許慧敏，成穎，崔萌菲，王依婷，李居行，肖逸飛，李貞景，郭慶彬，劉歡歡

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

海洋放線菌是一個(gè)龐大的群體，不僅能應(yīng)對(duì)高鹽、高壓、低溫、低氧等極端環(huán)境，還具備一些獨(dú)特的生理生化特征。為了適應(yīng)海洋的極端環(huán)境，海洋放線菌往往會(huì)進(jìn)化出獨(dú)特的基因型以及代謝途徑，還會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣的生物活性成分，這些獨(dú)特功能賦予了海洋放線菌的多樣性和復(fù)雜性，為各種酶及代謝產(chǎn)物的發(fā)掘提供了天然的篩選寶庫[1-2]。

擬諾卡氏菌（Nocardiopsis）是海洋放線菌中一類較為重要的微生物資源，具有生產(chǎn)多種天然生物活性產(chǎn)物的能力，在農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境等領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力。Nocardiopsis 為革蘭氏陽性菌，該菌株需氧，耐鹽不耐酸，過氧化氫酶陽性，且產(chǎn)生擬諾卡菌型菌絲體，其氣生菌絲體帶有長(zhǎng)鏈孢子[3]，除海洋環(huán)境外，Nocardiopsis還可附生或內(nèi)生于陸地植物中[4]。總結(jié)有關(guān)Nocardiopsis的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)它可產(chǎn)生具有多種生物活性的化合物，特別是各種酶類，如幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、菊粉酶、激酶，具有潛在的農(nóng)業(yè)價(jià)值和食品工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[5]。此外，它還可產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，如聚酮化合物、環(huán)肽、大環(huán)內(nèi)酯類、二酮哌嗪、α-吡喃酮、γ-吡喃酮、生物堿、萘醌、P-糖蛋白抑制劑、吩嗪和吩惡嗪衍生物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物具有廣泛的藥理和生物學(xué)作用，主要為抗菌、抗癌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抑制蛋白激酶等[6-7]，在生物醫(yī)藥與健康產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。

Nocardiopsis 菌株的分離鑒定及抑菌活性研究是目前該菌屬研究的一個(gè)重點(diǎn)。由于其耐鹽、耐堿和耐干燥的特性，使它們?cè)陉懙?、室?nèi)、海洋生態(tài)系統(tǒng)和高鹽度棲息地中均具有不同程度的適應(yīng)性，因而從不同生態(tài)位中獲得的Nocardiopsis 分離株的抑菌特性存在顯著差異。Gopal 等[8]從河南汝南鎮(zhèn)牧場(chǎng)健康山羊糞便中分離出Nocardiopsis 菌屬，其對(duì)細(xì)菌和真菌病原體（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、尖孢鐮刀菌和綠色木霉）具有較強(qiáng)的抑制活性。Schumacher 等[9]從夏威夷考艾島淺水沉積物樣品中獲得一株N.dassonvillei，經(jīng)純化分離得到兩種新型吲哚核苷kahakamides A，它們對(duì)枯草芽孢桿菌具有抑菌活性。Leutou 等[10]從海洋放線菌Nocardiopsis sp.CNQ-115中分離到一種新的十四元環(huán)的內(nèi)酰胺類天然產(chǎn)物fluvirucin B6，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制活性。海綿來源的N.dassonvillei MAD08，其發(fā)酵提取物對(duì)多重耐藥病原菌的抑菌活性為100%，從其發(fā)酵上清液的粗提物分離得到11 種抗菌化合物，同時(shí)包括脂溶性和水溶性抗菌化合物[11]。土壤來源的Nocardiopsis sp.MK_MSt033 可分泌18 種抗菌物質(zhì)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有顯著的抑制效果[12]。

對(duì)抑菌活性物質(zhì)的分離鑒定是天然產(chǎn)物發(fā)掘的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，然而僅利用傳統(tǒng)的分離分析方法獲取新的天然產(chǎn)物已經(jīng)無法滿足發(fā)掘需求。隨著高通量測(cè)序和信息技術(shù)的發(fā)展，微生物基因組測(cè)序數(shù)據(jù)呈指數(shù)增長(zhǎng)，各類次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇?cái)?shù)據(jù)庫變得越來越豐富可用，為新的次級(jí)代謝天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和研究提供了有力的幫助[13]?；蚪M挖掘通過分析基因組序列從而預(yù)測(cè)合成基因，進(jìn)一步篩選具有特定功能的基因或基因簇[14]，根據(jù)編碼蛋白的功能來預(yù)測(cè)合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，最終通過分析預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)尋找化合物，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[15]。其中，antiSMASH 是通過基因組預(yù)測(cè)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇最常用的工具，基于核心保守基因序列，antiSMASH 可以預(yù)測(cè)基因簇類型[16]，還可以對(duì)輔助基因進(jìn)行注釋和分組，將代謝物核心結(jié)構(gòu)最小化，使研究者能夠快速識(shí)別基因組中的生物合成基因簇[17]。目前，基于基因組測(cè)序的代謝產(chǎn)物發(fā)掘技術(shù)已經(jīng)成為研究新型先導(dǎo)藥物的重要組成部分，在天然產(chǎn)物研究中發(fā)揮越來越大的作用。

