董金婭，何小芳，杜曉翠，方崇業(yè)，3*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省茶深加工工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

肥胖是一種由代謝紊亂引起的慢性疾病，會(huì)增加罹患一些并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，如心血管疾病、2 型糖尿?。╠iabetes mellitus type 2，T2DM）、高脂血癥、高血壓、心臟病和動(dòng)脈粥樣硬化等[1-2]。長(zhǎng)期食用富含脂肪的食物會(huì)導(dǎo)致肥胖，從而引起代謝紊亂和血脂異常，其特征是脂肪堆積、葡萄糖代謝紊亂、胰島素抵抗、低度炎癥和血脂異常[3]，其中血脂異常的特征是總膽固醇（triglyceride，TC）、甘油三酯（total cholesterol，TG）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）水平升高，高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoproteincholesterol，HDL-C）水平降低[4]，這是能量攝入和能量消耗不平衡的結(jié)果[5-7]。2016 年約有19 億18 歲及以上的成年人超重，據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）估計(jì)，到2025 年，大約有1.67 億人（成人和兒童）將因超重或肥胖而影響身體健康[8]，使引發(fā)代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)增加[9]。目前，常見治療糖尿病的藥物有二甲雙胍、吡格列酮和磺胺類等，但這些降糖藥物普遍存在增加體重、產(chǎn)生耐藥性和導(dǎo)致低血糖等副作用[10-12]，因此需尋找有效、副作用低和耐受性更強(qiáng)的抗肥胖劑[13]。

茶堿和可可堿是天然的甲基黃嘌呤生物堿，二者互為同分異構(gòu)體[14-15]。前者主要存在于茶葉中，后者主要存在于可可種子、豆類和山茶科植物的葉子中[1，16]。茶堿具有強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、松弛支氣管平滑肌、興奮中樞神經(jīng)和抗炎等作用，可以用于治療支氣管哮喘、肺氣腫、支氣管炎和心臟性呼吸困難[17-20]。可可堿具有舒張腦血管、利尿、保護(hù)牙齒[21]、增加HDL-C[22]和抑制脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)[23]等作用。研究發(fā)現(xiàn)，茶堿有作為治療胰島素抵抗和高血糖癥候選治療劑的潛力[24]，但關(guān)于茶堿和可可堿對(duì)小鼠體質(zhì)量和胰島素抵抗影響的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究使用高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導(dǎo)C57BL/6J 小鼠建立肥胖模型，通過測(cè)定茶堿和可可堿對(duì)小鼠的體質(zhì)量、空腹血糖水平和胰島素抵抗等的影響，為茶堿和可可堿能否降脂減肥和緩解胰島素抵抗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶堿（純度≥99%）：上海麥克林生化科技股份有限公司；可可堿（純度>98%）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；雄性C57BL/6J 小鼠[6 周齡，體質(zhì)量18～25 g，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（川）2020-030]：成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；高脂飼料（D12492，60%熱量來源于脂肪）、低脂飼料（D12450J，含10%脂肪的嚙齒動(dòng)物飲食）：美國(guó)Research Diets 公司。

葡萄糖粉劑：福州海王福藥制藥有限公司；胰島素注射液（H10890001）：江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

血糖儀（GA3 型）、血糖試紙條：三諾生物傳感股份有限公司；分析天平（FA1004N）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；解剖鑷-直（F12029-09）、IRIS 眼科鑷-彎（F120007-10）、手術(shù)剪-直/尖頭（S14014-11）：昆明迪然科技有限公司；低速離心機(jī)（SC-36）：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型及給藥

動(dòng)物飼養(yǎng)溫度（24±1）℃，相對(duì)濕度50%～60%，在無病原體設(shè)施中12 h 晝/夜循環(huán)，可以自由獲得食物和水。7 d 適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將小鼠隨機(jī)分為6 組，3 個(gè)低脂飲食（low-fat diet，LFD）組，3 個(gè)高脂飲食（high-fat diet，HFD）組。分別為L(zhǎng)FD 組（n=8）、LFD+茶堿組（0.5 mg/mL，n=8）、LFD+可可堿組（0.5 mg/mL，n=9）、HFD 組（n=8）、HFD+茶堿組（0.5 mg/mL，n=8）和HFD+可可堿組（0.5 mg/mL，n=9）。將茶堿和可可堿分別加入小鼠飲用水中，配制成0.5 mg/mL 溶液滅菌后給小鼠自由飲用，持續(xù)給藥16周。每周定期測(cè)量小鼠體質(zhì)量、空腹血糖（禁食13 h，尾部靜脈采血測(cè)定）、飲水量和食物攝入量[25]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)的協(xié)議。

