厲莉，史碩碩，王鑫，耿可贊，張飛俊，胡婷

（武漢工程大學 環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，湖北 武漢 430205）

苦丁茶主要由冬青屬植物的葉子制成，已有2 000多年的歷史[1]?？喽〔韬胸S富的多酚、黃酮、精油、三萜等活性物質(zhì)[2]，具有明顯的降血糖、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗肥胖、保肝等活性[3-4]。結合酚是通過化學共價鍵、氫鍵和疏水相互作用與細胞壁組分（如膳食纖維）結合，經(jīng)溶劑萃取后，再經(jīng)堿性/酸性/酶解從剩余固體殘渣中提取而得[5-7]。研究表明，堿性水解釋放出來的結合酚物質(zhì)的總量要遠高于酸水解[8-9]。

調(diào)查表明，我國的糖尿病患者已達1.3 億人，其中2 型糖尿病是糖尿病患者中患病最多的類型之一，也是世界范圍內(nèi)導致死亡和殘疾的主要原因之一[10-11]。食用碳水化合物是維持血糖的主要途徑之一，胃腸道中存在的α-葡萄糖苷酶，能夠催化人們所食用的碳水化合物中的α-1，4 糖苷鍵裂解，從而形成葡萄糖[12-13]。阿卡波糖是臨床上以α-葡萄糖苷酶為靶點的有效降糖藥，但它對胃腸道有副作用[14-15]，長期使用該藥物會導致腹痛腹瀉、腸胃功能紊亂等癥狀[16]。因此，開發(fā)具有維持血糖穩(wěn)定作用的天然有效物質(zhì)具有很大的前景[17-19]。已有研究表明，從植物中提取出的結合酚對α-葡萄糖苷酶的抑制活性顯著[5，20-21]。

目前鮮有苦丁茶結合酚的提取和降血糖的活性研究，本文主要以苦丁茶為原料，優(yōu)化其結合酚的提取工藝并研究其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，旨在為苦丁茶結合酚作為健康食品輔料的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦丁茶：市售；大孔樹脂（AB-8、NKA-9、HPD-100、D101、X-5、ADS-7 和S-8 型）、α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl α-Dglucopyranoside，pNPG）：上海源葉生物科技有限公司；十二水合磷酸氫二鈉、十二水合磷酸二氫鈉、碳酸鈉、無水乙醇、濃鹽酸、福林酚、氫氧化鈉、沒食子酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000A）：上海亞榮生化儀器廠；烘箱（PHG-9246A）：上海龍躍儀器設備有限公司；可見分光光度計（V-5100）：上海元析儀器有限公司；電子分析天平（ME104E/O2）、pH 計（EF-20）：梅特勒-托利儀器有限公司；多功能酶標儀（Multiskan FC）：賽默飛世爾科技有限公司；真空冷凍干燥機（LGJ-60A）：上海豫明儀器有限公司；超聲清洗儀（SB25-12DT）：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

首先將苦丁茶研磨并過40 目篩，隨后置于常溫下儲存。取100 g 苦丁茶粉末，并使用50%乙醇溶液進行浸提，乙醇溶液與樣品液料比20∶1（mL/g），將混合物裝入燒杯中，隨后在50 ℃超聲波（600 W）中浸提1.6 h，浸提結束后，抽濾分離濾液和濾渣。將濾渣再次浸提，盡可能除去游離態(tài)結合酚，收集苦丁茶濾渣并將其完全干燥，于陰涼干燥處室溫保存。

1.3.2 苦丁茶結合酚的提取單因素試驗

取0.5 g 苦丁茶渣，分別以氫氧化鈉濃度、液料比（即氫氧化鈉溶液與苦丁茶渣之比）及提取時間為因素，以結合酚含量為指標，進行單因素試驗設計。

1.3.2.1 氫氧化鈉濃度的選擇

在液料比20∶1（mL/g）、提取時間3 h、提取溫度50 ℃條件下，采用超聲輔助提取法，探究不同氫氧化鈉濃度（5、6、7、8、9 mol/L）對苦丁茶結合酚含量的影響。

1.3.2.2 液料比的選擇

在氫氧化鈉濃度8 mol/L、提取時間3 h、提取溫度50 ℃條件下，采用超聲輔助提取法，探究不同液料比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）]對苦丁茶結合酚含量的影響。

1.3.2.3 提取時間的選擇

在氫氧化鈉濃度8 mol/L、液料比40∶1（mL/g）、提取溫度50 ℃條件下，采用超聲輔助提取法，探究不同提取時間（1、2、3、4、5 h）對苦丁茶結合酚含量的影響。

1.3.3 響應面設計及分析

在單因素試驗的基礎上，以氫氧化鈉濃度、液料比、提取時間作為自變量，以苦丁茶結合酚含量作為響應值，采用三因素三水平的方法進行響應面優(yōu)化，如表1 所示，使用軟件Design Expert.V8.0.6.1 進行分析。

