郭 進(jìn)，曉 燕，劉培清，劉宗益，蘇 琳，趙麗華，靳 燁*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特 010018 2 呼和浩特市抽樣監(jiān)測(cè)與重大活動(dòng)保障中心 呼和浩特 010018 3 烏蘭察布市市場(chǎng)監(jiān)督管理局 內(nèi)蒙古烏蘭察布 013750 4 烏拉特中旗農(nóng)牧和科技局 內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015300）

N-亞硝胺（NAs）通常是由胺類物質(zhì)的亞硝化反應(yīng)生成[1]，其分子式為R1NNOR2，根據(jù)分子質(zhì)量和蒸汽壓大小可分為揮發(fā)性亞硝胺和非揮發(fā)性亞硝胺[2]，其中揮發(fā)性亞硝胺廣泛存在于食品中，尤其是加工肉制品，是四大食品污染物之一[3]。大多數(shù)亞硝胺具有致癌、致畸、致突變性和很強(qiáng)的基因毒性，與多種器官癌癥的發(fā)生相關(guān)，尤其是食管、肝臟和腎臟的癌癥，并可通過(guò)胎盤(pán)傳遞給下一代而受到人們的高度關(guān)注[4-5]。

食品污染是一個(gè)嚴(yán)重影響食品安全和人類健康的問(wèn)題。乳酸菌作為益生菌不僅能夠提高食品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還可在人體中發(fā)揮重要生理功能，且近年來(lái)益生菌可控制食品中有害物質(zhì)產(chǎn)生的重要功能已受到廣泛關(guān)注[5]。有研究表明乳酸菌可通過(guò)吸附或降解途徑直接減少食品加工過(guò)程中產(chǎn)生的生物胺[6]、亞硝胺[7]、苯并芘[8]和真菌毒素[9]等污染物。目前，降亞硝胺的乳酸菌主要通過(guò)抑制NAs 形成和清除已生成的NAs 降低NAs 的含量。李秀明[10]研究發(fā)現(xiàn)菌體碎片具有抑制NDMA 形成的作用。Kim 等發(fā)現(xiàn)乳酸菌可直接降低MRS 培養(yǎng)基中NDMA 的含量。Nowak 等[12]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對(duì)NDMA 的抑制能力受環(huán)境因素和菌株的影響，且培養(yǎng)上清液、膜提取物和胞內(nèi)提取物均能不同程度地降低NDMA 含量。然而，肖亞慶[13]研究發(fā)現(xiàn)菌株降解NAs 的有效成分為細(xì)胞壁上的假定蛋白。

為弄清降亞硝胺乳酸菌的特性，本研究以危害性最強(qiáng)的NDMA 和NDEA 作為篩選菌株的依據(jù)，采用HPLC 篩選具有高效降亞硝胺能力的乳酸菌，研究NAs 脅迫對(duì)菌株生長(zhǎng)量的影響以及不同環(huán)境因素對(duì)菌株降亞硝胺能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16 株乳酸菌，分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵制品（酸奶、腌菜、風(fēng)干肉），內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品科學(xué)與技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；EPA 8270/Appendix IX亞硝胺標(biāo)品（純度≥99%，產(chǎn)品編號(hào)：502138），Sigma-Aldrich 公司。

Centrifuge 5810R 型高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱、1260 安捷倫高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；SCIENTZ-950E 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；SYNERGY H1 酶標(biāo)儀，雷康恒泰北京商貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)與篩選 乳酸菌的活化：將實(shí)驗(yàn)室中甘油保藏的乳酸菌接種至MRS 培養(yǎng)基，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量于28 ℃/37 ℃條件下經(jīng)2次連續(xù)傳代培養(yǎng)。降亞硝胺能力的測(cè)定：參照肖亞慶[13]的方法略作修改。將16 株活化好的乳酸菌按2%接種量分別接入MRS 培養(yǎng)基中，添加質(zhì)量濃度為20 μg/mL 的NAs 標(biāo)品，使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，放置于28 ℃/37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，對(duì)照組中不接菌并同等條件下培養(yǎng)。參照方法GB 5009.26-2016 《食品中N-亞硝胺類化合物的測(cè)定》提取培養(yǎng)基中的NAs，測(cè)定其含量，篩選可高效降低NAs 含量的菌株。

