賈漫麗，楊雪，王彬彬，李娜，李季生，范偉*

（1.河北省高校特色蠶桑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所，河北 承德 067000；3.承德醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000）

桑葉蛋白含量高、纖維含量低，不僅是傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)粗飼料的來(lái)源，更是國(guó)家衛(wèi)生部認(rèn)定的功能性食品和藥品重要來(lái)源的原料之一[1]。桑葉蛋白制備活性多肽的發(fā)展?jié)摿薮螅锘钚远嚯氖且活惡?～20 個(gè)氨基酸殘基、對(duì)人體健康有益的蛋白短肽片段，一般其分子量均小于6 kDa[2]。孫崇臻等[3]研究發(fā)現(xiàn)，桑葉蛋白（mulberry leaf protein，MLP）組成成分主要為蛋白質(zhì)和分子量大于6.5 ku 的大分子肽，大分子肽一般不活躍，通過(guò)酶解蛋白質(zhì)的方法可獲得0.6～6.5 ku 的多肽和0.3～0.6 ku 的小肽，而這些肽具備一定的抗炎、降壓、抗氧化、免疫等生物活性。其中，降血壓肽是目前較受關(guān)注的研究焦點(diǎn)之一[4]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin I-convening enzyme，ACE）可抑制具有降壓作用的緩激肽的分解，使血壓升高。食源性ACE 抑制肽是一類大多源自食源性動(dòng)物、植物、微生物等的天然蛋白多肽，可抑制ACE 活性，臨床更安全、無(wú)不良反應(yīng)，是目前ACE 抑制劑領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[5-6]。制備ACE 抑制肽的方法主要有蛋白酶酶解、分離提取、酸水解、發(fā)酵降解、化學(xué)法或脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）重組人工合成法等。其中酶解法為目前多肽制備的主要方法[7-8]，已在米渣、大豆、玉米、小麥等植物源蛋白制備ACE 抑制肽研究中取得了一定進(jìn)展[9-11]。

抗氧化劑可以緩解自由基對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的損傷，目前多為合成抗氧化劑，如丁基羥基甲苯、沒(méi)食子酸丙酯、丁基羥基茴香醚等，雖然非常高效且成本低，但因其具有潛在毒性和致癌風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)致其難以在醫(yī)藥、食品工業(yè)中應(yīng)用[12-14]?？寡趸淖鳛樘烊坏纳锘钚噪?，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、吸收性好、無(wú)免疫原性、性質(zhì)穩(wěn)定，且兼具抗氧化及降血壓和抗癌等功效，因此其在食品及醫(yī)藥開發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊，也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。因此，本研究以桑葉粉中提取的桑葉蛋白為底物，以堿性蛋白酶、中性蛋白酶、芽孢桿菌蛋白酶為內(nèi)切酶酶源，以ACE 抑制活性為指標(biāo)，采用單因素逐級(jí)優(yōu)化的試驗(yàn)方法篩選制備桑葉活性肽的最佳條件，并探討其抗氧化活性，為在臨床及食品領(lǐng)域研發(fā)和應(yīng)用兼具ACE 抑制和抗氧化活性的多功能桑源多肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮桑葉采摘于承德醫(yī)學(xué)院桑樹種質(zhì)資源園，取中部葉位成熟葉，洗凈，60 ℃干燥后粉碎過(guò)60 目篩（蛋白質(zhì)含量198.98 mg/g），-20 ℃密封保存[15]。

堿性蛋白酶（≥200 U/mg，來(lái)源于地衣芽孢桿菌）：上海麥克林生化科技股份有限公司；中性蛋白酶、芽孢桿菌蛋白酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（A2580-0.5UN）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-his-leuhydrate，HHL）：默克Sigma 試劑公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、冰乙酸、乙腈（均為分析純）：阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030 高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器SPD-20AV）： 日本島津公司；AR224CN 分析天平、STARTER3100 精密pH 計(jì)：奧豪斯儀器（上海）有限公司；30ND 中式真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；H1850 臺(tái)式離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)有限公司；VELOCITY 18R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：Dynamica公司；Micro Pure UV/UF 超純水系統(tǒng)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；BHS-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：江陰保利科研器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉粗蛋白提取及多肽制備

