羅惠芳，王翰庭，王 嬋

（武漢商學院食品科技學院，湖北 武漢 430000）

我國為淡水魚養(yǎng)殖大國，截至2020 年我國魚類產量占全國淡水養(yǎng)殖產量的83.73%[1]，鳙魚為我國的四大家魚之一，受傳統(tǒng)烹制方法的影響，基本將魚骨直接丟棄。魚骨主要組成元素有蛋白質、灰分、水分及脂肪，將其加工利用，很容易被人體消化吸收。大部分的魚骨占魚體質量的10%~15%，含有豐富的蛋白質，若直接丟棄將是極大的浪費。

由于天然蛋白質結構中不同區(qū)域的原子隨機運動，使其柔性程度不同，剛性結構的蛋白質就難以被人體利用[2]，因此國內外都開始了對食品蛋白質柔性化加工技術的研究。生物酶解法是一種安全和相對溫和的方法，已被廣泛應用于食物原料加工中，如施永清等人[3]采用雙酶解法制備魚鱗抗菌肽，Yang Ji 等人通過酶解制備了羅非魚皮明膠水解液等。但鳙魚骨結構堅硬，若直接酶解效率較低，有研究者發(fā)現(xiàn)適度的熱處理可以使高級蛋白質結構降解，從而更柔性化，Sang-gi Min 等人研究發(fā)現(xiàn)，水熱處理可輔助豬皮副產物蛋白質水解物的生產；陳林等人[4]研究得出，水熱預處理改變了花生蛋白空間構象、提高了蛋白酶解敏感性，因此有必要通過適當熱處理輔助鳙魚骨蛋白酶解。

通過Alcalase 酶解鳙魚骨蛋白，以蛋白質回收率、TCA-NSI、水解度為考查指標，分析研究不同熱處理時間、熱處理溫度及底物質量分數(shù)對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響。旨在為日后滿足市場需求，發(fā)掘新的途徑進一步開發(fā)利用廢棄蛋白資源、制造功能性食品等提供理論依據(jù)，以提高水產品生產的附加值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鮮活鳙魚骨，購自沌陽集貿市場；Alcalase（200 U/mg），源葉生物提供；BCA 試劑盒，Biosharp生物科技公司提供。

1.2 試驗試劑

硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、甲醛、硼酸、三氯乙酸、石油醚（60~90 ℃）、硫酸銅、硫酸鉀、磷酸，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.3 儀器與設備

GZX-9140MBE 型電熱鼓風干燥箱，上海博訊生物儀器有限公司產品；HYP-304 型消化爐、KDN-102C 型定氮儀、SZC-101 型脂肪測定儀，上海纖檢儀器有限公司產品；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產品；UPT-1-5T 型超純水機，四川優(yōu)普超純科技有限公司產品；YP-30002 型電子天平，上海越平儀器有限公司產品；TDZ4-WS 型臺式低速離心機，湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司產品；YY0027-90 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，武漢精華科儀器有限公司產品；PHS-3C 型pH 計，上海今邁儀器公司產品；KSW型高溫爐，武漢精達儀表廠產品；LDZX- 75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產品；722 型可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司產品；YB-1500A 型多功能粉碎機，永康速峰工貿有限公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 鳙魚骨的制備

將新鮮活鳙魚進行宰殺、去鱗、去肉，將鳙魚剔出的大致魚骨進行沸水隔水蒸煮2.5 min，取出，得到無雜質的魚骨。魚骨清洗于37 ℃下烘干，用0.1 mol/L 的NaOH 溶液沒過鳙魚骨浸泡12 h，去除雜蛋白、脂肪等，清洗后再用1%的鹽酸沒過魚骨浸泡2 h 脫鈣，流水沖洗3 h，于37 ℃下烘干10 h，最后粉碎即可得到鳙魚骨粉（密封、冷藏保存）。

