金英今，楊光，方英玉，李熙峰，王思宏

（延邊大學(xué) 分析測(cè)試中心，吉林 延吉 133002）

從復(fù)雜基質(zhì)里有效識(shí)別非目標(biāo)物質(zhì)，仍然面臨挑戰(zhàn)。一旦識(shí)別出的物質(zhì)，可以更詳細(xì)地解釋其潛在構(gòu)效和量效關(guān)系等生物學(xué)信息。為了明確識(shí)別物質(zhì)信息，需要依托色譜法、質(zhì)譜法、X 射線衍射法、核磁共振波譜法等分析方法[1]。葡萄酒是一種復(fù)雜體系，體系中含有與品質(zhì)、品種關(guān)聯(lián)的非目標(biāo)物質(zhì)，涉及食品質(zhì)量和食品安全，因而需要有效的檢測(cè)技術(shù)來(lái)驗(yàn)證葡萄酒的地道性和真實(shí)性[2-3]。較常規(guī)非目標(biāo)分析方法，核磁共振波譜法具有快速、無(wú)損的優(yōu)勢(shì)[4]，可以應(yīng)用于食品生產(chǎn)線開(kāi)展大規(guī)模檢測(cè)。

就樣品制備而言，核磁共振波譜法比高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜連用等檢測(cè)方法更簡(jiǎn)單快捷，核磁共振波譜法是檢測(cè)非紫外吸收屬性物質(zhì)，比如糖類(lèi)物質(zhì)的首選方法，該方法使葡萄酒中的非紫外吸收物質(zhì)檢測(cè)成為可能[6]。葡萄酒中高含量水、低含量添加劑等因素干擾譜圖的解析[7]，但是核磁共振氫譜法能壓制水峰，提高非目標(biāo)物質(zhì)信息的靈敏度。葡萄酒具有一定的商品經(jīng)濟(jì)價(jià)值，需要檢測(cè)和監(jiān)測(cè)它的品質(zhì)，為消費(fèi)者提供物質(zhì)成分的信息，因而需要可操作的、無(wú)損的核磁共振技術(shù)實(shí)施鑒定、評(píng)價(jià)[8-12]。本文采用核磁共振標(biāo)準(zhǔn)壓制水峰方法和標(biāo)準(zhǔn)加入法，定性、定量獲得葡萄酒中非目標(biāo)物質(zhì)信息，以期實(shí)現(xiàn)葡萄酒的日常檢測(cè)和生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

通山紅原漿山葡萄酒（樣品記為T(mén)T，標(biāo)示成分為山葡萄、白砂糖、食品添加劑，酒精度7%vol）：通化通天酒業(yè)有限公司；通化原汁山水果配制酒[樣品記為T(mén)H，標(biāo)示成分為水、葡萄汁、果葡糖漿、食用酒精、食品添加劑（檸檬酸、檸檬酸鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、糖精鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、焦糖色、莧菜紅）、食用香精，酒精度2%vol、糖度≤200 g/L]：通化通池山葡萄酒有限公司；重水（氘含量99.9%）：Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AV300 NEO 核磁共振波譜儀、5 mm BBO 探頭：Bruker BioSpin 公司；QP2010PLUS 氣相色譜質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀：日本島津公司；Vortex-Genie2 渦旋振蕩器：Scientific Industries 公司；高硼硅玻璃核磁管：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 測(cè)定條件

核磁共振譜儀觀察頻率為300.130，脈沖序列采用topspin 4.02 參數(shù)組，激發(fā)脈沖角度30°，時(shí)間域數(shù)據(jù)點(diǎn)32 k，累計(jì)采樣次數(shù)16 次，掃描寬度32 768，弛豫延遲時(shí)間64 s，探頭溫度25 ℃，頻率域數(shù)據(jù)點(diǎn)16 k。選擇標(biāo)準(zhǔn)壓制水峰脈沖序列zgcpfqpr（zero go composite pulse frequency presaturation）[13]。

GC-MS：HP-5MS 石英毛細(xì)管柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m），載氣為氦氣，流速為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為280 ℃，分流比為50∶1，采用程序升溫。電子撞擊離子源，電子能量70 eV，離子溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，倍增管電壓1.6 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～550。