基于上述背景，本研究將對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的一株海洋放線菌進(jìn)行鑒別，通過對(duì)同源物種的基因組進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇的挖掘，并聯(lián)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[18]，對(duì)潛在的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行推斷，以期為Nocardiopsis 菌屬的抑制活性物質(zhì)發(fā)掘及機(jī)制研究提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

海洋放線菌（Nocardiopsis sp.HM-01）：分離于天津大港鹽湖鹵水；大腸桿菌（Escherichia coli DH5α）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）、假單胞菌（Pseudomonas sp.W407）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus CICC 21617）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum ATCC 19264）、哈維式弧菌（Vibrio harveyi ATCC 33842）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae ATCC 700323）：保藏于天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵食品與新資源開發(fā)研究室。

Nocardiopsis sp.HM-01 培養(yǎng)基為1）搖瓶種子培養(yǎng)基（g/L）:可溶性淀粉10 g，葡萄糖5 g，酵母粉7 g，蛋白胨7 g，NaCl 3 g，KNO33 g，MgSO4·7H2O 0.7 g，CaCO31 g，黃豆粉20 g，初始pH 值為7. 0；2）搖瓶發(fā)酵（RP）培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30 g，可溶性淀粉10 g，酵母粉2.5 g，蛋白胨3 g，黃豆粉35 g，CaCO33.5 g，初始pH 值為7. 0；3）搖瓶發(fā)酵（international Streptomyces project medium No.2，ISP2）培養(yǎng)基：不調(diào)節(jié)pH 值。

指示菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B（Luria-Bertani）培養(yǎng)基（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、假單胞菌、陰溝腸桿菌適用）和2216E 培養(yǎng)基[19]（副溶血弧菌、鰻弧菌、哈維式弧菌適用）。

上述培養(yǎng)基滅菌條件均為0.1 MPa、121 ℃、30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀（HPLC 1200）、紫外分光光計(jì)（Agilent 8453）：美國安捷倫科技有限公司；振蕩培養(yǎng)箱（ZQWY-200N）：上海知楚儀器有限公司；酶標(biāo)儀（Infinite 200PRO）：瑞士Tecan 公司；倒置熒光顯微鏡（EVOS）、掃描電子顯微鏡（FEI Apreo）：美國Thermo Fisher Scientific 公司；超高效液相色譜儀（Nexera 30A）：日本島津公司；三重四極桿質(zhì)譜儀（AB SCIEX TripleTOF 6600）：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察、菌株鑒定和培養(yǎng)

1.3.1.1 菌種制備

將-80 ℃保藏的孢子懸液，取10 μL 涂布于RP 固體培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，獲得新鮮孢子。輕刮一接種環(huán)孢子加到100 mL 液體種子培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min 下培養(yǎng)2 d，獲得種子液。按10%比例接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min 下培養(yǎng)9～15 d，獲得發(fā)酵液進(jìn)行后續(xù)測(cè)試。

1.3.1.2 形態(tài)學(xué)觀察及菌株鑒定

在RP 固體平板上用劃線稀釋法活化Nocardiopsis sp.HM-01 菌株，觀察平板表面形成的菌落形態(tài)，通過倒置熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察菌株的微觀形態(tài)。倒置熒光顯微鏡制片及操作參考余濟(jì)源[20]的方法。掃描電鏡樣品的制片參考范麗霞[21]的方法，將處理好的樣品真空冷凍干燥，取樣均勻粘涂在碳導(dǎo)膠帶上，噴金后在掃描電鏡下觀察菌絲體和孢子的形態(tài)。