粗蛋白提取參照楊晶等[16]的方法，精確稱取100 g桑葉粉，按料液比1∶20（g/mL）加入去離子水2 000 mL，超聲處理40 min，5 000 r/min 離心6 min，取上清液4 ℃冷藏過(guò)夜，用1 mol/L HCl 調(diào)至pH3.0 沉淀蛋白[15]，加去離子水重懸，調(diào)至pH7.0，10 000 r/min 離心5 min 得到沉淀，經(jīng)低溫冷凍干燥得到桑葉蛋白粉，參照GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測(cè)定凱氏定氮法》測(cè)定蛋白質(zhì)含量為518.98 mg/g。蛋白多肽制備采用酶解法，將桑葉蛋白粉作為反應(yīng)底物配制為一定濃度的溶液，按照與底物的質(zhì)量比加入相應(yīng)的蛋白酶，在適合的酶解溫度下水解處理一定時(shí)間，依據(jù)設(shè)定的酶解條件調(diào)節(jié)pH值，酶解結(jié)束后立即沸水浴滅酶10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液待測(cè)。

1.3.2 桑葉蛋白酶解過(guò)程水解度（degree of hydrolysis，DH）測(cè)定

采用pH-Stat 法[17]計(jì)算蛋白酶解過(guò)程的DH，DH 表示水解斷裂的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的百分比，計(jì)算公式如下。

A=（B×N）/（α×m×htot）×100

式中：A 為DH；htot為底物蛋白分子中所含肽鍵總數(shù)，桑葉蛋白7.883 mmol/g；B 為所消耗堿體積，mL；N為堿濃度，moL/L；α 為α-氨基酸平均解離度；m 為底物蛋白含量，g。

1.3.3 桑葉蛋白ACE 抑制肽的制備

堿性、中性、芽孢桿菌蛋白酶針對(duì)酶解pH 值、底物濃度、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間逐一優(yōu)化，其他條件固定不變。設(shè)置底物濃度為5、10、15、20、30 g/L；加酶量為4.5%、6.0%、7.5%、9.0%、10.5%；pH 值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；酶解時(shí)間為5、10、20、30、40、50、60、90 min；中性和堿性蛋白酶的酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃，芽孢桿菌蛋白酶酶解溫度為50、55、60、65、70 ℃。以水解度和ACE 抑制活性為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.4 桑葉蛋白ACE 抑制活性的測(cè)定

參照楊雪等[18]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。酶解樣品稀釋5 倍后進(jìn)行測(cè)定，10 μL 樣品液中加50 μL 6.5 mmol/L HHL，37 ℃溫育6 min，加入20 μL ACE（0.1 U/mL），37 ℃溫育30 min 后，加入85 μL 1.0 mol/L HCl 終止反應(yīng)?？瞻子?0 μL 硼酸鹽緩沖液代替。反應(yīng)液經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC） 法測(cè)定生成馬尿酸的含量。ACE 和HHL 溶液均采用硼酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，含0.3 mol/L NaCl、pH8.3）配制。HPLC 測(cè)定條件：Kromasail-C18 色譜柱，流動(dòng)相為12%乙腈（含0.5%乙酸），柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm；流速為1.0 mL/min。ACE 抑制活性的計(jì)算公式如下。

Y=（A-B）/A×100

式中：Y 為ACE 抑制活性，%；A 為空白組馬尿酸的濃度，mmol/L；B 為樣品組馬尿酸的濃度，mmol/L。

1.3.5 桑葉蛋白抗氧化活性的測(cè)定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

DPPH 自由基清除率測(cè)定參照包黎明等[19]的方法。取酶解液1 mL，加3 mL DPPH 工作液，充分混勻，避光反應(yīng)30 min，517 nm 測(cè)定OD 值。以95%乙醇為對(duì)照，以蒸餾水為空白，DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如下。Y=[1-（A樣品-A對(duì)照）]/A空白×100

式中：Y 為DPPH 自由基清除率，%；A樣品為樣品組517 nm 吸光度；A對(duì)照為95%乙醇在517 nm 下的吸光度；A空白為蒸餾水在517 nm 下吸光度。

1.3.5.2 T-AOC 測(cè)定

采用微量法，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，以Trolox 溶液為陽(yáng)性對(duì)照，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)405nm 下讀取各孔OD 值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用Excel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備桑葉多肽酶解條件的篩選