1.3.2 腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)和腹腔胰島素耐受試驗(yàn)

第14 周進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT），小鼠禁食13 h，注射葡萄糖溶液前測(cè)量并記錄小鼠的空腹血糖和體質(zhì)量。葡萄糖溶液（原液濃度0.5 g/mL，注射濃度1 g/kg）在30 min內(nèi)全部注射完成，用血糖儀測(cè)量0、30、60、90 min 和120 min 時(shí)的血糖值，分別為y0min、y30min、y60min、y90min、y120min，并根據(jù)結(jié)果繪制折線圖，計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC）[26-27]，計(jì)算公式如下。

A=15×（y0min+2y30min+2y60min+2y90min+y120min）

式中：A 為曲線下面積，min·（mmol/L）。

第15 周進(jìn)行腹腔胰島素耐受試驗(yàn)（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT），小鼠不禁食，注射胰島素溶液（原液濃度40 U/mL，注射體質(zhì)量0.75 U/kg），并使用血糖儀測(cè)量小鼠在0、30、60、90 min 和120 min 時(shí)的血糖值，并根據(jù)結(jié)果繪制折線圖，計(jì)算AUC[28]。

1.3.3 解剖和采血

第16 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，收集血液樣本，4 ℃靜置1 h，5 000 r/min 離心收集上清液。迅速解剖小鼠，取小鼠腹股溝脂肪、附睪脂肪和肝臟，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗干凈，再稱質(zhì)量，按如下公式計(jì)算小鼠臟器系數(shù)，將組織分裝至離心管轉(zhuǎn)入-80 ℃保存待用。

I=（G0/G）×100

式中：I 為小鼠臟器系數(shù)，%；G0為小鼠各組織質(zhì)量，g；G 為小鼠體質(zhì)量，g。

1.3.4 小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)

小鼠血清送于云南省昆明市第二人民醫(yī)院進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目為甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均來源于3 個(gè)以上重復(fù)試驗(yàn)的平均值，采用GraphPad Prism 9.0 和Adobe Illustrator 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，組間比較采用one-way ANOVA和Tukey's test 分析，p<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶堿和可可堿對(duì)小鼠體質(zhì)量、空腹血糖、飲水量和攝食量的影響

為了探究茶堿和可可堿對(duì)小鼠體質(zhì)量和空腹血糖的影響，每周對(duì)各組小鼠體質(zhì)量和空腹血糖進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 茶堿和可可堿對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of theophylline and theobromine on body mass of mice

圖2 茶堿和可可堿對(duì)小鼠空腹血糖的影響Fig.2 Effects of theophylline and theobromine on fasting blood glucose in mice

C57BL/6J 肥胖小鼠模型建立成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)是高脂飲食組平均體質(zhì)量高于對(duì)照組20%[29]。由圖1 可知，HFD 飲食誘導(dǎo)16 周后，HFD 組小鼠平均體質(zhì)量高于LFD 組21.05%，證明肥胖模型誘導(dǎo)成功。圖1 結(jié)果顯示，茶堿給藥1 周后，對(duì)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)出現(xiàn)了明顯抑制作用。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，與LFD 組相比，LFD+茶堿組降低小鼠體質(zhì)量的范圍在4.89%～16.28%；與HFD 組相比，HFD+茶堿組降低小鼠體質(zhì)量的范圍在7.86%～30.81%，表明茶堿能有效抑制HFD 誘導(dǎo)小鼠的體質(zhì)量的增加。可可堿對(duì)小鼠的體質(zhì)量無抑制作用，而且從第11 周開始，HFD+可可堿組小鼠體質(zhì)量超過HFD 組，11～16 周高于HFD 組4.56%～15.59%，表明可可堿可能會(huì)導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量增加。由圖2 可知，與LFD 組相比，茶堿和可可堿對(duì)小鼠的空腹血糖水平?jīng)]有表現(xiàn)出持續(xù)穩(wěn)定的抑制作用；與HFD 組相比，HFD+茶堿組在8～13 周和15～16周的小鼠空腹血糖水平低于HFD 組，而HFD+可可堿組對(duì)小鼠空腹血糖的沒有抑制作用。