菌株16S rDNA 序列的提取[22]及測(cè)序[13]方法：挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌落，采用酚-氯仿法進(jìn)行抽提，氯仿-異戊醇洗脫，乙醇沉淀，三（羥甲基）氨基甲烷-乙二胺四乙酸 [tris（hydroxymethyl）aminomethane-ethylenediaminetetraacetic acid，Tris-EDTA] 緩沖液重懸，-20 ℃進(jìn)行保存。經(jīng)測(cè)序后，通過NCBI blast 程序，對(duì)菌株16S rDNA 序列進(jìn)行比對(duì)，確定目標(biāo)菌株的種屬特性。之后根據(jù)序列同源性選取典型菌株的16S rDNA 序列，在MEGA 7.0 軟件中，采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 抑菌活性的測(cè)定

抑菌樣品制備[23]：取發(fā)酵液加入等體積乙酸乙酯萃取3 次，用高速離心機(jī)（4 000 r/min，20 min）進(jìn)行固液分離，收集有機(jī)相經(jīng)氮吹濃縮得到浸膏，加入1 mL甲醇溶解，存放于4 ℃冰箱，以備后續(xù)試驗(yàn)。

抑菌活性測(cè)定方法：RP、ISP2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別培養(yǎng)Nocardiopsis sp.HM-01，每24 h 取樣1 次，經(jīng)處理獲得抑菌樣品，以革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌樣品測(cè)定放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 對(duì)指示菌的抑菌圈直徑（打孔法[24]）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)繪制生物活性曲線。

抑菌譜測(cè)定：采用打孔法[24]，將供試細(xì)菌接種至LB 培養(yǎng)基（10 mL），在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)10～12 h，測(cè)菌液OD600nm，用無菌水將菌液稀釋至1×106cfu/mL，吸取100 μL 菌液均勻涂布于LB 固體培養(yǎng)基，晾干后在涂布有測(cè)試菌的培養(yǎng)皿上打孔，加入過膜抑菌樣品50 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h 后測(cè)定抑菌圈直徑，以等體積甲醇作為陰性對(duì)照組。

1.3.3 潛在次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇的鑒定

選取Nocardiopsis sp.HM-01 的近緣基因組序列（NCBI Assembly 數(shù)據(jù)庫中的N.dassonvillei，N.albirubida 及N.synnemataformans 的基因組組裝序列），首先利用Ubuntu-linux 本地化的Prokka 軟件[25]對(duì)其進(jìn)行全基因組注釋，之后采用antiSMASH 軟件對(duì)次級(jí)代謝生物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取相似度高于70%的基因簇進(jìn)行代謝產(chǎn)物推測(cè)及液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）檢測(cè)。

1.3.4 抑菌產(chǎn)物鑒定

將發(fā)酵液分別用乙酸乙酯萃取3 次，乙酸乙酯相經(jīng)氮吹濃縮后得到浸膏，取1 mL 甲醇定量溶解。使用超高效液相色譜系統(tǒng)和質(zhì)譜儀對(duì)抑菌樣品進(jìn)行LCMS 分析。

高效液相色譜條件：采用ZIC-HILIC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定。以10 mmol/L 醋酸銨和100%乙腈為流動(dòng)相A 和B，流速為0.2 mL/min，洗脫梯度：0～3 min，90%B；3～6 min，90%～60%B；6～25 min，60%～50%B；25～30 min，50%B；30～30.5 min，50%～90%B；30.5～38 min，90%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源負(fù)離子模式，離子電壓4 500 V；去簇電壓80 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣壓0.24 MPa；霧化氣壓0.38 MPa；加熱器氣壓0.38 MPa。每個(gè)掃描周期包括1 次飛行時(shí)間質(zhì)譜（time of flightmass spectrometry，TOF-MS）全掃描和15 次二級(jí)質(zhì)譜掃描。TOF-MS 的質(zhì)量范圍設(shè)定為m/z 63～1 000，二級(jí)質(zhì)譜的質(zhì)量范圍為m/z 30～1 000，樣品進(jìn)樣體積為3 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

研究中涉及的抑菌試驗(yàn)至少重復(fù)3 次以上，并采用Origin 2021 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察和菌株鑒定

Nocardiopsis sp.HM-01 菌株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖1。

圖1 Nocardiopsis sp.HM-01 菌株形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological observation of strain Nocardiopsis sp.HM-01

如圖1 所示，海洋放線菌Nocardiopsis sp.HM-01在RP 培養(yǎng)基上，整體呈中間凹陷、邊緣凸起的絨毛放線狀。顏色整體為淡黃色，邊緣為乳白色。將處理好的樣品在掃描電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 菌絲以橫隔分裂方式形成孢子鏈，孢子呈橢圓形桿狀，表面光滑，形態(tài)飽滿，符合Nocardiopsis 菌屬的孢子形態(tài)。在電子顯微鏡下，Nocardiopsis sp.HM-01菌絲體呈長(zhǎng)絲，有橫隔，大多數(shù)菌絲斷裂成長(zhǎng)短近于一致的桿狀孢子，每個(gè)桿狀體內(nèi)至少有一個(gè)核，可復(fù)制并形成新的多核菌絲體，是典型的擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）的菌絲形態(tài)[26-28]。