2.1.1 底物濃度對(duì)多肽ACE 抑制活性和水解度的影響

底物濃度對(duì)多肽ACE 抑制活性和水解度的影響見圖1。

圖1 底物濃度對(duì)多肽ACE 抑制活性和水解度的影響Fig.1 Effect of substrate mass concentration on ACE inhibitory activity and DH of MLP

底物濃度是影響蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的重要因素，由圖1 可知，隨著底物濃度的增加，3 種蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性逐漸升高。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物在底物濃度為5 g/L 時(shí)，ACE 抑制活性為31.65%，低于中性蛋白酶和芽孢桿菌蛋白酶酶解產(chǎn)物，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥?0 g/L 時(shí)，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性升高至75.07%，縮小了與其他兩種酶酶解產(chǎn)物的差距，此時(shí)中性蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性為81.26%，芽孢桿菌蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性為78.16%。但3 種蛋白酶酶解產(chǎn)物在底物濃度30 g/L 與20 g/L 之間ACE 抑制活性均無(wú)明顯變化，說(shuō)明20 g/L 已經(jīng)達(dá)到了桑葉蛋白酶解體系的飽和狀態(tài)，因此可以將20 g/L 作為酶解體系的固定參數(shù)之一。桑葉蛋白DH 隨著底物濃度的增加而逐漸升高，在相同底物濃度下，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度最高，其次是芽孢桿菌蛋白酶，中性蛋白酶的水解度最低。酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性與水解程度并沒(méi)有必然相關(guān)性，蛋白水解程度高并不代表適合分子量大小的活性多肽多，此外還存在產(chǎn)生的活性多肽被進(jìn)一步酶解、降解而失活的可能性，因此，中性蛋白酶更適合桑葉蛋白中ACE 抑制活性肽的釋放。

2.1.2 加酶量對(duì)多肽ACE 抑制活性和水解度的影響

加酶量對(duì)多肽ACE 抑制活性和水解度的影響見圖2。

圖2 加酶量對(duì)多肽ACE 抑制活性和水解度的影響Fig.2 Effects of different enzyme dosage on ACE inhibitory activity and DH of MLP

由圖2 可知，3 種蛋白酶多肽酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性隨加酶量的增加而逐漸升高。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物在加酶量4.5%時(shí)ACE 抑制活性69.00%，在加酶量為10.5%時(shí)ACE 抑制活性增加到76.66%。芽孢桿菌蛋白酶酶解產(chǎn)物在加酶量為7.5%時(shí)，ACE 抑制活性達(dá)到80.61%。隨著加酶量的增加，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的變化不明顯。3 種蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)ACE 活性的抑制活性為中性蛋白酶>芽孢桿菌蛋白酶>堿性蛋白酶。隨著加酶量的增加，蛋白水解度先升高后降低。加酶量為4.5%時(shí)，3 種蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度均較低，但中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度明顯高于其他兩種酶。當(dāng)加酶量達(dá)到7.5%時(shí)，堿性蛋白酶、芽孢桿菌蛋白酶、中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度均達(dá)到平臺(tái)期，分別為19.83%、15.49%和17.80%。加酶量繼續(xù)增加，水解度呈不變或開始緩慢下降。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇加酶量為7.5%。

2.1.3 酶解pH 值對(duì)多肽ACE 抑制活性和桑葉蛋白DH 的影響

酶解pH 值對(duì)多肽ACE 抑制活性和桑葉蛋白DH的影響見圖3。

圖3 酶解pH 值對(duì)多肽ACE 抑制活性和水解度的影響Fig.3 Effect of pH value of enzymatic hydrolysis on ACE inhibitory activity and DH of MLP

由圖3 可知，酸性（pH6.0）環(huán)境下堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性較低，僅為51.47%，低于中性蛋白酶和芽孢桿菌蛋白酶酶解產(chǎn)物，說(shuō)明酸性環(huán)境不適合堿性蛋白酶的酶解。隨著酶解pH 值的增加，ACE 抑制活性升高，在pH8.0 時(shí)達(dá)到峰值72.53%，pH 值繼續(xù)增加，ACE 抑制活性下降，pH10.0 時(shí)降低到67.80%。中性蛋白酶和芽孢桿菌蛋白酶酶解產(chǎn)物均在pH7.0 時(shí)ACE 抑制活性達(dá)到最大值，分別為85.09%、77.35%，在pH6.0～10.0 之間酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性差異不顯著（P>0.05）。隨著酶解pH 值的增加，3 種蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度均呈逐漸上升趨勢(shì)，在pH6.0～7.0 時(shí)，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度較低，僅由3.08%上升到3.97%，而芽孢桿菌蛋白酶和中性蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度均在10%以上，隨著酶解pH 值的增加，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度快速升高，在pH8.0～9.0 時(shí)，3 種酶的酶解產(chǎn)物水解度基本持平。因此，pH8.0 是堿性蛋白酶的最佳蛋白酶解作用條件，而中性蛋白酶和芽孢桿菌蛋白酶酶解pH 值選擇7.0。