式中：S0——對(duì)照組上清液亞硝胺含量；St——試驗(yàn)組上清液亞硝胺含量。

1.2.2 亞硝胺含量的測(cè)定 采用HPLC 測(cè)定NAs的含量。檢測(cè)參考肖付剛等[14]的方法，采用ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，二元梯度洗脫，水相流動(dòng)相A 為乙腈，有機(jī)流動(dòng)相B 為純水，流速1 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫為25 ℃，于240 nm 處紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。具體梯度洗脫程序如表1 所示。所有樣品檢測(cè)前均經(jīng)過(guò)0.45 μm 膜過(guò)濾。利用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)，NDMA 與NDEA 的保留時(shí)間分別為3.15 和4.34 min，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=41.858x-1.8024（R2=0.9986）和y=24.861x+0.6011（R2=0.9993）（y為峰面積，x 為亞硝胺濃度）。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 The gradient elution program

1.2.3 菌株在正常培養(yǎng)和NAs 脅迫下的生長(zhǎng)曲線 將菌株以2%的接種量分別接種于普通MRS和NAs 濃度為1 μg/mL 的MRS 培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)時(shí)間0，2，4，6，8，12，16，20 和24 h 取樣，測(cè)定菌液OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 不同環(huán)境因素對(duì)菌株降亞硝胺能力的影響

1.2.4.1 時(shí)間對(duì)乳酸菌降亞硝胺能力的影響 參考1.2.1 節(jié)的方法，將活化后的乳酸菌與亞硝胺于MRS 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，通過(guò)HPLC 依次測(cè)定培養(yǎng)時(shí)間為0，12，24，36，48，72，96，120 和144 h 的NAs 含量，研究時(shí)間對(duì)菌株降亞硝胺能力的影響。

1.2.4.2 初始pH 值對(duì)菌株降亞硝胺能力的影響

參考1.2.1 節(jié)的方法，NAs 質(zhì)量濃度為1 μg/mL的MRS 培養(yǎng)基在初始pH 值為3.5，4.5，5.5，6.5 和7.5 條件下，對(duì)照組中不接菌并同等條件下培養(yǎng)，通過(guò)HPLC 測(cè)定不同初始pH 值條件下NAs 的含量，計(jì)算菌株對(duì)NAs 的清除率。

1.2.4.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株降亞硝胺能力的影響參考1.2.1 節(jié)的方法，在共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)溫度為20，28，37 和45 ℃條件下，對(duì)照組中不接菌并同等條件下培養(yǎng)，通過(guò)HPLC 測(cè)定不同培養(yǎng)溫度條件下NAs 的含量，計(jì)算菌株對(duì)NAs 的清除率。

1.2.4.4 接種濃度對(duì)菌株降亞硝胺能力的影響參考1.2.1 節(jié)的方法，在乳酸菌接種濃度為106，107，108，109和1010CFU/mL 條件下，對(duì)照組中不接菌并同等條件下培養(yǎng)，通過(guò)HPLC 測(cè)定不同接種濃度條件下NAs 的含量，計(jì)算菌株對(duì)亞硝胺的去除率。

1.2.5 不同細(xì)胞組分對(duì)菌株降亞硝胺能力的影響 參考Nowak 等[12]的方法略作修改，研究胞內(nèi)提取物、胞外代謝物和細(xì)胞壁對(duì)NAs 的清除作用。將第3 代菌液在4 ℃，12 000 g 條件下離心15 min 得菌株胞外提取液與菌體沉淀。然后加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）懸浮清洗菌體沉淀3 次，再經(jīng)超聲破碎（300 W，工作2 s，間歇3 s，180 次，0 ℃）后再次離心（12 000 g，15 min，4 ℃）后收集上清得胞內(nèi)提取液。將菌體沉淀重懸于PBS 中，并通過(guò)100 ℃高溫加熱處理10 min 致死后可得到細(xì)胞壁。分別添加NAs 至上述胞內(nèi)提取液、胞外代謝物和細(xì)胞壁中，使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，以終質(zhì)量濃度為1 μg/mL 亞硝胺的PBS 緩沖液及MRS 培養(yǎng)基作為對(duì)照，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0，0.5，3，6，12，24 和36 h 取樣，經(jīng)HPLC 測(cè)定NAs 含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3 次，用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，利用Orgin2018 軟件繪制圖表，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 降亞硝胺乳酸菌的篩選