表1 響應面因素水平設計Table 1 Optimized independent variables and their coded and actual values

表2 底物和α-葡萄糖苷酶溶液濃度Table 2 Substrate and α-glucosidase solution concentrations

1.3.4 結合酚含量測定

采用福林酚法測結合酚含量。首先稱取沒食子酸0.10 g，配制溶液為1.0 mg/mL。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 配制完成的沒食子酸溶液于反應管中，補加純水至10 mL；分別取1 mL 沒食子酸（空白為1 mL 純水）于試管中，加入福林酚0.5 mL，搖勻，反應5 min；加1.5 mL 20% Na2CO3，并添加7 mL 純水，搖勻，室溫下放置1 h（黑暗中），使用分光光度計于765 nm下測定吸光值。

1.3.5 結合酚的純化

參考朱潔等[22]的方法并稍加修改。選取AB-8、NKA-9、HPD-100、D101、X-5、ADS-7 和S-8 型7 種常用的大孔樹脂，分別稱1 g，并置于相同規(guī)格大小的錐形瓶中。將凍干的苦丁茶結合酚粉末用純水復溶，并測定其結合酚含量，將該溶液的結合酚濃度記為C0（mg/mL）。取20 mL（記為V1）溶液倒入錐形瓶中，將錐形瓶放置在搖床中，180 r/min、30 ℃下振搖24 h，測定濾液的結合酚含量，將濾液的結合酚濃度記為C1（mg/mL）。按照公式（1）計算大孔樹脂對苦丁茶結合酚吸附率（A，%）。

將濾干的樹脂用純水洗凈并濾干，將樹脂重新放入洗凈烘干的錐形瓶中，加入20 mL 配制好的60%乙醇溶液，180 r/min、30 ℃下振搖24 h，60%乙醇洗脫液體積記為V2（mL），測定溶液的結合酚濃度，記為C2（mg/mL）。大孔樹脂解吸率（D，%）按公式（2）計算。

1.3.6 苦丁茶結合酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

1.3.6.1 酶活力的測定

參考Tian 等[23]和張海龍[24]的方法并稍加修改。采用96 孔板，將20 μL 2.5 mmol/L 的對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷和20 μL 0.6 U/mL 的α-葡萄糖苷酶添加到120 μL 的磷酸緩沖液（pH6.8，0.1 mol/L）中，于37 ℃下孵育20 min。加入80 μL 濃度為0.2 mol/L Na2CO3終止反應。使用酶標儀在405 nm 處測定吸光值。以20 μL 的磷酸緩沖液代替酶作為空白對照。

1.3.6.2 最適酶濃度的選擇

參考張永軍等[25]的方法并稍加修改。加入適量的α-葡萄糖苷酶，測定酶反應初速率為△A/min，使其速率介于0.03～0.25 之間。加入底物pNPG 后開始計時，在反應進行1 min 后，加入Na2CO3以停止反應，隨后使用酶標儀測出反應溶液的吸光值，吸光值表示酶與底物反應后，生成對硝基苯基（p-nitrophenyl，pNP）在405 nm 下的吸光值。

1.3.6.3 不同濃度的結合酚對α-葡萄糖苷酶半抑制濃度的確定

將苦丁茶結合酚配制為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL，取20 μL 的苦丁茶結合酚與20 μL 的α-葡萄糖苷酶反應10 min，加入20 μL 的pNPG 于37 ℃下繼續(xù)孵育20 min，反應結束后立即加入80 μL 的Na2CO3終止反應。記測試組的吸光值為AA；以20 μL 的磷酸緩沖液代替酶作為測試空白組，記Aa；以20 μL 的磷酸緩沖液代替樣品作為對照組，記AB；以20 μL 的磷酸緩沖液代替樣品，并以20 μL 的磷酸緩沖液代替酶作為空白組，記Ab。使用酶標儀于405 nm 波長處測定吸光值，并且根據(jù)下列公式計算抑制率（X，%）[26]。

1.3.6.4 苦丁茶結合酚對α-葡萄糖苷酶抑制類型的研究

參考Xiong 等[27]的方法并稍作修改。選取濃度為2 mg/mL 苦丁茶結合酚，并測定酶濃度分別為0.2、0.6、1.0、1.6 U/mL 和2.4 U/mL 的酶反應初速率。抑制組添加結合酚溶液，無抑制組則用純水代替樣品溶液，利用分光光度計進行吸光值的測定。以酶濃度（U/mL）為橫坐標，酶解速率V 為縱坐標作圖。依照動力學圖的特征，分析結合酚對α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