各組小鼠的食物攝入量和飲水量的結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 小鼠16 周內(nèi)平均攝食量Fig.3 Average feed intake of mice during 16 weeks

圖4 小鼠16 周內(nèi)平均飲水量Fig.4 Average water intake of mice during 16 weeks

由圖3 可知，與LFD 組相比，LFD+茶堿組的小鼠攝食量高度顯著增加13.03%（p<0.001）；與HFD 組相比，HFD+茶堿組小鼠攝食量沒有明顯差異，表明茶堿降低小鼠體質(zhì)量與食物攝入多少無關(guān)，反映茶堿不是通過抑制小鼠食欲來減肥。由圖4 可知，與LFD 組相比，LFD+茶堿組的小鼠飲水量高度顯著增加49.26%（p<0.001）；與HFD 組相比，HFD+茶堿組的小鼠飲水量高度顯著增加79.14%（p<0.001），表明食用茶堿可能會(huì)引起小鼠饑渴，而可可堿對(duì)小鼠攝食量和飲水量均無明顯影響。

2.2 茶堿和可可堿對(duì)小鼠葡萄糖耐受性和胰島素敏感性的影響

肥胖常伴有糖代謝異常，血糖升高的肥胖者中大多存在胰島素抵抗[30-31]。發(fā)生胰島素抵抗，葡萄糖耐量必然受損，通常伴隨著高血糖、高血脂和高血壓的發(fā)生[32]。因此，研究通過IPGTT 和IPITT 進(jìn)一步評(píng)估茶堿和可可堿對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的影響，結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 茶堿和可可堿對(duì)小鼠葡萄糖耐受性的影響Fig.5 Effects of theophylline and theobromine on glucose tolerance in mice

圖6 茶堿和可可堿對(duì)小鼠胰島素敏感性的影響Fig.6 Effects of theophylline and theobromine on insulin sensitivity in mice

由圖5A 可知，在測(cè)血糖時(shí)間為30 min 時(shí)，各組小鼠血糖濃度達(dá)到峰值，HFD 組和HFD+可可堿組血糖水平較高。在30 min 和60 min 時(shí)，LFD+茶堿組血糖水平分別極顯著低于LFD 組26.93%（p<0.01）、26.79%（p<0.01），在90 min 和120 min 時(shí)，LFD+茶堿組血糖水平分別顯著低于LFD 組20.65%（p<0.05）、25.54%（p<0.05）。在30～120 min 期間，HFD+茶堿組血糖水平明顯低于HFD 組（20.99%～38.65%）。由圖5B 可知，LFD+茶堿組的葡萄糖耐受AUC 低于LFD 組24.37%；與HFD組相比，HFD+茶堿組的葡萄糖耐受AUC 極顯著降低27.18%（p<0.01）。結(jié)果表明，茶堿給藥組的小鼠機(jī)體自身能更快產(chǎn)生胰島素降低血糖，從而維持自身血糖水平，說明茶堿可以緩解HFD 誘導(dǎo)小鼠的葡萄糖耐受性。而在30～120 min，HFD+可可堿組的IPGTT 血糖水平比HFD 組高，AUC 也比HFD 組高，表明可可堿可能會(huì)使HFD 誘導(dǎo)小鼠糖耐量受損更加嚴(yán)重。

