劉芹，崔筱，吳杰，師子文，胡素娟，宋志波，孔維麗*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）是我國(guó)栽培量第三大的食用菌[1]，不僅含有豐富的維生素、多糖和蛋白質(zhì)等，而且具有顯著的抗病毒、抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性[2]。此外，糙皮側(cè)耳還具有獨(dú)特的風(fēng)味，因而深受消費(fèi)者的喜愛(ài)和認(rèn)可[3]。糙皮側(cè)耳中的風(fēng)味成分包括揮發(fā)性物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)（游離氨基酸、5'-核苷酸等）[4]。糙皮側(cè)耳栽培品種類(lèi)型、栽培方法、采用菌柄或菌蓋以及成熟度對(duì)這些風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生都有重要影響[5]。目前，對(duì)糙皮側(cè)耳的研究主要集中在栽培[6]和生物活性成分上[2]，而新鮮子實(shí)體的風(fēng)味隨子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育而發(fā)生變化的研究鮮有報(bào)道。

已有研究表明，水果、蔬菜及食用菌的成熟、衰老、褐變等生物學(xué)特性與其能量代謝密切相關(guān)[7]。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是生物活性和細(xì)胞功能的重要基礎(chǔ)，是生物體中最重要的高能磷酸鹽化合物[8]。在能量轉(zhuǎn)移過(guò)程中，ATP 會(huì)脫去磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）[8]。細(xì)胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）、三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）、琥珀酸脫氫酶（succinic dehydrogenase，SDH）等能量代謝相關(guān)酶在ATP 合成的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，因而對(duì)生物的能量代謝具有顯著影響[9]。糙皮側(cè)耳子實(shí)體的發(fā)育通常分為3 個(gè)典型的生長(zhǎng)階段，即生長(zhǎng)初期、中期（未成熟期）和成熟期[10]。目前，對(duì)不同成熟度糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體的能量代謝研究相對(duì)較少。

因此，本研究探索不同成熟度的糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中風(fēng)味和能量代謝的變化，以及能量與風(fēng)味的關(guān)系。研究結(jié)果可能對(duì)高風(fēng)味質(zhì)量糙皮側(cè)耳子實(shí)體的獲得提供新的調(diào)控途徑，并為整個(gè)食用菌產(chǎn)業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

糙皮側(cè)耳菌株黑平17-1：河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所選育[（2018）第2018002 號(hào)，河南省種子管理站認(rèn)定品種]，栽培地點(diǎn)為河南農(nóng)科院原陽(yáng)二基地。

1.1.2 試劑

氨基酸、5'-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜級(jí)）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲醇（色譜級(jí)）：美國(guó)Dikma公司；ATP、ADP、AMP 標(biāo)準(zhǔn)品（色譜級(jí)）：北京索萊寶科技有限公司；CCO、ATPase、SDH 酶聯(lián)免疫分析試劑盒：上海江萊生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

5810R 高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf 公司；AL204 電子天平：Mettler-Toledo 儀器（上海）有限公司；ECAN Infinite 200 Pro 多功能酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司；KQ-數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；P393 破壁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；L8900 氨基酸自動(dòng)分析儀：日本Hitachi 公司；UltiMate 3000 高效液相色譜儀：美國(guó)Thermo 公司；7890A 氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 子實(shí)體栽培、樣品采集及預(yù)處理

栽培方法參照Kong 等[3]糙皮側(cè)耳發(fā)酵料栽培技術(shù)。在子實(shí)體發(fā)育的5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)采摘大小一致、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的糙皮側(cè)耳，采收后的子實(shí)體樣品用保鮮袋分裝，再放入加有冰塊的泡沫紙箱，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 游離氨基酸測(cè)定

游離氨基酸的提取和分析參考Liu 等[11]的方法。糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體勻漿（1.0 g）加入100 mmol/L HCl溶液，25 ℃下振蕩30 min。5 000×g 離心10 min 后，取5 mL 上清液加入等量5%磺酰水楊酸溶液中。混合液在25 ℃黑暗中靜置30 min，然后用0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，濾液用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)。游離氨基酸含量以g/kg 表示。

