔,24 h后,采用20 ng/mL IL-4誘導其向M2型細胞極化［8］,取細胞進行Anti-mouse-APC-CD206染色,流式細胞儀鑒定模型誘導是否成功。在此基礎(chǔ)上,加入20 mg/mL芪玉三龍湯處理細胞［6］,分別于0、8、16、24 h收集細胞(對照組細胞不加入芪玉三龍湯處理,在0 h檢測),流式細胞術(shù)檢測細胞表面膜分子CD16/32、CD206、CD155、PD-L1、Galectin-9的表達水平;qRT-PCR檢測iNOS、IL-12 p40、IL-1β、Arg1、FIZZ1、IL-10 mRNA表達水平。

2.4 CD4+、CD8+T細胞的分離及與芪玉三龍湯處理的M2型巨噬細胞共培養(yǎng) 小鼠頸椎脫臼處死后,取脾臟組織經(jīng)過研磨、過濾、裂解紅細胞、洗滌等方式獲得小鼠脾臟淋巴細胞懸液,再經(jīng)過流式細胞分選的方法獲得CD4+、CD8+T細胞。將經(jīng)過芪玉三龍湯處理24 h的M2型巨噬細胞分別加入CD4+、CD8+T細胞與之共培養(yǎng)24 h后收集細胞懸浮液,流式細胞術(shù)檢測TIGIT表達水平。

3 結(jié)果

3.1 小鼠腹腔巨噬細胞的純度鑒定 分離獲得C57BL/6小鼠腹腔沖洗細胞,流式細胞術(shù)檢測小鼠腹腔巨噬細胞特異性表面分子CD11b和F4/80的表達水平,其純度為89.8%,達到實驗要求。見圖1。

注:A.收集腹腔沖洗的細胞,流式細胞儀根據(jù)散射光設(shè)門,前向角散射和側(cè)向角散射聯(lián)合設(shè)門;B.同型對照通過PE/FITC標記的isotype流式抗體進行分析;C.細胞采用FITC-F4/80和PE-CD11b染色,檢測雙陽性細胞所占的比例

3.2 M2型巨噬細胞體外誘導的結(jié)果 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),細胞表面特異性CD206分子的表達水平上升,對照組和IL-4處理組的CD206分子表達率分別為(0.53±0.02)%和(48.63±2.65)%,與對照組比較,IL-4處理組CD206分子表達率明顯上升(P<0.05)。見圖2。

注:A.對照組;B.IL-4處理組

3.3 芪玉三龍湯處理體外誘導的M2型巨噬細胞的結(jié)果 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,隨著時間的推移,細胞表面特異性分子CD16/32的表達水平不斷升高,而CD206表達水平降低,見表1。qRT-PCR結(jié)果顯示,處理24 h后芪玉三龍湯誘導的M1型巨噬細胞相關(guān)因子iNOS、IL-12 p40、IL-1β mRNA表達水平升高,而M2型相關(guān)因子Arg1、FIZZ1、IL-10 mRNA表達水平降低,見表2。結(jié)果提示,芪玉三龍湯能夠誘導M2型巨噬細胞向M1型極化。在腫瘤發(fā)生的諸多因素中,各類型的免疫抑制分子及其配體使腫瘤局部成為免疫抑制區(qū),作為腫瘤逃逸的機制之一。研究表明,芪玉三龍湯處理后,M2型巨噬細胞免疫抑制分子配體CD155、PD-L1、Galectin-9表達水平下降,見圖3。

表1 芪玉三龍湯對IL-4誘導的小鼠腹腔巨噬細胞表面CD16/32和CD206分子表達的影響

表2 芪玉三龍湯對IL-4誘導的小鼠腹腔M1型和M2巨噬細胞相關(guān)因子mRNA相對表達水平的影響

注:A.對照組;B.芪玉三龍湯組;與對照組比較,*P<0.05

3.4 芪玉三龍湯處理的M2型巨噬細胞對CD4+、CD8+T細胞表面抑制分子表達的影響 流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),CD4+、CD8+T細胞表面與巨噬細胞CD155分子配對的免疫抑制受體TIGIT的表達水平明顯下降。見圖4。