1.3.6.5 可逆性抑制類型的研究

在反應體系中，首先加入2.5 mg/mL 和5.0 mg/mL的pNPG，接著加入1.2 U/mL 的α-葡萄糖苷酶，最后加入濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.5 mg/mL 的結合酚溶液，使用酶標儀測出反應的吸光值，并由此求出反應速率。按Dixon 的雙倒數(shù)作圖法作圖，橫坐標為結合酚濃度（mg/mL），縱坐標為酶反應速率的倒數(shù)1/V，根據(jù)圖確定α-葡萄糖苷酶的可逆性抑制的類型。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖像采用Origin 和Design-Expert.V8.0.6.1 繪制，利用SPSS 軟件處理試驗數(shù)據(jù)并分析數(shù)據(jù)顯著性，當P＜0.05 表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 苦丁茶結合酚單因素試驗結果

各因素對苦丁茶結合酚含量的影響見圖1。

圖1 苦丁茶結合酚提取單因素結果Fig.1 Single factor results of the extraction of Kuding tea binding polyphenols

由圖1A 可知，氫氧化鈉濃度在5.0～8.0 mol/L 時，結合酚含量隨著氫氧化鈉濃度的增加而增加，當濃度為8.0～9.0 mol/L 時，結合酚含量隨著氫氧化鈉濃度的增加而減少。可能是由于堿濃度過高，導致酚基發(fā)生氧化反應，從而破壞結合酚的結構，使其無法被提取。因此，選取7、8、9 mol/L 這3 個濃度進行響應面試驗優(yōu)化。由圖1B 可知，液料比為10∶1～40∶1（mL/g）時，結合酚含量隨著溶劑量的增加而增加，而在液料比為40∶1～50∶1（mL/g）時，結合酚含量隨著溶劑量的增加而減少?？赡苁怯捎谌芙舛鹊南拗?，提取液對結合酚的溶解能力有限，當達到飽和狀態(tài)時，溶液中無法再溶解更多的結合酚，導致提取量降低。因此，選取30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）3 個水平進行響應面試驗設計。圖1C中，提取時間在1～4 h 時，結合酚含量隨著提取時間的延長而增加，而在4～5 h 時，結合酚含量隨著時間的延長而減少?？赡苁怯捎诮Y合酚的降解，在提取過程中，隨著反應時間的延長，結合酚可能發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，生成其他化合物，從而導致提取量降低。因此，選取3、4、5 h 3 個水平進行響應面試驗設計。

2.2 苦丁茶結合酚提取工藝的響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 試驗結果及方差分析

響應面試驗結果見表3。

表3 響應面試驗結果Table 3 Results of response surface tests

由表3 可知，苦丁茶結合酚含量二次多項回歸方程為Y=32.06-0.21A+0.85B+0.63C+0.64AB+0.86AC-0.24BC-4.61A2-2.25B2-2.78C2。

對試驗結果進行方差分析，結果見表4。

表4 回歸方程各項方差分析Table 4 Variance analysis of regression equations

由表4 可知，該模型P<0.000 1，屬于極顯著差異，失擬差為0.568 3，P>0.05，即失擬差不顯著，且R2=0.989 1，能夠證明模型的可靠性和準確性。一次項A影響不顯著，B 影響極顯著，C 影響顯著；交互項AB、AC 對響應值影響顯著，BC 不顯著；二次項A2、B2、C2均對響應值影響極顯著。由此得知響應值會受到多個因素的相互影響。根據(jù)F 值，各因素對苦丁茶結合酚含量的影響順序為液料比＞提取時間＞氫氧化鈉濃度。

2.2.2 苦丁茶結合酚提取工藝的響應面圖分析

變量的等高線圖和三維圖及其交互作用見圖2。

圖2 變量的等高線圖和三維圖及其交互作用Fig.2 Contour and 3D plots of variables and their interactions

由圖2 可知，氫氧化鈉濃度與液料比之間立體圖陡峭，交互作用顯著；氫氧化鈉濃度與提取時間之間立體圖陡峭，交互作用顯著；液料比與提取時間之間立體圖較平緩，與統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)一致，交互作用不顯著。

根據(jù)響應面回歸方程，預測出苦丁茶結合酚的最佳提取工藝條件為氫氧化鈉濃度8.54 mol/L、液料比42.56∶1（mL/g）、提取時間4.19 h。在此條件下，苦丁茶結合酚的含量為30.84 mg/g。結合實際優(yōu)化提取工藝條件為氫氧化鈉濃度8.5 mol/L、液料比43∶1（mL/g）、提取時間4.2 h。重復3 次試驗，最終得到苦丁茶結合酚的含量為（29.8±2.0）mg/g。實際測得的結合酚含量與預測值極為接近，進一步驗證了模型的準確性。

2.3 大孔樹脂篩選結果

不同類型大孔樹脂的吸附率和解吸率見圖3。

圖3 不同類型大孔樹脂的吸附率和解吸率Fig.3 Adsorption and resolution rates of different types ofmacroporous resins