1.2.3 5'-核苷酸測(cè)定

5'-核苷酸的提取和分析參考Liu 等[11]的方法。糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體勻漿（5.0 g）加入20 mL 蒸餾水，煮沸1 min，冷卻后5 000×g 離心10 min，殘?jiān)俅斡谜麴s水提取。合并上清液，用蒸餾水定容至50 mL，微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾。濾液采用裝備有LiChrospher RP-18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的高效液相色譜儀進(jìn)行分析。5'-核苷酸含量以g/kg 表示。

1.2.4 等效鮮味濃度（equivalent umami concentration，EUC）計(jì)算

等效鮮味濃度的計(jì)算參考Yamaguchi 等[12]的方法，以g MSG/100 g 表示。

Y=∑aibi+1 218∑aibi∑ajbj

式中：Y 為混合物的EUC，g MSG/100 g；ai為單個(gè)鮮味氨基酸（Glu 或Asp）的濃度，g/100 g；aj為單個(gè)鮮味5'-核苷酸（5'-GMP、5'-IMP 或5'-XMP）的濃度，g/100 g；bi為單個(gè)鮮味氨基酸相對(duì)于味精的相對(duì)鮮味值（Asp為0.077；Glu 為1）；bj為單個(gè)鮮味5'-核苷酸相對(duì)于5'-IMP 的相對(duì)鮮味值（5'-IMP 為1. 0；5'-GMP 為2. 3；5'-XMP為0.61）；1 218 為所使用濃度的協(xié)同常數(shù)，g/100 g。

1.2.5 揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

根據(jù)Liu 等[13]的方法，采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀（headspace solid phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）對(duì)糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取。GC-MS 分析在裝備有DB-5 ms 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 m×0.25 μm）的氣質(zhì)聯(lián)用儀上進(jìn)行。揮發(fā)性物質(zhì)含量按面積歸一化法進(jìn)行定量分析。

P=（A/T）×100

式中：P 為各分離組分相對(duì)含量，%；A 和T 分別為各分離組分的峰面積和總峰面積。

1.2.6 AMP、ADP 和ATP 含量及能荷分析

ATP、ADP 和AMP 的提取和測(cè)定參考Liu 等[13]的方法。糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體勻漿（5.0 g）與6 mL 0.6 mol/L預(yù)冷KClO4混合，冰浴抽提。9 000×g、4 ℃離心10 min后，在上清液（3 mL）加入1.0 mol/L KOH 使溶液pH 值降至6.8，冰上靜置30 min 以沉淀KClO4。9 000×g、4 ℃離心5 min，上清液采用蒸餾水定容至5 mL。0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，采用裝備有Agilent ZORBAX Extend-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）的高效液相色譜儀測(cè)定ATP、ADP 和AMP 的含量。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行AMP、ADP 和ATP 的鑒定和量化，并以mg/kg表示。能荷（energy charge，EC）計(jì)算公式如下。

E=（T+0.5D）/（T+D+M）

式中：E 為能荷，mg/kg；T、D 和M 分別為ATP、ADP和AMP 的含量，mg/kg。

1.2.7 能量代謝相關(guān)酶活性測(cè)定

SDH、CCO、H+-ATPase、Ca2+-ATPase 4 種與能量代謝相關(guān)酶的活性采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。將新鮮平菇子實(shí)體（5.0 g）加入25 mL 預(yù)冷生理鹽水，勻漿，4 ℃提取8 h。9 000×g、4 ℃離心10 min，收集上清液用于酶活測(cè)定。每單位（U）的CCO 活性表示使550 nm 處吸光度每分鐘增加0.01 所需酶量；每單位（U）的SDH 活性表示使600 nm 處吸光度每分鐘增加0.01 所需酶量；每單位（U）的ATPase 活性表示每分鐘催化釋放1 μmol 磷酸基團(tuán)所需酶量。采用Bradford 法測(cè)定可溶性蛋白含量[14]。酶活性以U/mg 蛋白表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖表采用Microsoft Excel 2016 構(gòu)建。使用SPSS v.20 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），使用Duncan's post-hoc tests 進(jìn)行顯著性分析，P<0.05 表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線