將分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵制品的16 株乳酸菌于MRS 培養(yǎng)基中與NAs 共培養(yǎng)，利用HPLC 檢測(cè)亞硝胺的含量。結(jié)果如表2 所示，不同菌株的降亞硝胺能力具有特異性，與肖亞慶[13]和Kim 等[11]研究結(jié)果一致。由表可知，植物乳桿菌AL6-1 對(duì)培養(yǎng)基中NDMA 的去除率為27.95%，顯著高于其它菌株（P＜0.05），而植物乳桿菌ML2-2、植物乳桿菌37X-6 和戊糖片球菌 37X-8 對(duì)NDMA 有不同程度的促進(jìn)作用，清除率分別為-1.49%，-7.11%和-5.11%，此現(xiàn)象與李木子[15]研究結(jié)果一致，原因是亞硝胺具有揮發(fā)性，在培養(yǎng)過(guò)程中NAs含量發(fā)生不同程度變化。16 株乳酸菌對(duì)NDEA 的清除率范圍為-9.77%～25.23%，其中植物乳桿菌37X-6 對(duì)培養(yǎng)基中NDEA 的去除率顯著高于其它菌株（P＜0.05），為25.23%，而植物乳桿菌AL6-1、CL4-3、X3-2B、37X-11 和瑞士乳桿菌SL-1 與植物乳桿菌37X-6 的降亞硝胺能力無(wú)顯著差異（P＞0.05），分別為20.32%，19.14%，17.17%，19.96%和25.09%。植物乳桿菌 AL6-1 對(duì)2 種NAs 的降低率之和為48.27%，因此選取具有較高降亞硝胺能力的植物乳桿菌AL6-1 用于后續(xù)研究。

表2 不同菌株的降亞硝胺能力Table 2 Decreasing effect of different strains on concentrations of NAs

2.2 植物乳桿菌AL6-1 在正常培養(yǎng)和NAs 脅迫下的生長(zhǎng)曲線

由圖1 可知，在MRS 培養(yǎng)基中植物乳桿菌AL6-1 在接種后4 h 后迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20 h 進(jìn)入穩(wěn)定期，最大生物量為OD600nm=1.75；在亞硝胺終質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的MRS 培養(yǎng)基中，植物乳桿菌AL6-1 的生物量低于正常條件，且20 h 內(nèi)未明顯進(jìn)入穩(wěn)定期，最大生物量為OD600nm=1.72。由此可知，亞硝胺在一定程度上可抑制植物乳桿菌AL6-1 的生長(zhǎng)，可能由于亞硝胺具有毒性[13]，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而延長(zhǎng)乳酸菌的遲滯期并降低對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率。

圖1 植物乳桿菌AL6-1 在正常條件和亞硝胺脅迫下的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of L.plantarum AL6-1 in normal conditions and under the stress of NAs

2.3 不同環(huán)境因素對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響 Nowak 等[12]認(rèn)為乳酸菌降低NDMA能力取決于菌株的生長(zhǎng)期。由圖2 可知，植物乳桿菌AL6-1 對(duì)NDMA 和NDEA 清除率變化趨勢(shì)相同，在0～36 h，亞硝胺清除率隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，在清除時(shí)間為36 h 時(shí)，NDMA 和NDEA清除率已經(jīng)趨于穩(wěn)定，此時(shí)清除率分別為63.90%和61.65%，與48，72，96，120 和144 h 無(wú)顯著差異（P＞0.05）。推測(cè)原因可能是乳酸菌在含亞硝胺的培養(yǎng)體系中緩慢進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在36 h 到達(dá)穩(wěn)定期，使其降解率達(dá)到最大值且趨于穩(wěn)定，在此過(guò)程中隨著乳酸菌數(shù)量增多導(dǎo)致亞硝胺含量急劇下降。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降NAs 能力的影響Fig.2 Effect of incubation time on degradation of NAs by L.plantarum AL6-1