2.1.4 酶解溫度對(duì)多肽ACE 抑制活性和桑葉蛋白DH的影響

酶解溫度對(duì)多肽ACE 抑制活性和桑葉蛋白DH的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)多肽ACE 抑制活性和水解度的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity and DH of MLP

溫度是影響酶解效果的重要因素之一，由圖4 可知，3 種蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性隨溫度升高呈先升高后下降的趨勢(shì)。中性蛋白酶和堿性蛋白酶均在酶解溫度55 ℃時(shí)，酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性最高，分別達(dá)到82.47%和72.50%，芽孢桿菌蛋白酶在60 ℃時(shí)，其酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性最大，達(dá)81.88%。隨著酶解溫度的升高，酶解產(chǎn)物的水解度先升高后降低。溫度40℃時(shí)，堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度分別為9.25%和14.72%，在酶解溫度達(dá)到55℃時(shí)達(dá)到最高，分別為13.66%和21.59%，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)酶解產(chǎn)物的水解度開始降低。芽孢桿菌蛋白酶在酶解溫度60 ℃時(shí)，其酶解產(chǎn)物水解度達(dá)到最大值15.80%。因此，后續(xù)試驗(yàn)中芽孢桿菌蛋白酶的酶解溫度選擇60 ℃，中性蛋白酶和和堿性蛋白酶選擇55 ℃。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)桑葉蛋白水解度和多肽ACE 抑制活性的影響

酶解時(shí)間對(duì)桑葉蛋白水解度和多肽ACE 抑制活性的影響見圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)多肽ACE 抑制活性和水解度的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on ACE inhibitory activity and DH of MLP

由圖5 可知，中性蛋白酶和芽孢桿菌蛋白酶酶解5 min 時(shí)，其酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性分別為73.81%和71.91%，酶解50 min 時(shí)中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性最大為81.23%，芽孢桿菌蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性為81.12%，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，ACE 抑制活性變化不顯著。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性在各時(shí)間段均低于其他兩種蛋白酶，酶解50 min 時(shí)ACE 抑制活性為71.03%，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，ACE 抑制活性無(wú)明顯差異。結(jié)果表明中性蛋白酶和芽孢桿菌蛋白酶酶解產(chǎn)物ACE 抑制效果高于堿性蛋白酶。隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的水解度逐漸升高，在5～30 min 時(shí)，蛋白水解速率較快，水解度呈顯著上升趨勢(shì)，隨后水解速率逐漸減慢。堿性蛋白酶、中性蛋白酶酶解50 min 時(shí)酶解產(chǎn)物水解度分別達(dá)到18.42%、21.41%；芽孢桿菌蛋白酶酶解40 min 時(shí)酶解產(chǎn)物的水解度達(dá)到最高17.36%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，水解度變化不明顯。因此，3 種蛋白酶的酶解時(shí)間均選擇50 min。研究表明堿性蛋白酶酶解較長(zhǎng)時(shí)間（>1 h）后，更多的殘留疏水性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)暴露[3]，這也是本研究中90 min 時(shí)堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性雖然遠(yuǎn)低于芽孢桿菌和中性蛋白酶，但其自身長(zhǎng)時(shí)間還會(huì)有較大幅度升高的原因。