5 個(gè)不同成熟度的糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體外觀如圖1a 所示，子實(shí)體平均質(zhì)量如圖1b 所示。

圖1 不同成熟度糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體外觀和平均質(zhì)量Fig.1 Appearance and average weight of Pleurotus ostreatus harvested at different stages of maturity

由圖1a 可知，子實(shí)體疊生，菌蓋扇形，黑灰色。菌柄于T1 時(shí)期形成，至T5 時(shí)期完全伸展。T5 時(shí)期，子實(shí)體完全成熟，菌蓋邊緣上卷，菌褶完全打開(kāi)，孢子大量彈射。由圖1b 可知，子實(shí)體的初級(jí)發(fā)育階段（T1～T3）為緩慢生長(zhǎng)階段，中期（T4）和成熟期（T5）為快速生長(zhǎng)階段，此時(shí)子實(shí)體趨于成熟。糙皮側(cè)耳的這種現(xiàn)象與雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）不同，雙孢蘑菇子實(shí)體發(fā)育起始階段生長(zhǎng)極其迅速，菌蓋直徑可在1 d 內(nèi)翻倍。大約在3 d 之后，菌蓋直徑增長(zhǎng)速度放緩為指數(shù)增長(zhǎng)，直至內(nèi)菌幕破裂[15]。

2.2 揮發(fā)性物質(zhì)變化

生物體中天然揮發(fā)性物質(zhì)可用于防御或作為次生代謝產(chǎn)物。揮發(fā)性物質(zhì)通常具有一種獨(dú)特的氣味，可以分散到空氣中，從而顯著影響消費(fèi)者對(duì)食品品質(zhì)的感知[16]。不同成熟度糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中揮發(fā)性物質(zhì)含量如表1 所示。

表1 不同成熟度糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中的揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 1 Content of volatile compounds in Pleurotus ostreatus harvested at different stages of maturity%

由表1 可知，T1、T2、T3、T4 和T5 中分別鑒定出20、25、26、22 種和17 種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括八碳化合物、醛類(lèi)、醇類(lèi)、酮類(lèi)和其他類(lèi)化合物。本研究中，八碳化合物是糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中的主要揮發(fā)性成分，其由酶（如脂氧合酶和過(guò)氧化氫裂解酶）和不飽和脂肪酸（如亞油酸）經(jīng)過(guò)一系列代謝過(guò)程形成。八碳化合物具有較低的氣味閾值，是食用菌獨(dú)特風(fēng)味的主要來(lái)源[17]。糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中八碳化合物占總揮發(fā)性物質(zhì)的87.88%～93.86%。其中常規(guī)采收期即T3 和T4 時(shí)期采收的新鮮子實(shí)體中八碳化合物的相對(duì)含量最高，分別為92.71%和93.86%。本研究中鑒定到的主要八碳化合物為3-辛酮、3-辛醇和1-辛烯-3-醇。其中，1-辛烯-3-醇又稱(chēng)蘑菇醇，主要存在于新鮮食用菌中。T1、T2、T3、T4 和T5 時(shí)期采收的子實(shí)體中，其相對(duì)含量分別為13.58% 、49.97% 、18.02% 、14.00% 和42.50%，呈先增加后降低再增加的趨勢(shì)，T2 和T5 時(shí)期的1-辛烯-3-醇相對(duì)含量較高。這一結(jié)果與Li 等[18]的研究結(jié)果不同，其發(fā)現(xiàn)松茸（Tricholoma matsutake）中的主要揮發(fā)物1-辛烯-3-醇和肉桂酸甲酯的含量隨著子實(shí)體的老化而逐漸降低。