2.3.2 初始pH 值對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響 pH 值對(duì)菌株的降解和吸附作用具有重要影響，其可以通過(guò)改變微生物的生長(zhǎng)繁殖及酶活性影響降解能力，并在吸附過(guò)程中可對(duì)離子交換過(guò)程以及細(xì)胞壁上官能團(tuán)的電離狀態(tài)產(chǎn)生一定影響[16]。由圖3 可知，在pH 3.5～7.5 時(shí)，植物乳桿菌AL6-1 對(duì)NDMA 和NDEA 均具有降NAs能力且變化趨勢(shì)相同，呈先上升后下降趨勢(shì)；當(dāng)pH 4.5 時(shí)，亞硝胺清除率顯著高于其它組（P＜0.05），為37.63%，；隨著pH 值的升高，亞硝胺清除率在pH 6.5 時(shí)基本趨于穩(wěn)定，此時(shí)清除率為26.51%，與pH 7.5 時(shí)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。因此，可確定pH 4.5 為植物乳桿菌AL6-1 降低NAs含量的最適pH 值。孫學(xué)穎等[17]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品在發(fā)酵階段pH 值可降到最低，pH 值為4.69，同時(shí)亞硝胺含量達(dá)到最低值，推測(cè)在pH 值較低條件下乳酸菌對(duì)亞硝胺起到降解作用，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

圖3 初始pH 值對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降NAs 能力的影響Fig.3 Effect of pH value on degradation of NAs by L.plantarum AL6-1

2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響 溫度對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降NAs能力的影響如圖4 所示，在培養(yǎng)溫度為20～45 ℃時(shí)，植物乳桿菌AL6-1 對(duì)NDMA 和NDEA 均具有降NAs 能力且變化趨勢(shì)相同，呈先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)溫度在20～37 ℃范圍內(nèi)時(shí)，NAs 清除率隨著溫度的升高而增長(zhǎng)；當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，NDMA和NDEA 清除率分別為35.00%和28.81%，顯著高于其它溫度（P＜0.05），可確定37 ℃為植物乳桿菌AL6-1 降低NAs 的最適培養(yǎng)溫度；當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，NAs 清除率顯著降低（P＜0.05）。原因可能是培養(yǎng)溫度通過(guò)影響細(xì)胞膜流動(dòng)性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜脂肪酸和蛋白質(zhì)的組成及含量以及酶活性來(lái)影響乳酸菌的生長(zhǎng)和代謝，進(jìn)而影響菌株的降NAs 能力[18]。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降NAs 能力的影響Fig.4 Effect of incubation temperature on degradation of NAs by L.plantarum AL6-1

2.3.4 接種濃度對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響 接種濃度對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降NAs 能力的影響如圖5 所示。隨著接種濃度的增加，植物乳桿菌AL6-1 對(duì)NDMA 的清除率逐步增加，當(dāng)接種濃度為1010CFU/mL 時(shí)，NDMA 清除率顯著高于其它組（P＜0.05），為26.58%。而植物乳桿菌AL6-1 對(duì)NDEA 的清除率在接種濃度為106～108CFU/mL 范圍內(nèi)無(wú)顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)接種濃度高于108CFU/mL 時(shí)，NDEA 的清除率隨著接種濃度的增加而增大，當(dāng)接種達(dá)到1010CFU/mL，NDEA 含量顯著降低（P＜0.05），其清除率為19.67%。結(jié)果顯示，在一定接種濃度范圍內(nèi)，植物乳桿菌AL-6-1 的降NAs 能力與接種濃度之間呈正相關(guān)關(guān)系，與肖亞慶[13]的研究結(jié)果一致，因此確定接種濃度1010CFU/mL 為植物乳桿菌AL-6-1的最適接種濃度。