1.4 葡萄酒的前處理和測(cè)試流程

在200 mL 圓底燒瓶中分別加入葡萄酒和蒸餾水各50 mL，浸泡在油浴中，用50 mL 量筒接納50 mL 餾分。

取10 μL 餾分，分別加入10、20、30、40、50 μL 甲醇，加入裝有600 mL 重水的5 mm 核磁管中，渦旋振蕩器振蕩5 min，測(cè)試核磁共振氫譜[14]。

葡萄酒樣品加水蒸餾，核磁管中用重水制樣，然后核磁共振儀上機(jī)測(cè)試，最后進(jìn)行譜圖解析，測(cè)試流程見(jiàn)圖1。

圖1 測(cè)試流程Fig.1 Testing flow

取1 mL 未前處理的葡萄酒于10 mL 異辛烷中，配制成500 mg/L 溶液，并稀釋至5 mg/L 用于GC-MS 定性、定量測(cè)試。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)和圖像處理采用Topspin 4.02、Origin 8.1、ChemOffice 14.0、MestReNova 6.1 等軟件。

2 結(jié)果與分析

不同品質(zhì)的葡萄酒的核磁共振氫譜中氫信號(hào)種類(lèi)、強(qiáng)度上有所不同，這為根據(jù)核磁共振氫譜判斷其化學(xué)成分的種類(lèi)、變化提供了可能性[15]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15037—2006《葡萄酒》中，要求葡萄酒中的甲醇含量應(yīng)該控制在400 mg/L 以下。通常情況甲醇等雜醇超標(biāo)較多，無(wú)法通過(guò)人工品嘗來(lái)準(zhǔn)確定量，因此參考GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》，對(duì)葡萄酒中甲醇的定量開(kāi)展方法學(xué)研究，考慮標(biāo)示成分對(duì)核磁共振氫譜的干擾，因此加入與待測(cè)葡萄酒同量的蒸餾水，并蒸餾出等量的餾分，在獲得核磁共振氫譜中，依據(jù)取樣量與氫譜中積分強(qiáng)度的關(guān)系，獲得葡萄酒中甲醇的含量信息，并判定是否能夠進(jìn)入市場(chǎng)進(jìn)行流通。TH 和TT 兩種葡萄酒處理后的核磁共振氫譜見(jiàn)圖2。

圖2 兩種葡萄酒蒸餾后餾分的核磁共振氫譜圖Fig.2 NMR hydrogen spectrum of distillation fractions of TT and TH wines

由圖2 中可以看出，兩種葡萄酒核磁共振氫譜中，氘代溶劑重水殘余水峰化學(xué)位移4.97，甲醇中甲基吸收峰化學(xué)位移3.21（單峰），表明兩種葡萄酒中都含有一定量的甲醇，依據(jù)甲醇甲基與重水殘余氫的積分強(qiáng)度，可以判斷兩種酒的甲醇含量是有差異的，而葡萄酒中甲醇含量一旦超標(biāo)，會(huì)引起頭痛、惡心、嘔吐、視線模糊、腦神經(jīng)受到破壞、腎衰竭等不良反應(yīng)，因此有必要對(duì)葡萄酒中的甲醇進(jìn)行定量，葡萄酒中的水會(huì)影響定量的效果，利用液體核磁共振樣品流動(dòng)性和無(wú)損性的優(yōu)點(diǎn)，定量考察葡萄酒中甲醇及其含量。

依據(jù)液體核磁共振樣品要求，基于標(biāo)準(zhǔn)加入法思路，在10 μL 葡萄酒蒸餾餾分中，加入不同體積甲醇的核磁共振氫譜圖，相應(yīng)的加入量與積分強(qiáng)度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和未處理葡萄酒的氣相色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 核磁共振氫譜圖、擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線和未蒸餾葡萄酒的氣相色譜圖Fig.3 NMR hydrogen spectrum and fitting curve of standard addition in distillate and gas chromatogram of undistilled wine

