王惠潔，董藝薇，劉 健，梁亞杰，陳 瑩，苑舒文，趙果毅

（山西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，山西 晉中 030619）

三七[Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為五加科人參屬植物，又名人參三七、參三七、文三七、田七等，主產于云南文山、馬關、廣南及江西田陽、田東等地，以干燥根和根莖入藥。主根多呈現(xiàn)類圓錐形或圓柱形，表面顏色呈灰黃色或灰褐色，氣微味淡，入口味苦而后回甜?！侗静菥V目拾遺》中記載“人參補氣第一，三七補血第一，味同而功亦等，故稱人參、三七為中藥之最珍貴者”。

腦卒中（cerebral stroke）又稱“中風”“腦血管意外”（cerebralvascular accident，CVA），是目前常見的神經內科疾病，病癥涉及范圍廣，每年都在威脅著不少患者的性命，即使存活下來也有著極高的致殘率[1]。腦卒中是中老年人較為常見的疾病，也是中國成年人殘疾的首要原因，其病因復雜多樣，患病率、死亡率和致殘率高，為家庭乃至社會帶來了較大的經濟負擔。

網絡藥理學作為一門新興學科，其研究過程以網絡分析為核心技術，通過尋找藥物、疾病的基因和靶點，通過數據庫建立聯(lián)系，構建網絡進行可視化分析，使疾病和藥物的關系一目了然，重視疾病與藥物之間的相互作用，對藥物和疾病的研究更加深入與精準[2]。本研究以三七有效活性成分—靶點—疾?。ㄗ渲校┑臉嫾苷沓鲫P鍵節(jié)點等，形成對研究對象的整體描述，為闡明三七治療腦卒中的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 篩選三七的活性成分

通過TCMSP（中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）查詢三七所含有的化學成分。類別選中“herb name”，并輸入關鍵字“三七”作為詞干在搜索框中進行檢索，在“l(fā)atin name”一 欄 中 選 中“Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen ex C.Chow”后得到三七化學成分的各類信息，如分子名、口服生物利用度（OB）、藥物相似性（DL）、血腦屏障（BBB）、藥物半衰期（HL）、分子量（MW）等，在藥物所參與的ADME（吸收、分布、代謝、排泄）特性過程的基礎上，篩選出“OB≥30%”且同時滿足“DL≥0.18”的化學成分，作為此次研究中使用的三七的活性成分。

1.2 預測三七活性成分靶點及獲得作用靶點

1.2.1 預測三七活性成分的潛在作用靶點

首先使用PubChem化學數據庫平臺（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 檢 索 上 一 步 驟中獲取的所有活性成分，并分別記錄下他們的Smiles 編 號、InChiKey 數 值，再 利 用Swiss ADME 數 據 庫（http：//www.swissadme.ch/）中 的SwissTargetPrediction功能，在select a species中選homo sapiens，將收集到的Smiles號粘貼到搜索框中，或使用PubChem保存化學式的2D圖片將其導入，得到該活性成分的預測靶點。下載Excel表格文件，將probability為0的刪除，得到全部活性成分的預測靶點，并將活性成分對應的靶點名稱規(guī)范化。

1.2.2 獲得三七治療腦卒中的作用靶點

DrugBank數據庫（https：//www.drugbank.ca/）是來自阿爾伯塔大學的生物信息學和化學信息學數據庫，該數據庫可將詳細的藥物數據與全面的藥物靶標信息相結合。在搜索框中輸入“cerebralvascular accident”并搜索，獲得腦卒中相關靶點基因，并將其規(guī)范化，將結果與上一步三七活性成分的作用靶點取交集，獲得三七主要活性成分對腦卒中作用的靶點。

1.3 建立PPI 網絡

STRING 數 據 庫（https：//string-db.org/）是 一款可在線搜索已知蛋白相互作用關系的數據庫，點擊STRING數據庫的search功能，選中multiple proteins，將1.2.2中整理的三七治療腦卒中的靶點基因名稱分別輸入list of names一欄，在organism中選中homo sapiens，將輸出的蛋白相互作用關系網以Excel形式保存。