圖5 接種濃度對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降NAs 能力的影響Fig.5 Effect of inoculation concentration on degradation of NAs by L.plantarum AL6-1

2.4 不同細(xì)胞組分對(duì)植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響

植物乳桿菌AL6-1 不同細(xì)胞組分對(duì)NAs 的降解作用如表3 所示，胞內(nèi)提取物對(duì)NDMA 和NDEA 含量的變化趨勢(shì)相同，在0～6 h 范圍內(nèi)亞硝胺含量隨著時(shí)間增加而逐漸降低；在6 h 時(shí)，NDMA 和NDEA 含量已經(jīng)趨于穩(wěn)定，其含量分別為0.68 μg/mL 和0.71 μg/mL，此時(shí)降解率分別為70.28%與71.88%，顯著低于0，0.5，3 h 時(shí)亞硝胺的含量（P＜0.05），而與12，24，36 h 無(wú)顯著差異（P＞0.05），研究結(jié)果表明植物乳桿菌AL6-1 胞內(nèi)酶對(duì)亞硝胺具有降解作用。肖亞慶[13]研究發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌R3 胞內(nèi)提取液對(duì)NAs 具有一定降解作用，但降解能力不顯著（P＞0.05）。Nowak 等[12]發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)提取液可降低NAs 含量，并且菌株可以將NDMA作為氮源利用。Grill 等[19]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌BB536 的胞內(nèi)提取物具有降低亞硝胺含量的能力，且熱變性后未觀察到亞硝胺含量變化，結(jié)果表明胞內(nèi)提取液中的酶反應(yīng)參與了亞硝胺的降解過(guò)程，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。由以上分析可知植物乳桿菌AL6-1 胞內(nèi)提取液的降解作用可能是其清除NAs 的主要途徑。

表3 胞內(nèi)提取液對(duì)NAs 的降解作用Table 3 Degrading effect of different cell components on concentrations of NAs

植物乳桿菌AL6-1 胞外代謝物對(duì)NAs 清除效果在36 h 內(nèi)無(wú)顯著差異。NAs 與胞外代謝物共培養(yǎng)36 h 后，NDMA 和NDEA 含量分別為0.97 μg/mL 和0.90 μg/mL，表明植物乳桿菌AL6-1 通過(guò)代謝作用所產(chǎn)生的胞外代謝物不能降解亞硝胺。

滅活后的植物乳桿菌AL6-1 細(xì)胞壁與NAs共培養(yǎng)36 h，在0 h，培養(yǎng)體系中NDMA 含量顯著低于胞內(nèi)提取物與胞外代謝物（P＜0.05），為0.93 μg/mL，對(duì)NDEA 含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）；在0～36 h，培養(yǎng)體系中NDMA 和NDEA 含量范圍分別為0.91～0.93 μg/mL 和0.93～0.96 μg/mL，無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明植物乳桿菌AL6-1 細(xì)胞壁可在短時(shí)間內(nèi)吸附NDMA，吸附率為4.12%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用HPLC 篩選具有高效降亞硝胺能力的菌株，并揭示其降解特性及機(jī)理。研究結(jié)果表明植物乳桿菌AL6-1 具有高效降亞硝胺能力，在亞硝胺終質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的共培養(yǎng)體系中NDMA 和NDEA 的降解率分別為27.95%和18.32%；且植物乳桿菌AL6-1 降解能力受不同環(huán)境因素的影響，確定其最佳培養(yǎng)時(shí)間為36 h，最適pH 值為4.5，最適溫度為37 ℃，最佳接種濃度為1010CFU/mL；通過(guò)研究植物乳桿菌AL6-1 胞內(nèi)酶提取液、胞外代謝物及細(xì)胞壁對(duì)NAs 含量的影響，發(fā)現(xiàn)清除NAs 主要是通過(guò)胞內(nèi)提取液的降解作用，在6 h 時(shí)，NDMA 和NDEA 降解率分別為70.28%與71.88%，且細(xì)胞壁對(duì)NAs 有一定的吸附作用。本研究為該菌株能進(jìn)一步應(yīng)用于食品中降低亞硝胺含量提供重要參考依據(jù)。