由圖6A 可知，在30、60 min 和90 min 時(shí)，LFD+茶堿組血糖水平分別高度顯著低于LFD 組37.92%（p<0.001）、51.73%（p<0.001）和52.85%（p<0.001），在120 min 時(shí)，LFD+茶堿組血糖水平極顯著低于LFD 組47.36%（p<0.01）。在30 min 和60 min 時(shí)，HFD+茶堿組血糖水平分別顯著低于HFD 組29.48%（p<0.05）、45.48%（p<0.05），在90 min 時(shí)，HFD+茶堿組血糖水平極顯著低于HFD 組49.77%（p<0.01）。由圖6B 可知，LFD+茶堿組AUC 極顯著低于LFD 組38.02%（p<0.01），HFD+茶堿組極顯著低于HFD 組36.41%（p<0.01）。結(jié)果表明，注射胰島素后茶堿給藥的小鼠血糖水平下降更快，對(duì)胰島素敏感性的反應(yīng)更迅速，可以有效緩解HFD 誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的胰島素抵抗。而HFD+可可堿組血糖水平在30～120 min 期間比HFD 組高，AUC 也比HFD 組高，表明可可堿不僅不能緩解HFD誘導(dǎo)小鼠的胰島素抵抗，反而會(huì)使HFD 小鼠胰島素抵抗更加嚴(yán)重。

2.3 茶堿和可可堿對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

對(duì)各組小鼠的器官進(jìn)行稱重，計(jì)算小鼠臟器系數(shù)，結(jié)果見圖7。

圖7 茶堿和可可堿對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響Fig.7 Effects of theophylline and theobromine on organ indexes in mice

由圖7 可知，與LFD 組相比，LFD+茶堿組小鼠的腹股溝脂肪系數(shù)降低53.08%，附睪脂肪系數(shù)極顯著降低57.20%（p<0.01）。與HFD 組相比，HFD+茶堿組小鼠的腹股溝脂肪系數(shù)高度顯著降低64.16%（p<0.001），附睪脂肪系數(shù)降低27.28%。結(jié)果表明，茶堿可以降低小鼠腹股溝脂肪和附睪脂肪堆積，且HFD+茶堿組的腹股溝脂肪系數(shù)和附睪脂肪系數(shù)低于HFD 組，表明茶堿的降脂作用效果很好?？煽蓧A對(duì)小鼠腹股溝脂肪和附睪脂肪無抑制作用，與HFD 組相比，HFD+可可堿組的腹股溝脂肪系數(shù)和附睪脂肪系數(shù)反而有升高的趨勢(shì)。與HFD 組相比，HFD+茶堿組和HFD+可可堿組降低了小鼠肝臟系數(shù)，但效果不顯著。

2.4 茶堿和可可堿對(duì)小鼠ALT、AST 活力和血脂指標(biāo)的影響

肥胖常伴隨著血脂異常，會(huì)引發(fā)心血管疾病。因此檢測(cè)了各組小鼠血脂指標(biāo)和AST、ALT 活力，結(jié)果見圖8、圖9。

圖8 茶堿和可可堿對(duì)小鼠血脂指標(biāo)的影響Fig.8 Effects of theophylline and theobromine on blood lipid indicators in mice

圖9 茶堿和可可堿對(duì)小鼠ALT 和AST 活力的影響Fig.9 Effects of theophylline and theobromine on ALT and AST activity in mice

由圖8 可知，與LFD 組相比，LFD+茶堿組小鼠血清的TC 和HDL-C 濃度分別高度顯著降低31.56%（p<0.001）、24.46%（p<0.001），LDL-C 極顯著降低33.33%（p<0.01）；與HFD 組相比，HFD+茶堿組小鼠血清的TG 濃度極顯著降低25.65%（p<0.01），TC 和LDL-C 濃度分別顯著降低30.38%（p<0.05）、43.09%（p<0.05）。結(jié)果表明，茶堿能降低HFD 誘導(dǎo)小鼠血清的TG、TC、LDL-C 濃度，但也會(huì)降低HDL-C 濃度，因此，關(guān)于茶堿對(duì)HFD 誘導(dǎo)小鼠的血脂代謝可能有利也有弊。