注:Ⅰ.IL-4誘導的M2型巨噬細胞經(jīng)芪玉三龍湯處理后,再與CD4+T細胞共培養(yǎng)24 h,收集懸液細胞,通過流式細胞術(shù)檢測CD4+T細胞表面免疫抑制受體TIGIT的表達水平;Ⅱ.IL-4誘導的M2型巨噬細胞經(jīng)芪玉三龍湯處理后,再與CD8+T細胞共培養(yǎng)24 h,收集懸液細胞,通過流式細胞術(shù)檢測CD8+T細胞表面免疫抑制受體TIGIT的表達水平;A.對照組;B.共同培養(yǎng)組;與對照組比較,*P<0.05

4 討論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展包括了一系列復雜的生物學過程。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophage, TAM)在腫瘤微環(huán)境中具有重要作用。TAM根據(jù)不同功能表型,可以分為抗腫瘤作用的M1型和促腫瘤作用的M2型,巨噬細胞亞群M1/M2比例失衡能夠影響腫瘤的進展［9-10］。

研究［11-12］表明,體外腹腔巨噬細胞經(jīng)IL-4誘導可成為促腫瘤作用的M2型巨噬細胞,其表面高表達特異性甘露糖受體CD206,具有高度特異性,可作為多種惡性腫瘤診斷的潛在標志物。M2型巨噬細胞免疫抑制分子配體PD-L1與T細胞表面PD-1結(jié)合阻斷T細胞介導的抗腫瘤免疫應答,促使腫瘤細胞免疫逃逸。而免疫抑制分子配體Galectin-9是TIM-3配體之一,TIM-3由其配體Galectin-9激活后,會抑制效應T細胞的活性,并引起外周耐受。CD4+、CD8+T細胞表面與巨噬細胞CD155分子配對的免疫抑制受體TIGIT是一種免疫調(diào)節(jié)分子,對腫瘤免疫周期產(chǎn)生抑制作用,保護腫瘤不被消除。TIGIT通過與巨噬細胞CD155分子配對結(jié)合,抑制T細胞和自然殺傷細胞的抗腫瘤反應,導致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。

“元氣化生異常,正氣虧虛,內(nèi)生瘤毒,毒生病絡(luò),瘤毒阻絡(luò),瘤毒傳絡(luò)”是惡性腫瘤的病因病機,據(jù)此提出了“穩(wěn)化生、扶正氣、清瘤毒、調(diào)病絡(luò)”的治療大法,即通過“扶正解毒通絡(luò)”穩(wěn)定元氣化生的環(huán)境,匡扶正氣,增強機體的抗病能力,結(jié)合各種清除瘤毒的治療手段,調(diào)節(jié)腫瘤患者絡(luò)脈瘀滯或過度增殖的病理狀態(tài),以達到控制腫瘤的目的［13］。依據(jù)“扶正解毒通絡(luò)”治法,形成了治療肺癌的有效驗方——芪玉三龍湯。方中黃芪補肺益氣,龍葵解毒抗癌,共為君藥;壁虎、地龍、澤漆解毒消積、通絡(luò)散結(jié),與黃芪相須為臣藥;莪術(shù)破血行氣、消積止痛,白花蛇舌草清熱解毒,薏苡仁補益肺脾,玉竹養(yǎng)陰生津,共為佐藥;貝母化痰潤肺、消腫散結(jié)為使藥。該方益氣養(yǎng)陰以補正虛,解毒消積、化痰祛瘀以祛積聚,諸藥合用,扶正與祛邪有機結(jié)合,共奏“扶正解毒、通絡(luò)消積”之功。

本研究采用IL-4誘導的M2型巨噬細胞為研究對象,從體外細胞角度探究芪玉三龍湯對巨噬細胞極化及T細胞的影響。研究結(jié)果表明,芪玉三龍湯可以將體外IL-4誘導的M2型巨噬細胞向M1型極化,并且可以下調(diào)CD4+、CD8+T細胞免疫抑制受體的表達水平,這可能是其調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫系統(tǒng)功能,發(fā)揮抗腫瘤作用的機制。

綜上所述,芪玉三龍湯可以通過誘導M2/M1型極化,并進一步促進M1型巨噬細胞對T細胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明,芪玉三龍湯在體外環(huán)境中對免疫細胞具有一定的調(diào)節(jié)作用,但其在體內(nèi)腫瘤微環(huán)境中的作用及內(nèi)在機制仍需要整體研究加以闡述與證實。