陳爽,劉柱,石云峰,朱價(jià),羅英

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江 杭州 310058)

基因毒性雜質(zhì)(或遺傳毒性雜質(zhì),genotoxic impurity, GTI)是少量即能引起細(xì)胞DNA損傷,誘導(dǎo)基因突變,并具有致癌傾向的化合物[1]。歐洲藥品管理局(EMEA)、美國食品藥品管理局(FDA)及人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)先后頒布了基因毒性雜質(zhì)控制的指導(dǎo)文件[2-4],推薦以毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC,1.5 μg·d-1)來控制用藥風(fēng)險(xiǎn),并發(fā)布基因毒性警示結(jié)構(gòu)基團(tuán)。

瑞戈非尼(Regorafenib)是拜耳藥業(yè)研發(fā)并于2017年3月在國內(nèi)上市的一種新型口服多靶點(diǎn)的磷酸激酶抑制劑,本品以促進(jìn)腫瘤血管生成和細(xì)胞增殖的多種蛋白激酶為靶標(biāo),達(dá)到治療晚期及轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、進(jìn)展期肝細(xì)胞癌、胃腸道惡性間質(zhì)腫瘤、兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及一些轉(zhuǎn)移性實(shí)體腫瘤的目的。瑞戈非尼的合成路線中起始物料SM2、SM3結(jié)構(gòu)中均含有苯胺類基因毒性警示結(jié)構(gòu)基團(tuán),具有潛在基因毒性,詳見圖1。

A.3-氟-4-氨基苯酚(SM2);B.3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯(SM3)

SM2[3-氟-4-氨基苯酚(3-Fluoro-4-aminophenol)];SM3[3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯(3-trifluoromethyl-4-phenylchloroisocyanate)]

SM2[3-氟-4-氨基苯酚(3-fluoro-4-aminophenol)];SM3[3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯(3-trifluoromethyl-4-phenylchloroisocyanate)]

瑞戈非尼已收載于《中國藥典》和《歐洲藥典》,已經(jīng)報(bào)道了一種LC-MS/MS法定量同時(shí)測定肝細(xì)胞癌患者血漿中瑞戈非尼中及其兩種活性代謝物的含量的方法[17],但目前也未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道本品中兩種苯胺類基因毒性雜質(zhì)SM2、SM3的測定方法。因此建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)方法對瑞戈非尼中少量的苯胺類基因毒性雜質(zhì)的含量進(jìn)行控制。本研究依照ICH推薦的條件,建立了方法并從方法的專屬性、溶液穩(wěn)定性、線性與范圍、定量限與檢測限、準(zhǔn)確度、精密度方面進(jìn)行了方法學(xué)研究,本法靈敏、可靠、簡便,為瑞戈非尼工藝過程控制和質(zhì)量保障提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 1290-6470A LC-MS聯(lián)用系統(tǒng)(美國安捷倫),配備電噴霧離子源(AJS ESI),質(zhì)譜軟件為Agilent MassHunter工作站;XS205DU百萬分之一電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)。Agilent RRHD C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm,填料:十八烷基硅烷鍵合硅膠;Agilent 公司)。

3-氟-4-氨基苯酚對照品(批號:P1156811,純度:98%),3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯對照品(杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)新藥研究院有限公司,批號:191201,純度:99.76%);瑞戈非尼(批號:RGFN-B-190901、Z193-A1911001,由A公司提供);甲醇(默克試劑有限公司)、異丙醇、甲酸(阿拉丁有限公司)均為色譜級。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件液相色譜柱:Agilent RRHD C18(2.1 mm× 100 mm,1.8 μm);流速 0.3 mL·min-1;0.05%甲酸水為流動相A,甲醇為流動相B,梯度洗脫(0～1.2 min,10%B;1.2～4.0 min,10%B→60%B;4.0～8.0 min,60%B;8.0～13.0 min,95%B;13.0～13.10 min,95%B→10%B;13.10～15.0 min,10%B);柱溫35 ℃;進(jìn)樣體積5 μL。

取0.6 ng·mL-1混標(biāo)對照品溶液,在MRM模式下進(jìn)樣分析,結(jié)果如圖2所示,各雜質(zhì)之間分離度良好。

2.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(AJS ESI),正負(fù)離子檢測模式MRM采集(SM2正離子模式、SM3負(fù)離子模式),參數(shù)見表1。噴霧電壓為3.5 kV,鞘氣為250 ℃,鞘氣流速為11 L·min-1,霧化氣為45 psi,干燥氣溫度為300 ℃,干燥氣流速為5 L·min-1。

表1 MRM采集參數(shù)設(shè)置

母離子及子離子:取0.6 μg·mL-1混標(biāo)對照品溶液,在Scan模式下進(jìn)樣,進(jìn)行MS分析,兩種基因毒性雜質(zhì)的質(zhì)譜圖如圖4 所示,其中3-氟-4-氨基苯酚的母離子為m/z 128.05,3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯的母離子為m/z 280.00。各基因毒性雜質(zhì)的MRM參數(shù)見表1,定量離子及定性離子的選擇見表1。