2.3 游離氨基酸、5'-核苷酸及EUC 的變化

與蔬菜的營(yíng)養(yǎng)成分相似，食用菌的鮮味成分也受其成熟度的影響[19]。不同成熟度糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中游離氨基酸和5'-核苷酸含量如表2 所示。

表2 不同成熟度糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中的游離氨基酸和5'-核苷酸含量Table 2 Contents of free amino acids and 5'-nucleotides of in Pleurotus ostreatus harvested at different stages of maturity g/kg

由表2 可知，糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中含有17 種游離氨基酸。游離氨基酸總含量在20.74～34.87 g/kg 之間，T2 時(shí)期達(dá)到峰值，此后隨子實(shí)體成熟度的提升而顯著降低（P<0.05），該結(jié)果與Tsai 等[20]研究結(jié)果一致。在食用菌和水果中，游離氨基酸含量對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生和積累具有重要影響[16，21]。激活氨基酸降解可以生成三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)中乙酰輔酶A 前體，從而維持能量的產(chǎn)生，并且導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)形成所需特定底物的積累[21]。因此，游離氨基酸含量的變化可能對(duì)糙皮側(cè)耳子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的含量和能量水平的變化有重要影響。味精樣氨基酸，主要指Glu 和Asp，有助于食用菌鮮味特征的形成[22]。在本研究中，T1（8.68 g/kg）和T2（8.52 g/kg）時(shí)期采收的糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中味精樣氨基酸含量較高（P<0.05），后期含量逐漸降低。這一發(fā)現(xiàn)與杏鮑菇中的味精樣氨基酸隨子實(shí)體發(fā)育而呈現(xiàn)的變化趨勢(shì)相似[17，23]。Yang 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，味精樣氨基酸的含量可分為3 個(gè)級(jí)別：低（<5 g/kg）、中（5～20 g/kg）、高（>20 g/kg）。因此，本研究中糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中味精樣氨基酸含量（5.16～8.68 g/kg）所處級(jí)別為中。

除游離氨基酸外，5'-核苷酸也會(huì)對(duì)食用菌的鮮味產(chǎn)生重要影響[22]。不同成熟度的糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中的5′-核苷酸含量具有明顯差異。其中，5′-GMP 和5′-UMP 含量隨成熟度提升而顯著增加，T3 時(shí)期達(dá)到峰值（分別為0.88 g/kg 和0.33 g/kg），此后逐漸下降。5′-CMP 含量隨子實(shí)體成熟度的提升則呈降低-升高-降低-升高的趨勢(shì)。T1、T2、T3、T4 和T5 時(shí)期的5′-CMP含量分別為0.26、0.17、0.45、0.33 g/kg 和0.34 g/kg。5'-IMP 和5'-XMP 的含量在各成熟度均較低，且隨成熟度提升而發(fā)生的變化不顯著。因此，它們對(duì)鮮味的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)小于5'-GMP。鮮味5′-核苷酸（5′-GMP、5′-XMP、5′-IMP）含量隨成熟度提升而逐漸增加，并在T3 時(shí)期達(dá)到峰值（0.90 g/kg）。雙孢蘑菇中的鮮味5'-核苷酸含量隨子實(shí)體的發(fā)育也呈現(xiàn)出類(lèi)似的變化趨勢(shì)[20]。但這些結(jié)果與Mau 等[24]的研究結(jié)果不一致，隨著草菇成熟度的提升，總5′-核苷酸和鮮味5′-核苷酸的含量呈逐漸增加的趨勢(shì)。