提取菌株Nocardiopsis sp.HM-01 的總DNA 及進(jìn)行16S rDNA 的擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)序分析，將其在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 檢索，選取親緣性較高的典型菌株序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果見圖2。

圖2 基于16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

由圖2 可知，菌株Nocardiopsis sp.HM-01 與N.alborubida NBRC 13392、N.dassonvillei IFO 14626 和N.synnemataformans DSM 44143 聚在同一分支，親緣性最高，且自展值大于0.95。因此，綜合該放線菌在形態(tài)培養(yǎng)特征及16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)的分析，確認(rèn)該菌株為擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）。

2.2 放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 的抑菌活性研究結(jié)果

在放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 培養(yǎng)過程中，每隔24 h 取樣，測(cè)定經(jīng)乙酸乙酯提取的抑菌樣品對(duì)革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）的抑制效果，測(cè)定結(jié)果如圖3 和圖4 所示。

圖3 不同時(shí)間Nocardiopsis sp.HM-01 發(fā)酵提取液對(duì)細(xì)菌的抑制效果Fig.3 Inhibition effect of Nocardiopsis sp.HM-01 culture media extract on bacteria at different time

圖4 Nocardiopsis sp.HM-01 對(duì)革蘭氏菌的抑制效果Fig.4 Inhibition effect of Nocardiopsis sp.HM-01 culture media extract on tested bacteria

由圖3 可知，隨著放線菌Nocardiopsis sp.HM-01培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)（5～9 d），其抑菌作用也逐漸增強(qiáng)，在9 d 時(shí)達(dá)到最高，之后有下降趨勢(shì)，但仍維持在較高水平，表明放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)是在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期開始進(jìn)入較高水平。由圖4可知，由RP 培養(yǎng)基培養(yǎng)的放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 對(duì)革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）的抑菌效果顯著。這與文獻(xiàn)所報(bào)道的放線菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌效果相吻合[24]。

2.3 抑菌譜測(cè)試結(jié)果

采用打孔法對(duì)抑菌樣品進(jìn)行活性測(cè)試（孔徑6.00 mm），以大腸桿菌（E.coli DH5α）、金黃色葡萄球菌（S.aureus ATCC 25923）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa ATCC 27853）、假單胞菌（Pseudomonas sp.W407）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus CICC 21617）、鰻弧菌（V.anguillarum ATCC 19264）、哈維式弧菌（V.harveyi ATCC 33842）、陰溝腸桿菌（E.cloacae ATCC 700323）為測(cè)試菌株，以等體積甲醇作為陰性對(duì)照。不同受試菌的抑菌結(jié)果見圖5。

圖5 抑菌樣品對(duì)不同受試菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of Nocardiopsis sp.HM-01 culture media extract on different tested bacteria

由圖5 可知，Nocardiopsis sp.HM-01 發(fā)酵液粗提物對(duì)S.aureus、E.coli、P.aeruginosa、Pseudomonas sp.W407、V.anguillarum 和E.cloacae 有較強(qiáng)的抑制活性，PR 培養(yǎng)基抑菌樣品抑菌圈直徑分別為22.4、17.3、15.0、15.5、16.7、14.2 mm，ISP2 培養(yǎng)基抑菌樣品抑菌圈直徑分別為13.9、14.9、10.5、12.8、10.7、10.9 mm。RP 培養(yǎng)基的抑菌效果顯著高于ISP2 培養(yǎng)基。對(duì)V.parahaemolyticus 和V.harveyi 抑菌效果不明顯。

2.4 Nocardiopsis sp.HM-01 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇的預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步探究Nocardiopsis sp.HM-01 發(fā)酵液的抑菌機(jī)制，本研究對(duì)該菌株親緣性較高的N.dassonvillei、N.synnemataformans 和N.dassonvillei sub.alborubida 的17 個(gè)基因組序列進(jìn)行注釋，并采用anti－SMASH 鑒定次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇，進(jìn)一步發(fā)掘Nocardiopsis sp.HM-01 潛在的抑菌物質(zhì)?；虼匦畔⒔y(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 Nocardiopsis sp.HM-01 潛在的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇Table 1 Potential biosynthetic gene cluster related to secondary metabolites of Nocardiopsis sp.HM-01