如圖3B 所示，核磁共振氫譜吸收峰積分強(qiáng)度與甲醇加入量呈線性變化的擬合回歸方程為y=-0.005 24+0.005 94x，擬合度為0.989 43，標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)果表明核磁共振定量檢測(cè)避免了葡萄酒中的水影響定量結(jié)果。TT 葡萄酒的核磁共振氫譜中甲醇積分值為0.03，TH 葡萄酒的甲醇積分值為0.56，代入回歸方程，可以換算得出兩種葡萄酒中甲醇含量均小于400 mg/L，表明兩種葡萄酒的甲醇含量低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。定量核磁得到的TT葡萄酒中甲醇含量結(jié)果與圖3C 所示的TT 葡萄酒樣品氣相色譜的歸一化測(cè)試結(jié)果吻合[16-17]。

酒精、糖和葡萄是釀造葡萄酒關(guān)鍵的組分[18-21]，當(dāng)需要驗(yàn)證葡萄酒是否符合標(biāo)簽說(shuō)明時(shí)，選擇合適的判定手段，利于節(jié)約檢測(cè)成本和時(shí)間。由于直接測(cè)試葡萄酒的核磁共振氫譜，其中水吸收峰掩蓋了一些信息，因此葡萄酒的非目標(biāo)物質(zhì)核磁共振分析[22-24]中采用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列預(yù)飽和壓制水峰，兩種葡萄酒的壓制水峰后的核磁共振氫譜見(jiàn)圖4 和圖5。

圖4 TT 葡萄酒的壓制水峰后核磁共振氫譜圖Fig.4 NMR hydrogen spectrum of TT wine after water suppression

圖5 TH 葡萄酒的壓制水峰后核磁共振氫譜圖Fig.5 NMR hydrogen spectrum of TH wine after water suppression

圖5 為完全壓制了水峰，去水峰效果好于圖4。壓制后葡萄酒的核磁共振氫譜信噪比與圖1、圖2 比得到提高，這有利于葡萄酒中的非目標(biāo)物質(zhì)的信息解析。圖4 是TT 葡萄酒的核磁共振氫譜，以化學(xué)位移4.97 位置處水吸收峰定標(biāo)，除了水，主要組分乙醇的甲基三重峰化學(xué)位移為1.16（偶合常數(shù)5 Hz），乙基的四重峰化學(xué)位移為3.635（偶合常數(shù)5 Hz）。根據(jù)GB/T 15037—2006 《葡萄酒》規(guī)定的葡萄酒酒精度不低于7%vol，酒精度7%vol 表明20 μL TT 葡萄酒中含0.7 μL（0.55 mg）的乙醇，由于葡萄酒樣中乙醇含量不足1 mg，TT 葡萄酒的核磁共振氫譜的乙醇中甲基峰的三重峰呈現(xiàn)衛(wèi)星峰，化學(xué)位移為1.04（三重峰，偶合常數(shù)3 Hz）、1.29（三重峰，偶合常數(shù)3 Hz）。化學(xué)位移2.785（二重峰，偶合常數(shù)15 Hz）、2.925（二重峰，偶合常數(shù)15 Hz）位置處的兩個(gè)雙重峰是檸檬酸的特征吸收峰，與標(biāo)示成分中的食品添加劑項(xiàng)對(duì)應(yīng)?；瘜W(xué)位移1.98～1.95（多重峰），1.73～1.69（多重峰），1.58～1.54（多重峰），3 組多重峰是來(lái)自標(biāo)示成分中的葡萄汁中脯氨酸的吸收峰?；瘜W(xué)位移2.07 處單峰是乙酸的吸收峰，化學(xué)位移1.845（二重峰）處是乳酸吸收峰，乙酸和乳酸是風(fēng)味有關(guān)的食品添加劑。根據(jù)GB 13104—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食糖》中白砂糖定義，化學(xué)位移5.210（二重峰，偶合常數(shù)5 Hz）、4.625（二重峰，偶合常數(shù)10 Hz）處兩個(gè)二重峰分別是白砂糖的端基質(zhì)子吸收峰，化學(xué)位移4.02、3.89、3.86、3.81、3.78、3.68、3.55、3.47 是標(biāo)示成分的白砂糖的非端基質(zhì)子吸收峰。化學(xué)位移4.09、3.99、3.97、3.70、3.69、3.53、3.43、3.40、3.38、3.22 是標(biāo)示成分中的葡萄中糖分吸收峰。另外，低場(chǎng)區(qū)化學(xué)位移高于6的吸收峰來(lái)源于葡萄中色素、糖苷、黃酮等。因?yàn)楹舜殴舱駜x本身較低的靈敏度，不能辨識(shí)葡萄酒中添加劑涉及色度、香味等其他成分。綜上，TT 葡萄酒核磁共振氫譜信息與其標(biāo)示成分基本吻合。