Mau 等[25]將EUC 劃分為4 個(gè)級(jí)別，I：大于1 000 g MSG/100 g（干重）；II：100～1 000 g MSG/100 g（干重）；III：10～100 g MSG/100g（干重）和IV：小于10 g MSG/100 g（干重）。如表2 所示，糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中的EUC在25.89～111.25 g MSG/100 g（鮮重）之間波動(dòng)，約為209.99～902.26 g MSG/100 g（干重）。因此，糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體的EUC 為II 級(jí)。T3 時(shí)期采收的糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中的EUC 顯著高于其他時(shí)期。傳統(tǒng)糙皮側(cè)耳生產(chǎn)中，糙皮側(cè)耳常于T4 時(shí)期采摘，產(chǎn)量高效益好。而近幾年，消費(fèi)者越來(lái)越青睞T3 時(shí)期采摘的糙皮側(cè)耳，此時(shí)口感更好，這與本研究中T3 時(shí)期采摘的糙皮側(cè)耳具有最高的EUC 相一致。T5 時(shí)期，糙皮側(cè)耳子實(shí)體菌蓋邊緣上卷，菌褶完全暴露，子實(shí)體過(guò)度成熟，EUC 顯著降低。該研究結(jié)果與Tsai 等[20]和Chen 等[23]的結(jié)果不同，不同成熟期采收的雙孢蘑菇和香菇的EUC分別為207～284 g MSG/100 g（干重）和106.8～342.7 g MSG/100 g（干重），其EUC 峰值分別為T(mén)5 和T1 時(shí)期。結(jié)果表明，食用菌鮮味成分的含量因食用菌的成熟階段和品種不同而具有顯著差異。

2.4 AMP、ADP、ATP 含量及能荷

蔬菜、水果和食用菌的發(fā)育、成熟和衰老與其細(xì)胞能量水平密切相關(guān)，而生物體中的能量水平可以采用AMP、ADP、ATP 含量和EC 來(lái)表示[8-9]。不同成熟度糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中AMP、ADP、ATP、總腺苷酸含量以及EC、ATP/AMP 如圖2 所示。

圖2 不同成熟度糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體的能量狀況Fig.2 Energy status of Pleurotus ostreatus harvested at different stages of maturity

如圖2a 所示，T2 時(shí)期的糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中的ATP 含量（17.48 μg/kg）顯著低于T1 時(shí)期（23.06 μg/kg）（P<0.05）。T1 時(shí)期的能量水平高可能是由于糙皮側(cè)耳從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)渡到生殖生長(zhǎng)時(shí)需要大量的能量。子實(shí)體中的ATP 含量在T3 和T4 時(shí)期呈增加趨勢(shì)，并于T4時(shí)期達(dá)到峰值（62.37 μg/kg），此后急劇下降（9.47 μg/kg）。此結(jié)果與Qiu 等[26]的研究結(jié)果類(lèi)似，隨著荔枝果實(shí)發(fā)育，ATP 含量顯著增加，而在衰老過(guò)程中ATP 含量顯著下降。研究表明，細(xì)胞能量的供應(yīng)是控制成熟和衰老的關(guān)鍵因素，水果和蔬菜的軟化和衰老可能與細(xì)胞中能量供應(yīng)不足或其產(chǎn)生效率的降低密切相關(guān)[27]。由圖2b 可知，ADP 含量的變化趨勢(shì)與ATP 含量相似，T4 時(shí)期含量最高（74.43 μg/kg）。由圖2c 可知，AMP 含量呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)，T4 時(shí)期含量最低，為142.75 μg/kg。由圖2d 可知，總腺苷酸含量在幼嫩子實(shí)體中相對(duì)穩(wěn)定，但在T4 時(shí)期急劇增加，T5 時(shí)期則顯著下降。EC 是指總的腺苷酸系統(tǒng)中所負(fù)荷的高能磷酸鍵的數(shù)量（即ATP，ADP 和AMP 含量之和）[8-9]。由圖2e 可知，子實(shí)體中的EC 呈降低再升高后降低的趨勢(shì)，T1～T5 時(shí)期的EC 分別為0.19、0.14、0.18、0.35 和0.07。高水平的EC抑制ATP 的產(chǎn)生，同時(shí)促進(jìn)ATP 的利用，即促進(jìn)機(jī)體的合成代謝[7]。因此，糙皮側(cè)耳子實(shí)體在T3～T5 期間生長(zhǎng)迅速。由圖2f 可知，ATP/AMP 比值在T4 時(shí)期達(dá)到峰值，之后急劇下降，這一現(xiàn)象可能意味著糙皮側(cè)耳孢子即將釋放，子實(shí)體將從成熟轉(zhuǎn)換到衰老，與Wang等[7]的結(jié)果類(lèi)似，荔枝果實(shí)的ATP/AMP 在開(kāi)花后80 d（DAF，八成熟）達(dá)到最大值，此后逐漸下降，直至完全成熟。