由圖9 可知，與LFD 組相比，LFD+茶堿組小鼠血清的ALT 活力顯著降低46.27%（p<0.05），AST 活力降低16.96%；與HFD 組相比，HFD+茶堿組小鼠血清的ALT 活力高度顯著降低45.77%（p<0.001），但對(duì)AST 活力無明顯影響。結(jié)果表明，茶堿可以降低HFD 飲食誘導(dǎo)小鼠血清的ALT 活力，但對(duì)AST 活力無影響?？煽蓧A對(duì)HFD 飲食小鼠血清的ALT、AST 活力和血脂指標(biāo)均無抑制作用。

3 討論與結(jié)論

體質(zhì)量和脂肪系數(shù)是反映小鼠肥胖程度的重要指標(biāo)[31]，在臨床大數(shù)據(jù)中顯示肥胖與糖尿病有密切的相關(guān)性，血糖升高的肥胖者中大多存在胰島素抵抗。此類病癥想要控制好糖尿病，通過預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和減肥是最有效的方法。本研究結(jié)果顯示，與HFD 組相比，茶堿能抑制HFD 誘導(dǎo)小鼠的體質(zhì)量增加，并且降低了小鼠的腹股溝脂肪系數(shù)和附睪脂肪系數(shù)，表明茶堿具有減肥降脂的作用?？煽蓧A雖然和茶堿互為同分異構(gòu)體，但對(duì)小鼠體質(zhì)量和脂肪系數(shù)均無抑制作用。

肥胖是全球公共衛(wèi)生問題之一，通常與代謝性疾病相關(guān)，會(huì)增加2 型糖尿病患者的發(fā)病率和致死率[33-34]。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2 型糖尿病的主要特征，主要表現(xiàn)在胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素敏感性下降，機(jī)體為了保持身體的平衡，通過提高胰島素水平來克服其低下的生物學(xué)效應(yīng)[35]。而胰島素抵抗的發(fā)生與炎癥密切相關(guān)[36]，炎癥因子能干擾胰島素信號(hào)通路傳導(dǎo)[37-39]。已有研究證實(shí)茶堿具有抗炎的功能[20，40]，并且Gepstein 等[4]的研究表明肥胖是全身胰島素敏感性降低的主要決定因素，體重增加會(huì)降低胰島素敏感性，而體重減輕會(huì)增加胰島素敏感性。本研究試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茶堿能抑制HFD 誘導(dǎo)的小鼠肥胖，并且，通過IPGTT 和IPITT 結(jié)果表明，茶堿能緩解HFD誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的胰島素抵抗，而可可堿無抑制作用。

肥胖一般伴隨著血脂紊亂，容易發(fā)生心血管疾病[7]。研究表明茶堿給藥16 周后可以改善HFD 誘導(dǎo)小鼠的血脂水平，它可以降低TG、TC 和LDL-C 的水平?？煽蓧A對(duì)HFD 誘導(dǎo)小鼠的血脂4 項(xiàng)沒有顯著影響，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道的不一致[41-43]。除此之外，本研究結(jié)果顯示，茶堿可以改善HFD 誘導(dǎo)小鼠血清中的ALT 活力，對(duì)AST 活力無影響。ALT 和AST 是診斷肝膽系統(tǒng)疾病中應(yīng)用最廣泛的酶，是判斷肝細(xì)胞受損害程度的敏感指標(biāo)。因此，未來可以通過研究茶堿對(duì)HFD 誘導(dǎo)小鼠肝臟的影響，進(jìn)一步確定茶堿對(duì)非酒精性脂肪肝治療方面是否有益。而可可堿會(huì)升高HFD 誘導(dǎo)小鼠血清中的ALT 和AST 活力，可能會(huì)對(duì)小鼠肝臟造成一定的損傷。

研究表明，茶堿能減輕HFD 誘導(dǎo)引起的小鼠體質(zhì)量增加和胰島素抵抗，但可可堿沒有效果，甚至?xí)黾親FD 誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量增加和胰島素抵抗。其次，茶堿能抑制HFD 誘導(dǎo)的小鼠腹股溝脂肪和附睪脂肪堆積，且能抑制HFD 誘導(dǎo)小鼠的TG、TC、LDL-C 和ALT 升高，而可可堿均無抑制作用。對(duì)于造成兩者功能差異的原因，有待進(jìn)一步研究。