1.4 取蛋白相互作用網絡（PPI）交集分析核心靶點

利用Cytoscape 3.6.1軟件將三七與腦卒中的PPI網絡進行可視化處理，并選用Merge功能進行拓撲分析，查出核心靶點及其關系。

1.5 基因本體富集分析（geneontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

DAVID數據庫（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）是一個集成了生物學數據和分析工具的數據庫，可為大規(guī)模的基因和蛋白質列表提供系統(tǒng)而全面的生物學功能注釋信息。使用在線GO生物學過程分析和KEGG通路富集分析，保留P<0.05的結果。

2 結 果

2.1 三七的主要活性成分

三七共有119 個化學成分，篩選條件取口服生物利用度（OB）≥30%且藥物相似性（DL）≥0.18，共篩選出8個活性成分，結果見表1。

表1 篩選后的三七活性成分

2.2 三七活性成分的潛在作用靶點

活性成分潛在作用靶點共456 個，結果見圖1。

圖1 三七活性成分靶點預測

2.3 三七治療腦卒中作用靶點的獲取

通過DrugBank數據庫獲得腦卒中相關靶點69個（圖2），與三七潛在作用靶點取交集，共5個靶點基因，分別是凝血因子Ⅱ（F2）、淀粉樣前體蛋白基因（APP）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、細胞色素P4502C19（CYP2C19）和N-甲基-D-天冬氨酸離子型谷氨酸受體2B（GRIN2B）（圖3），構建活性成分-核心靶點-疾病網絡圖，共13個節(jié)點，26條邊線，結果見圖4。

圖2 腦卒中相關靶點

圖3 三七活性成分預測靶點與腦卒中相關靶點交集

圖4 活性成分-核心靶點-疾病網絡圖

2.4 蛋白相互作用網絡（PPI）的拓撲分析結果

三七活性物質與腦卒中的靶點蛋白相互作用網絡（PPI）根據拓撲分析結果顯示APP與F2、MMP9、GRIN2B相互作用，聯(lián)系密切（圖5）。

圖5 三七治療腦卒中PPI 拓撲分析圖

2.5 核心靶點的GO 功能及KEGG 通路富集分析結果

運用DAVID數據庫一次性進行GO功能與KEGG通路富集分析，以P<0.05 進行篩選，結果顯示這5 個基因參與的GO生物過程（BP）有離子型谷氨酸受體信號途徑（ionotropic glutamate receptor signaling pathway）、腎上腺素受體信號途徑（ephrin receptor signaling pathway）、細胞蛋白質代謝過程（cellular protein metabolic process）、白細胞遷移（leukocyte migration）、蛋白質磷酸化的正調控（positive regulation of protein phosphorylation）；參與的分子功能（MF）有絲氨酸型內肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、酶結合（enzyme binding）、受體結合（receptor binding）；相關的細胞成分（CC）有細胞外空間（extracellular space）、胞外區(qū)（extracellular region）。

以P<0.05進行篩選，KEGG通路分析顯示有3個核心靶點基因參與腦卒中疾病的相關通路，分別是APP、CYP2C19、GRIN2B，涉及到的通路為5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）和阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease），結果見表2。

表2 KEGG 通路分析結果

3 討 論

腦卒中屬中醫(yī)學“中風”范疇，包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中兩種，是由于腦供血障礙或血管破裂而造成的急性腦血管疾病，在臨床上致殘率、病死率均較高。三七是一種名貴中藥材，現(xiàn)代藥理學研究表明，三七及其總皂苷提取物具有多種生物活性，包括保護心腦血管系統(tǒng)及神經系統(tǒng)、抗腫瘤、抗菌抗炎、干預興奮毒性、抗氧化及其他藥理作用[3]。

三七可通過多條信號轉導通路保護神經細胞。本研究通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)三七與腦卒中關聯(lián)的信號通路涉及離子型谷氨酸受體信號途徑。GRIN2B 為N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-asparticacid，NMDA）受體，谷氨酸受體中的離子型受體NMDA可調節(jié)神經元的存活、樹突與軸突的結構發(fā)育和突觸可塑性，對生物發(fā)育過程極為重要。腦缺血后，谷氨酸過度釋放，造成谷氨酸堆積，促進NMDA受體活化，引起Ca2+內流增加，導致腦部微環(huán)境異常，最終產生興奮性神經毒性反應，引起神經元凋亡[4]。研究發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1 可選擇性作用于NMDA受體的NR1/NR2B亞型，競爭性抑制谷氨酸所導致的神經元細胞內鈣超載，從而實現(xiàn)對小鼠神經元細胞的保護作用[5]。Wang Shiyun等[6]采用谷氨酸和鈣微灌注法及光栓法誘導腦缺血，制備大鼠海馬微環(huán)境紊亂模型，三七皂苷能夠促進兩種模型大鼠谷氨酸受體轉運體-1的表達，抑制NMDA受體表達和細胞色素C（Cyt-C）釋放，減輕興奮性神經毒性。