如圖5 所示，以化學(xué)位移4.97 位置處水吸收峰定標(biāo)，TH 葡萄酒中的乙醇的甲基呈現(xiàn)三重峰化學(xué)位移1.16（三重峰，偶合常數(shù)5 Hz），乙基呈現(xiàn)四重峰化學(xué)位移3.635（四重峰，偶合常數(shù)5 Hz），對(duì)應(yīng)TH 葡萄酒標(biāo)示成分中的食用酒精。酒精度2%vol 表明20 μL TH葡萄酒中含0.2 μL（0.16 mg）的乙醇。因?yàn)樵赥H 葡萄酒中乙醇的量不足1 mg，乙醇中甲基峰也呈現(xiàn)衛(wèi)星峰，化學(xué)位移為1.03（三重峰，偶合常數(shù)3 Hz）、1.28（三重峰，偶合常數(shù)3 Hz）?；瘜W(xué)位移0.87（二重峰，偶合常數(shù)10 Hz）、1.115（二重峰，偶合常數(shù)5 Hz）、1.365（二重峰，偶合常數(shù)5 Hz）位置處的3 個(gè)二重吸收峰與標(biāo)示成分中的甜蜜素對(duì)應(yīng)。化學(xué)位移2.785（二重峰，偶合常數(shù)15 Hz）、2.925（二重峰，偶合常數(shù)15 Hz）位置處2個(gè)二重吸收峰對(duì)應(yīng)檸檬酸的特征吸收峰?；瘜W(xué)位移2.06（單峰）、2.63（單峰）位置處2 個(gè)單峰分別對(duì)應(yīng)乙酸和琥珀酸的吸收峰（未見(jiàn)于標(biāo)示成分，非目標(biāo)物質(zhì)的指認(rèn)成分）。化學(xué)位移5.205（二重峰，偶合常數(shù)5 Hz）、4.62（二重峰，偶合常數(shù)10 Hz）是典型糖的α，β兩種構(gòu)型的端基質(zhì)子，結(jié)合化學(xué)位移3.22（三重峰，偶合常數(shù)10 Hz）、3.41、3.48、3.89 處吸收峰，對(duì)應(yīng)著葡萄酒甜度的標(biāo)示成分中的果葡糖漿。可能受核磁共振儀儀器靈敏度限制，TH 葡萄酒中未見(jiàn)標(biāo)示成分葡萄汁中的脯氨酸、糖精鈉、苯甲酸鈉、三氯蔗糖、山梨酸鉀的吸收峰。另外，TH 葡萄酒標(biāo)示糖度≤200 g/L，屬于甜葡萄酒，糖度高，使得核磁共振氫譜中的糖部分吸收峰信噪比高（可能是影響圖5 比圖4 的壓制水峰效果好的因素）。TH 葡萄酒核磁共振氫譜信息與其的標(biāo)示成分大部分吻合，也有一定差異，這為快速、準(zhǔn)確判定葡萄酒品質(zhì)提供依據(jù)。

3 結(jié)論

綜上研究結(jié)果表明，對(duì)葡萄酒簡(jiǎn)單前處理后，使用核磁共振儀實(shí)現(xiàn)在一次分析過(guò)程中對(duì)葡萄酒中不具有紫外吸收的一些成分的非目標(biāo)物質(zhì)指認(rèn)，并實(shí)現(xiàn)葡萄酒中甲醇定量分析。從核磁共振氫譜中辨識(shí)葡萄酒中的酸度添加劑、糖度、葡萄汁液等信息。確認(rèn)葡萄酒核磁共振氫譜的非目標(biāo)物質(zhì)分析，有助于認(rèn)證不同來(lái)源的葡萄酒樣品，以區(qū)分品種、年份或地理位置信息。