2.5 與能量代謝相關(guān)的酶活性

植物細(xì)胞主要通過(guò)線粒體反應(yīng)產(chǎn)生能量，包括線粒體電子傳遞鏈（mitochondrial electron transport chain，mETC）和TCA 循環(huán)[28]。Ca2+-ATPase、H+-ATPase、SDH和CCO 是這些反應(yīng)中的關(guān)鍵酶。Ca2+-ATPase 和H+-ATPase 通過(guò)將ATP 轉(zhuǎn)化為ADP，在能量的合成和供應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[29]。CCO 是一種位于mETC 末端的關(guān)鍵酶，在氧化磷酸化過(guò)程中對(duì)有氧代謝和能量的產(chǎn)生至關(guān)重要[30]。SDH 通過(guò)促進(jìn)琥珀酸向富馬酸的代謝而產(chǎn)生ATP[31]。越來(lái)越多的研究表明，果實(shí)在采前發(fā)育和采后衰老過(guò)程中，參與能量代謝的酶活性發(fā)生了顯著變化[7]。不同成熟度糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中的H+-ATPase、Ca2+-ATPase、CCO 和SDH 活性如圖3 所示。

圖3 不同成熟度糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中能量代謝相關(guān)酶活性Fig.3 Activities of enzymes involved in energy metabolism of Pleurotus ostreatus harvested at different stages of maturity

如圖3 所示，糙皮側(cè)耳子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中Ca2+-ATPase、H+-ATPase、SDH 和CCO 活性發(fā)生了顯著變化。在生長(zhǎng)過(guò)程中，各酶活性均呈現(xiàn)出降低再增加后降低的趨勢(shì)，均在T4 時(shí)期達(dá)到最大值。這與能量狀態(tài)的變化相對(duì)應(yīng)。由此表明，糙皮側(cè)耳子實(shí)體快速生長(zhǎng)時(shí)期TCA 循環(huán)和氧化磷酸化的速率較快，從而導(dǎo)致線粒體能量的產(chǎn)生較多。T5 時(shí)期糙皮側(cè)耳子實(shí)體開(kāi)始衰老，與能量代謝相關(guān)的酶活性則顯著降低（P<0.05），這可能是由于此時(shí)糙皮側(cè)耳的生理代謝發(fā)生了變化，一方面抑制了線粒體內(nèi)的電子傳遞；另一方面促進(jìn)了活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的增加[27]，而過(guò)高的ROS 損害線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步對(duì)線粒體呼吸鏈產(chǎn)生有害影響。因此，T5 時(shí)期采收的糙皮側(cè)耳子實(shí)體能量相關(guān)酶活性和能量水平顯著降低（P<0.05）。近年來(lái)，有關(guān)食用菌、蔬菜和水果采后貯藏過(guò)程中能量狀態(tài)變化的研究報(bào)道較多，而有關(guān)發(fā)育過(guò)程中能量代謝的變化則有待進(jìn)一步研究[8，32]。