2.2 3 種蛋白酶酶解產(chǎn)生桑葉多肽的抗氧化能力

正常機(jī)體在衰老或者患病等狀態(tài)下，機(jī)體的自由基含量上升，此時(shí)若吸收外源性抗氧化劑來(lái)提升機(jī)體抗氧化水平和自由基清除能力，可以有效地緩解氧化壓力、預(yù)防疾病[20]?？寡趸瘎┯刑烊缓腿斯ず铣蓛纱箢?，均可通過(guò)捕獲、中和自由基來(lái)清除其對(duì)人體的傷害，其中天然抗氧化劑臨床應(yīng)用可預(yù)防心臟病、延緩衰老等諸多功效。本研究在2.1 所述的優(yōu)化不同蛋白酶反應(yīng)條件制備ACE 工藝（表1）的基礎(chǔ)上測(cè)定酶解液的DPPH 自由基清除率和T-AOC，結(jié)果見圖6。

表1 3 種蛋白酶用量及反應(yīng)條件Table 1 Dosage and reaction conditions of different proteases

圖6 桑葉蛋白多肽DPPH 自由基清除率和T-AOC 的影響Fig.6 The effect of mulberry leaf protein peptide on DPPH free radical scavenging rate and T-AOC

由圖6 可知，3 種蛋白酶酶解產(chǎn)物均具有一定的DPPH 自由基清除能力，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)生蛋白多肽的DPPH 自由基清除能力為42.38%，低于芽孢桿菌蛋白酶和中性蛋白酶，芽孢桿菌蛋白酶和中性蛋白酶酶解液DPPH 自由基清除能力差異不顯著（p>0.05）。酶解50 min 時(shí)，芽孢桿菌蛋白酶DPPH 自由基清除率為79.44%，中性蛋白酶DPPH 自由基清除率為80.70%。已有研究表明在酶解時(shí)間較短時(shí)，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化能力強(qiáng)于堿性蛋白酶[3，15]，而堿性蛋白酶需較長(zhǎng)酶解時(shí)間（>1 h），才能暴露更多的疏水氨基酸的剩余側(cè)鏈基團(tuán)，由于中性蛋白酶的初始水解能力較強(qiáng)，因此中性蛋白酶比堿性蛋白酶具有更強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力。酶解50 min 堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物總抗氧化能力（2.91 mmol/g）與芽孢桿菌蛋白酶酶解產(chǎn)物的總抗氧化能力（3.08 mmol/g）無(wú)明顯差異。中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的總抗氧化能力最強(qiáng)，為4.47 mmol/g，顯著高于芽孢桿菌蛋白酶和堿性蛋白酶（p<0.05）。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶、中性蛋白酶和芽孢桿菌蛋白酶酶解桑葉蛋白的多肽混合產(chǎn)物均具有ACE 抑制活性，可作為制備桑葉蛋白來(lái)源的ACE 抑制肽的有效蛋白酶。分析pH 值、加酶量等5 個(gè)因素對(duì)DH、ACE 抑制活性的影響，得到了3 種蛋白酶酶解桑葉蛋白制取活性肽的最佳工藝條件。其中，底物濃度對(duì)DH 和ACE 抑制活性的影響最大，因?yàn)槊噶恳欢ǖ拿复俜磻?yīng)中，在一定限度內(nèi)底物的量與速率會(huì)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。超過(guò)該限度后，底物濃度增加，反應(yīng)速率不再加快，酶的作用位點(diǎn)均已經(jīng)飽和，基本達(dá)到平臺(tái)期。研究進(jìn)一步分析了3 種蛋白酶最佳酶解條件下酶解產(chǎn)物的抗氧化能力。3 種酶的產(chǎn)物混合多肽均具有一定抗氧化能力，其中中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的總體抗氧化能力顯著優(yōu)于芽孢桿菌蛋白酶和堿性蛋白酶，可進(jìn)一步用作桑葉蛋白抗氧化多肽的制備酶。

通過(guò)評(píng)價(jià)桑葉蛋白3 種蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性及抗氧化能力，為多用途、深層次、高附加值開發(fā)利用桑葉蛋白資源，緩解優(yōu)質(zhì)蛋白資源的需求及提高桑樹的經(jīng)濟(jì)效益均具有重要意義，同時(shí)也為進(jìn)一步開發(fā)利用桑葉蛋白多肽提供理論依據(jù)。由于蛋白酶種類不同其具有的酶切位點(diǎn)也不盡相同，其多肽混合產(chǎn)物也具有功能可選擇性多、供研究領(lǐng)域廣泛的特點(diǎn)，今后可依據(jù)不同的研究目的而對(duì)其肽混合產(chǎn)物進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)分析以及功能性評(píng)價(jià)。