1.4.2 鳙魚骨基本成分的測定

根據(jù)凱氏定氮法[8]測定鳙魚骨中的蛋白質，索氏抽提法[9]測其脂肪，根據(jù)國標[10]測定其灰分，根據(jù)國標中的直接干燥法[11]測其水分。

1.4.3 熱處理對鳙魚骨蛋白的影響

（1） 熱處理時間的影響。配置1%的鳙魚骨溶液置于121 ℃條件下經過5 個不同的加熱時間（0，20，45，70，95 min） 后測定蛋白質回收率、水解度。

（2） 熱處理溫度的影響。配置1%的鳙魚骨溶液，固定加熱時間為30 min，將鳙魚骨溶液分別置于5 個不同溫度（0，60，80，100，121 ℃） 下進行熱處理后測定蛋白質回收率、水解度。

1.4.4 酶解單因素試驗及酶解工藝

（1） 熱處理時間的影響。配置質量分數(shù)為1%的鳙魚骨溶液，分別于100 ℃條件下加熱0，20，45，70，95 min，冷卻后酶解。

（2） 熱處理溫度的影響。配置質量分數(shù)為1%的鳙魚骨溶液，固定加熱時間為30 min，分別于0，60，80，100，121 ℃下進行熱處理，冷卻后酶解。

（3） 底物質量分數(shù)的影響。分別配置鳙魚骨溶液質量分數(shù)為1%，2%，3%，4%，5%，于121 ℃條件下加熱20 min，冷卻后酶解。

（4） 酶解工藝流程。對熱處理后的鳙魚骨蛋白溶液加入堿性蛋白酶進行酶解，主要操作工藝為鳙魚骨溶液經過熱處理后冷卻至50 ℃左右，加酶量為1.5%（即3 U/mL），通過pH 值8.0 的緩沖溶液將鳙魚骨溶液調配為pH 值8.0 后，于溫度為55 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行120 min 的酶解。反應結束后進行沸水浴滅酶10 min，再以轉速4 000 r/min 離心15 min，其上清液即為鳙魚骨蛋白的酶解產物。

1.4.5 水解度測定

鳙魚骨水解液中的氨基態(tài)氮含量的測定參照國標[9]甲醛滴定法進行測定，原料中的含氮量采用凱氏定氮法測定。水解度的計算公式[10]：

1.4.6 蛋白質回收率測定

采用考馬斯亮藍法得出上清液中蛋白質含量，凱氏定氮法測定原料中總蛋白含量。蛋白質回收率計算公式[14]：

1.4.7 TCA 可溶性氮得率測定

通過BCA 試劑盒測定其離心后的上清液中可溶性蛋白質，原料中的總蛋白質量采用凱氏定氮法測定。TCA 可溶性氮得率計算公式[15]：

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

每個樣品均至少3 次平行測定，通過Excel 2016對數(shù)據(jù)進行計算整理，結果用Mean±SD 表示，利用Origin 2021 軟件進行數(shù)據(jù)分析及圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 基本成分的分析

鳙魚骨粉基本成分見表1。

表1 鳙魚骨粉基本成分/g·（100 g）-1

由表1 可知，4 種基本成分含量均>10%，尤其是灰分和蛋白質含量更高，此結果表明鳙魚骨的營養(yǎng)成分很高。魚肉中的蛋白質含量為15%左右，鳙魚骨中蛋白質含量為25.93%，魚骨中的蛋白質因為結構復雜很難被人體消化吸收，但是經過處理的魚骨蛋白會比植物蛋白更適宜人體所需，因此尋找有效技術充分利用廢棄的鳙魚骨蛋白尤為必要。