由圖3 可知，不同類型的大孔樹脂對苦丁茶渣結合酚吸附率及解吸率的影響均不同。從吸附率來看，AB-8 大孔樹脂的吸附率最高，NKA-9、HPD-100、D101、X-5 大孔樹脂吸附相近，而ADS-7 大孔樹脂吸附率最低。從解吸率來看，AB-8 大孔樹脂的解吸率最高，NKA-9、D101 大孔樹脂解吸率次之，其他大孔樹脂的解吸率較低。綜上，選擇AB-8 大孔樹脂純化苦丁茶結合酚。

2.4 α-葡萄糖苷酶最適酶濃度的測定

酶濃度過高或者過低都不利于建立科學的反應動力學方程，因此要使測定的反應速率（以△A/min 表示）在0.03～0.25[25，28]。測定α-葡萄糖苷酶在7 min 內(nèi)的反應動力進程曲線，結果如圖4 所示。

圖4 α-葡萄糖苷酶不同濃度下的反應進程曲線Fig.4 Reaction progression curves of α-glucosidase at different concentrations

由圖4 看出，酶濃度增大時，酶反應的初始速率隨之升高，計算3 min 內(nèi)的酶反應速率，即用縱坐標值/時間，當酶濃度在0.6 U/mL 及其以上時，反應的初始速率為0.03～0.25，選取酶濃度0.6 U/mL 進行后續(xù)試驗。

2.5 結合酚對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度

不同濃度的結合酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率見圖5。

圖5 不同濃度的結合酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.5 Inhibition rates of α-glucosidase by different concentrations of binding polyphenols

由圖5 可以看出，隨著苦丁茶結合酚的濃度增大，其抑制率也增大，這表明結合酚活性成分含量會影響α-葡萄糖苷酶抑制效果。根據(jù)試驗結果可以計算出苦丁茶結合酚對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50為1.90 mg/mL。

2.6 結合酚對α-葡萄糖苷酶抑制類型

抑制劑對酶的抑制類型分為可逆抑制和不可逆抑制，當在測定酶活力時，所加入的體系中不存在抑制劑，其速率直線通過原點；當存在可逆抑制劑時，其速率直線通過原點且斜率略低；當存在不可逆抑制劑時，其速率直線不通過原點。結合酚對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學曲線如圖6 所示。

圖6 結合酚對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學曲線Fig.6 Inhibition kinetics of α-glucosidase by binding polyphenols

2.7 可逆性抑制類型的研究

可逆性抑制類型有3 種，分為競爭性、非競爭性、混合性抑制類型。已經(jīng)確定抑制機理時，選取兩個底物濃度，采用Dixon 作圖法作圖，探究苦丁茶結合酚濃度、底物濃度與酶解速率之間的關系，確定抑制類型和抑制常數(shù)。以結合酚濃度為橫坐標軸，以1/V（V 為酶解速率）為縱坐標軸，兩底物濃度得到的兩條直線相交于橫坐標軸則為非競爭性抑制，相交但不交于橫坐標屬于競爭性抑制，平行則為反競爭性抑制。交點對應的橫坐標絕對值為非競爭性抑制常數(shù)Ki。結合酚對α-葡萄糖苷酶的可逆性抑制雙倒數(shù)圖見圖7。

圖7 結合酚對α-葡萄糖苷酶的可逆性抑制雙倒數(shù)圖Fig.7 Reversible inhibition of α-glucosidase by binding polyphenols

由圖7 可知，抑制類型為非競爭性抑制，通過計算得出Ki為0.60 mg/mL。

3 結論

本文分析了氫氧化鈉濃度、液料比和提取時間3個因素對苦丁茶結合酚含量的影響，并且探究了不同類型的大孔樹脂對苦丁茶結合酚的吸附效果，此外，研究了苦丁茶結合酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。結果表明，苦丁茶結合酚最佳工藝參數(shù)為氫氧化鈉濃度8.5 mol/L、液料比43∶1（mL/g）、提取時間4.2 h，此工藝條件下，測得結合酚含量為（29.8±2.0）mg/g；7 種不同類型的大孔樹脂中，AB-8 大孔樹脂對苦丁茶結合酚的吸附率和解吸率最高；苦丁茶結合酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯，其半抑制濃度為1.90 mg/mL。分析苦丁茶結合酚對α-葡萄糖苷酶的反應動力曲線圖，得知其抑制類型為可逆性非競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki 為0.60 mg/mL?？喽〔杞Y合酚易于提取且成本較低，可作為天然α-葡萄糖苷酶抑制劑，具有應用前景。本研究對苦丁茶結合酚進行研究，優(yōu)化了苦丁茶結合酚的提取條件，揭示了其對α-葡萄糖苷酶的明顯抑制作用，證明苦丁茶中不可萃取結合酚的可利用價值。