本研究發(fā)現(xiàn)三七與腦卒中關聯(lián)的信號通路涉及腎上腺素受體信號途徑，與以往的研究是一致的。腎上腺素受體（adrenergic receptor，AR）是G蛋白偶連受體家族的代表性受體，在調節(jié)心血管系統(tǒng)活動中發(fā)揮基礎作用，腎上腺素受體介導的信號發(fā)生異?？纱龠M心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。腎上腺素受體介導的信號通路如磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidy-linositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激酶B（protein kinase B，PKB即Akt）細胞通路，有研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷類成分可促進 PI3K 和 Akt 蛋白磷酸化，激活P13K/Akt信號通路[8]。三七總皂苷（PNS）結合針灸治療急性缺血性腦卒中大鼠具有顯著的血腦屏障保護作用，可有效改善大鼠神經行為學狀況，其作用機制可能與促進PI3K/Akt信號通路的激活有關[9]；三七提取物能夠作為一種外源性調節(jié)因子，激活依賴于P13K/Akt的核因子紅細胞系相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related facror 2，NRF2）抗氧化防御系統(tǒng)，抑制核轉錄因子-κB（NF-κB）炎癥信號，從而減輕炎癥反應[10]。

KEGG富集分析結果涉及APP基因，APP基因變異，在錯誤的位置被酶切會形成淀粉樣蛋白沉淀。研究表明，三七總皂苷能在轉錄水平下調腦內APP基因的表達[11]，從而降低β-淀粉樣蛋白（Aβ）的生成，改善快速老化模型小鼠的學習記憶能力。人參皂苷可促進APP以α-分泌酶方式進行剪切，抑制APP以β-分泌酶方式進行剪切，抑制γ-分泌酶活性，從而降低Aβ的生成[11]。研究表明，阿爾茨海默?。ˋD）和腦缺血常常并存，互相促進。腦卒中或腦血管病變加重AD患者的認知損傷并加速其衰老，同時患有AD和血管疾病的患者癡呆要嚴重得多。炎癥是二者的共同特征之一，炎癥既促進AD發(fā)展，又加重腦缺血損傷[12]。李愛東等[13]研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可降低阿爾茨海默病患者炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF）和白細胞介素-6（IL-6）水平，有效改善阿爾茨海默病患者臨床癥狀和腦部灌注血流量，從而改善認知功能。

研究人員利用小鼠腦缺血模型研究發(fā)現(xiàn)，在海馬體部分人參皂苷Rg1 和Rb1 能應對腦缺血再灌注引起的氧化應激，在皮層部分其主要是通過恢復細胞外信號調節(jié)激酶（extracellularregulated kinase，ERK）的磷酸化水平以誘導硫氧還蛋白1（thioredoxin，Trx-1）和細胞周期依賴蛋 白 激 酶5（cyclin dependent kinase，CDK5）的表達，從而達到保護腦組織的目的[14]。人參皂苷Rg1 和Rb1 都可抑制東莨菪堿誘導的5-羥色胺（5-hydroxytrptamine，5-HT）減少，發(fā)揮益智作用[15]。三七中的黃酮類成分槲皮素還具有降血壓、降血脂、祛痰、強心等作用[16]。

綜上所述，本研究初步預測了三七主要活性成分通過作用于疾病靶點APP、CYP2C19、GRIN2B治療腦卒中，涉及抗炎、神經遞質和受體的調節(jié)等多條信號轉導通路，形成非常復雜的藥理作用來保護腦神經細胞，這些發(fā)現(xiàn)為后續(xù)應用中醫(yī)藥研究和治療腦卒中提供了理論基礎。