2.2 熱處理對鳙魚骨蛋白蛋白質回收率和水解度的影響

熱處理對鳙魚骨蛋白蛋白質回收率和水解度（DH） 的影響見圖1。

圖1 熱處理對鳙魚骨蛋白蛋白質回收率和水解度（DH） 的影響

由圖1 可知，熱處理對鳙魚骨蛋白水解度和蛋白質回收率均產生了一定的影響。由圖1（a） 可知，未經過熱處理組的蛋白質回收率和水解度分別為2.98%和0.05%，DH 和蛋白質回收率隨著熱處理溫度的上升而持續(xù)提升，當熱處理溫度為121 ℃經過30 min 加熱后鳙魚骨蛋白溶液的DH 和蛋白質回收率分別是未處理組的15.4 倍和103 倍。由圖1（b）可知，在121 ℃下經過20 min 加熱后其蛋白質回收率和水解度都顯著增大，上升速度最快，后緩緩上升，到70 min 后顯著下降。可能的原因是高溫破壞了蛋白質的高級結構進一步降解為小分子物質，蛋白質肽鍵不斷裂解為短肽鏈，同時部分蛋白質分子的展開推動了鳙魚骨明膠的溶出與水解，使得回收率和水解度提高。而當熱處理時間過長導致鳙魚骨蛋白中的一些小分子物質、短肽鏈（如可溶性蛋白）的損失，而使得回收率降低。在此基礎上，通過單因素試驗進一步優(yōu)化不同熱處理方式對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響。

2.3 熱處理對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

2.3.1 不同熱處理溫度對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

（1） 不同熱處理溫度對鳙魚骨蛋白蛋白質回收率和水解度的影響。

熱處理溫度對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響見圖2。

圖2 熱處理溫度對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

由圖2 可知，經過熱處理的鳙魚骨酶解液的蛋白質回收率和DH 隨著溫度的升高而持續(xù)呈上升趨勢。這可能是由于經過熱處理特別是經過高溫的鳙魚骨蛋白結構舒展，高級結構被降解，更多的酶切位點暴露，使得堿性蛋白酶與鳙魚骨蛋白充分接觸，進一步促進了蛋白酶的水解作用。由圖2 可知，當溫度上升到121 ℃時的蛋白質回收率和水解度比未經熱處理組提高了約40%和5%，相比于其他熱處理溫度的水解效果最好，由此選取121 ℃為最佳的處理溫度較適宜，能夠達到在有限條件下充分利用資源的目的。

（2） 不同熱處理溫度對鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響。

三氯乙酸可沉淀十肽以上的蛋白質，TCA 可溶性氮得率即得到酶解液的短肽得率。

熱處理溫度對鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響見圖3。

圖3 熱處理溫度對鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響

由圖3 可知，TCA 可溶性氮得率與熱處理溫度呈正相關，TCA-NSI 隨著溫度的升高而提高且在121 ℃下經過30 min 熱處理后極速上升，此時鳙魚骨酶解液TCA-NSI 高達30%是比經熱處理組提高了約26%。可能由于經過高溫使得蛋白質多肽鏈分裂為小分子肽鍵，可見高溫處理對鳙魚骨酶解液的TCA 可溶性氮得率影響很大，與蛋白質回收率的趨勢大致相同，均在121 ℃時為最佳熱處理溫度。

2.3.2 不同熱處理時間對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

（1） 不同熱處理時間對鳙魚骨蛋白蛋白質回收率和DH 的影響。

熱處理時間對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響見圖4。

圖4 熱處理時間對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

由圖4 可知，經過熱處理的鳙魚骨酶解液的蛋白質回收率和DH 均明顯高于未處理組，其中經過20 min 提升的速度最快，其蛋白質回收率達到44%比未處理組多31%；水解度達到6.5%，是未處理組的4 倍。20 min 后，隨著加熱時間的增加，水解度增長很緩慢，而蛋白質回收率與時間不成正比，不會隨著時間的增加而上升甚至出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。這可能是因為加熱過度導致蛋白質分子重新組合成致密的網(wǎng)狀結構，使得酶切位點被包圍，堿性蛋白酶難以對鳙魚骨蛋白作用，使得水解效果降低。因此最佳的熱處理時間應選擇20 min。

（2） 不同熱處理時間對鳙魚骨蛋白TCA 可溶性氮得率的影響。

熱處理時間對鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響見圖5。

圖5 熱處理時間對鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響

由圖5 可知，經過熱處理的鳙魚骨酶解液的蛋白質回收率和DH 均明顯高于未處理組，其中經過20 min 時的TCA-NSI 達到22.4%是未處理組的4.5 倍。而當時間超過20 min 后緩慢上升，45 min 后呈現(xiàn)下降趨勢，說明熱處理時間過度會導致酶解效果不理想。可能是因為蛋白分子結構重新組合成難分解的狀態(tài)或小分子物質經過長時間的熱處理受到一定的損傷。因此，20 min 可為最佳的熱處理時間。