2.6 糙皮側(cè)耳風(fēng)味與能量的相關(guān)性

近年來(lái)，鮮味和揮發(fā)性物質(zhì)的研究主要集中在成分和含量的變化上[16]，而有關(guān)食用菌子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中風(fēng)味和能量狀態(tài)之間關(guān)系的研究非常有限。本研究分析了八碳化合物、鮮味成分與能量狀態(tài)之間的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)分析表明，總八碳化合物含量與EC（相關(guān)系數(shù)=0.486，P<0.01）、ATP（相關(guān)系數(shù)=0.428，P<0.05）、ADP（相關(guān)系數(shù)=0.373，P<0.05）顯著相關(guān)。此前有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，外源ATP 通過(guò)調(diào)控LOX 途徑和脂肪酸合成，顯著增加了“南果”梨中總揮發(fā)性酯的含量和種類(lèi)[33]。因此，認(rèn)為糙皮側(cè)耳子實(shí)體發(fā)育過(guò)程中ATP 和EC 的增加，在提高揮發(fā)性物質(zhì)合成相關(guān)酶活性和前體物質(zhì)方面發(fā)揮了重要作用，從而增強(qiáng)了揮發(fā)性物質(zhì)（八碳化合物）的合成能力。此外，EUC 與Asp（相關(guān)系數(shù)=0.906，P<0.01）和Glu（相關(guān)系數(shù)=0.782，P<0.01）含量呈顯著正相關(guān)，同時(shí)也與5'-GMP 含量（相關(guān)系數(shù)=0.913，P<0.01）和5'-UMP 含量（相關(guān)系數(shù)=0.645，P<0.01）呈顯著正相關(guān)。此外，還對(duì)八碳化合物、鮮味成分與能量代謝相關(guān)酶的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，糙皮側(cè)耳的CCO 活性與EUC 顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.472，P<0.01）。這些結(jié)果與Zhang 等[9]的研究結(jié)果不一致，其認(rèn)為秀珍菇的SDH 活性與EUC 顯著相關(guān)（P<0.05），這可能是由于食用菌品種不同。糙皮側(cè)耳CCO 活性與總八碳化合物的含量呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.472，P<0.01），還與GMP 含量（相關(guān)系數(shù)=0.622，P<0.01）、UMP含量（相關(guān)系數(shù)=0.405，P<0.05）和XMP 含量（相關(guān)系數(shù)=0.446，P<0.05）具有顯著的相關(guān)性。據(jù)報(bào)道，Gly、Glu和Asp 可作為合成嘌呤和嘧啶核苷酸的原料，且所有的氨基酸脫氨基后都可以轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，從而參與能量代謝[16]。因此，能量代謝相關(guān)酶（CCO）活性的變化可能直接或間接影響氨基酸和5'-核苷酸的含量，從而改變食用菌的風(fēng)味?；诖?，研究結(jié)果表明糙皮側(cè)耳的風(fēng)味與其能量狀態(tài)密切相關(guān)，并且CCO 可能是影響糙皮側(cè)耳風(fēng)味的關(guān)鍵酶。

3 結(jié)論

不同成熟度的糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體中的風(fēng)味成分（游離氨基酸和5'-核苷酸）和能量代謝成分明顯不同，從而導(dǎo)致糙皮側(cè)耳品質(zhì)具有顯著差異。其中T3 時(shí)期采收的糙皮側(cè)耳新鮮子實(shí)體EUC 最高，而T4 時(shí)期的八碳化合物總含量、能量水平以及能量代謝相關(guān)酶活性最高。此外，糙皮側(cè)耳中的揮發(fā)性物質(zhì)（總八碳化合物）與EC 和能量物質(zhì)含量（ATP 和ADP）顯著相關(guān)（P<0.05）。能量代謝相關(guān)的酶（CCO）活性與EUC 及5'-GMP、5'-UMP、5'-XMP 和總八碳化合物含量具有顯著相關(guān)性，表明CCO 可能是影響糙皮側(cè)耳風(fēng)味的關(guān)鍵酶。然而，還需要進(jìn)一步研究CCO 如何在分子水平上影響糙皮側(cè)耳風(fēng)味。