由表1 可知，3 種放線菌共編碼17 個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇，包括3 個(gè)NRPS、6 個(gè)terpene、3 個(gè)siderophore、3 個(gè)ectoine、1 個(gè)lanthipeptide-class-II、1個(gè)T2PKS，其中3 種基因簇與編碼desferrioxamine E、icosalide A/icosalide B、isorenieratene 的基因具有100%的相似性。具有抑菌活性的基因簇有desferrioxamine E、icosalide A、icosalide B、TLN-05220。在這些基因中還包含抗氧化基因簇isorenieratene 以及coelibactin、ectoine、2-methylisoborneol 等。

2.5 抑菌物質(zhì)的液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）檢測(cè)結(jié)果

為進(jìn)一步確定主要抑菌的活性物質(zhì)，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)Nocardiopsis sp.HM-01 的發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的LC-MS 圖譜Fig.6 LC-MS spectrum of bacteriostatic substances in fermentation broth

由圖6 可知，對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間10.4 min、m/z=390的[M-H]-峰為乳桿菌素coelibactin；對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間8.8 min、m/z=599 的[M-H]-峰為去鐵胺E（deferoxamine E）；對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間9.7 min、m/z=683 的[M-H]-峰為icosalide B。因此，根據(jù)質(zhì)譜推測(cè)，該菌株可能會(huì)產(chǎn)生coelibactin、deferoxamine E 和icosalide B 這三類物質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，coelibactin 可以作為鋅載體間接調(diào)節(jié)抗生素的生產(chǎn)[32]。deferoxamine E 是一種鐵螯合劑，能夠通過與宿主體內(nèi)的鐵相螯合而抑制致病菌增殖。例如，金黃色葡萄球菌是人類細(xì)菌感染疾病的主要病原體，在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等多重耐藥菌株存在的情況下，感染可能發(fā)展成致命的、無法治愈的疾病，尤其極易在免疫功能較低的患者中發(fā)生。而在鐵限制條件下，deferoxamine E 與各種致病菌對(duì)鐵資源競(jìng)爭(zhēng)從而發(fā)揮抗菌活性，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[33]。此外，已有文獻(xiàn)報(bào)道：68Ga-FOXE 在金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物中表征出鐵的快速攝?。?8Ga 為一種短效發(fā)生器，能夠檢測(cè)到各種鐵載體），這也從一定程度上表明deferoxamine E對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性[34]。icosalide A/B 可通過調(diào)節(jié)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)和生物膜的形成發(fā)揮抑菌作用[30]。據(jù)報(bào)道，icosalide A/B 對(duì)腸球菌和鏈球菌（金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、耐青霉素肺炎鏈球菌，化膿性鏈球菌、糞腸球菌）等細(xì)菌具有選擇性抗菌活性[35]。

經(jīng)antiSMASH 預(yù)測(cè)的抑菌物質(zhì)中，還包括TLN-05220（相似度70%），它對(duì)一系列革蘭氏陽性病原體具有很強(qiáng)的抗菌活性，包括多種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌菌株，并對(duì)多種人類腫瘤細(xì)胞系具有細(xì)胞毒活性[31]。但LC-MS 并未檢測(cè)出TLN-05220，可能是由于TLN-05220 的基因簇表達(dá)沉默或低表達(dá)，后續(xù)還可嘗試其它的培養(yǎng)條件及更靈敏的檢測(cè)方法。

3 結(jié)論

近年來，海洋放線菌Nocardiopsis 的開發(fā)和在農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境保護(hù)等方面發(fā)揮越來越重要的作用。Nocardiopsis 菌屬可以產(chǎn)生豐富的酶類，如幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶等，賦予了該類菌株在農(nóng)業(yè)和食品領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。同時(shí)，利用環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)（污染物）生長(zhǎng)繁殖，也可通過產(chǎn)生各種活性化合物調(diào)整和改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)水生動(dòng)物健康生長(zhǎng)、實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展。本研究通過對(duì)海洋放線菌Nocardiopsis sp.HM-01 的發(fā)酵提取物進(jìn)行抑菌活性研究，考察其在不同培養(yǎng)條件下對(duì)不同種類細(xì)菌的抑制程度。結(jié)果表明，Nocardiopsis sp.HM-01 的發(fā)酵提取物對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定的抑制作用，尤其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌、銅綠假單胞菌、假單胞菌的抑菌效果較強(qiáng)，具有一定的廣譜抑菌效果。通過對(duì)基因組序列進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇的注釋，聯(lián)合質(zhì)譜分析，鑒定出兩種具有代表性的潛在抑菌化合物，deferoxamine E 和icosalide B，為該類菌株的深度開發(fā)及利用奠定了基礎(chǔ)。