2.3.3 不同底物質量分數(shù)對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

（1） 不同底物質量分數(shù)對鳙魚骨蛋白蛋白質回收率和DH 的影響。

不同底物質量分數(shù)對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響見圖6。

圖6 不同底物質量分數(shù)對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響

由圖6 可知，在經過同樣熱處理條件下（121 ℃，20 min） 不同底物質量分數(shù)的鳙魚骨蛋白酶解液的蛋白質回收率和DH 差別很大。在底物質量分數(shù)低于3%時，DH 呈緩慢上升趨勢，而后則呈顯著下降趨勢；底物質量分數(shù)為2%時，蛋白質回收率便開始顯著下降。蛋白質回收率和DH 均沒有隨著底物質量分數(shù)的增加而提高，反而出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，原因可能是底物質量分數(shù)太高，溶液體系偏于濃稠，水自由度降低，導致鳙魚骨蛋白經過熱處理也難以析出；與此同時，堿性蛋白酶與鳙魚骨蛋白的酶解位點也變少等原因，使得蛋白質回收率和DH 均有所下降。結合水解度和蛋白質回收率應選擇底物質量分數(shù)2%為佳，其蛋白質回收率達到44.7%，水解度為7.2%。

（2） 不同底物質量分數(shù)對鳙魚骨蛋白TCA 可溶性氮得率的影響。

不同底物質量分數(shù)對鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響見圖7。

圖7 不同底物質量分數(shù)對鳙魚骨蛋白TCA-NSI 的影響

由圖7 可知，經過相同熱處理條件下（121 ℃，20 min） 在底物質量分數(shù)為2%時，TCA-NSI 達到最大為23.7%；當?shù)孜镔|量分數(shù)大于2%后，TCA 可溶性氮得率呈現(xiàn)大幅下降趨勢，這與蛋白質回收率的趨勢大致相同。造成TCA 可溶性氮得率下降的原因可能是由于此指標表征測的是短肽得率，而當?shù)孜镔|量分數(shù)過大會導致蛋白難以溶出，酶與鳙魚骨蛋白的作用點也變小，因此很難將蛋白高級結構降解為短肽。結合成本問題和現(xiàn)實操作等因素，故可選擇底物質量分數(shù)為2%。

3 結論

試驗首先對鳙魚骨中的基本成分進行了測定，得到其蛋白質含量為25.93%，粗脂肪含量為19.75%，總灰分含量為37.56%，水分為15.54%，說明鳙魚骨中的營養(yǎng)成分很高，其中蛋白質比魚肉中蛋白質含量還要高，因此對鳙魚骨蛋白進行研究對其合理利用尤為必要。以熱處理時間、熱處理溫度為變量；以蛋白質回收率、水解度為指標，分析得出，熱處理對鳙魚骨蛋白產生一定的影響。試驗得出經過熱處理條件為加熱時間121 ℃，加熱時間20 min，此時的鳙魚骨蛋白的蛋白質回收率和水解度分別是未經熱處理組的15.4 倍和103 倍。鳙魚骨粉若不經預處理基本無法溶于水，致密的結構導致蛋白無法溶出，只有借助外力條件才能使其結構降解。

基于熱處理會對鳙魚骨蛋白產生影響的基礎上，進一步進行單因素試驗研究不同熱處理條件對鳙魚骨蛋白酶解特性的影響。試驗結果表明，當加熱時間為20 min，加熱溫度為121 ℃，底物質量分數(shù)為2%時，其蛋白質回收率達到44.7%，水解度為7.2%，TCA 可溶性氮得率高達23.7%，分別是未處理組的3.0 倍，4.2 倍，4.7 倍。高溫熱處理是一種普遍的原料預處理方式，生物酶解是較為安全、可控性強、效率高的水解食品蛋白的方法，兩者結合運作高效簡單，將鳙魚骨變廢為寶，加工魚丟棄的下腳料被重新利用，減少資源浪費綠色環(huán)保，提供了一條新途徑開發(fā)利用水產品蛋白資源，使合理利用資源具有美好廣闊前景。