圖4 定量限和檢測限MRM質(zhì)譜圖

2.3 混標(biāo)對照品溶液精密稱取3-氟-4-氨基苯酚對照品、3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯對照品各約6 mg,加稀釋劑異丙醇溶解并稀釋成 6 ng·mL-1的混標(biāo)對照品儲備液。精密量取適量,稀釋10倍,作為0.6 ng·mL-1混標(biāo)對照品溶液。

2.4 供試品溶液取本品約20 mg,精密稱定,置20 mL容量瓶,用稀釋劑溶解并稀釋到刻度,搖勻;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶。異丙醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(10 μg·mL-1)。

2.5 100%加標(biāo)供試品溶液取本品約20 mg,精密稱定,置20 mL量瓶中,用異丙醇溶解稀釋至刻度,搖勻;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶,加入1 mL對照品儲備液后,再用異丙醇稀釋至刻度,搖勻,作為100%加標(biāo)供試品溶液。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性試驗(yàn)取稀釋劑照上述條件進(jìn)行試驗(yàn),記錄色譜圖,結(jié)果顯示稀釋劑不干擾測定,表明該方法專屬性良好。

2.6.2 線性關(guān)系、檢測限和定量限精密量取混標(biāo)對照品儲備液適量,加稀釋劑稀釋得到濃度分別為 0.15、0.3、0.45、0.6、0.9、1.2 ng·mL-1的混標(biāo)對照品溶液,進(jìn)樣分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性方程(見表2)。逐步稀釋,考察定量限及檢測限(見圖4)。

表2 瑞戈非尼中兩種基因毒性雜質(zhì)的線性范圍、定量檢測限及精密度

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取 “2.3”項(xiàng)下 0.6 ng·mL-1的混標(biāo)對照品溶液,“2.5”項(xiàng)下10 μg·mL-1的100%加標(biāo)供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣16 h進(jìn)行分析,各峰面積偏離度的絕對值在8 h內(nèi)均小于17.22%,表明對照品溶液和100%加標(biāo)供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)精密稱取瑞戈非尼(批號:RGFN-B-190901、Z193-A1911001)約20 mg,一式12份,分別置 20 mL 量瓶中,用異丙醇溶解稀釋至刻度,搖勻;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶,精密加入“2.3”項(xiàng)下濃度為6 ng·mL-1的混標(biāo)對照品儲備液溶液0.25、0.5、1.0、1.5 mL,分別溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得低(0.15 ng·mL-1,3份)、中(0.30 ng·mL-1,3份)、高(0.60 ng·mL-1,3份)、極高(0.90 ng·mL-1,3份)4 個(gè)濃度的供試品加標(biāo)溶液,取混標(biāo)對照品溶液和各加標(biāo)供試品溶液分別進(jìn)樣分析,外標(biāo)法計(jì)算回收率結(jié)果見表3,各基因毒性雜質(zhì)回收率均在90.64%～105.44%之間,RSD均小于3.50%,表明各基因毒性雜質(zhì)回收率和精密度良好。

2.7 樣品測定取瑞戈非尼供試品2 批(批號:RGFN-B-190901、Z193-A1911001),每批精密稱取2份約 20 mg,置 20 mL 量瓶中,加稀釋劑溶解并稀釋至刻度,搖勻;再精密量取0.1 mL,置10 mL容量瓶,異丙醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(10 μg·mL-1),進(jìn)樣分析,結(jié)果2批次瑞戈非尼中SM2均未檢出,SM3均有檢出(見表4)。

表4 瑞戈非尼中基因毒性雜質(zhì)檢測結(jié)果

3 討論

3.1 瑞戈非尼的合成工藝如圖1所示,以3-氟-4-氨基苯酚和N-甲基-4-氯-2-吡啶甲酰胺為原料、氫氧化鈉為堿,THF 為溶劑,回流反應(yīng)得到中間體4-(4-氨基-3-氟苯氧基)-N-甲基吡啶-2-甲酰胺,該中間體再與4-氯-3-三氟甲基苯胺以羰基連接得到瑞戈非尼無水物(4-[4-[[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰]氨基]-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲酰胺),加水而成。合成路線中涉及多個(gè)起始物料及中間體帶有基因警示結(jié)構(gòu),因此,必須對瑞戈非尼合成路線中引入的帶有基因警示結(jié)構(gòu)的潛在基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行控制。

3.2 控制限度參照瑞戈非尼片藥品使用說明書,建議每日最低劑量為80 mg,每日最高劑量為160 mg。因?yàn)槿鸶攴悄釣榭鼓[瘤用藥,可以不以ICH M7推薦的最嚴(yán)格的毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC,1.5 μg·d-1)為控制限制。本研究基于治療期,以相對嚴(yán)格的1～10年治療期的TTC(10 μg·d-1)為控制限制計(jì)算,瑞戈非尼中基因毒性雜質(zhì)限度應(yīng)為62.5×10-6,本研究以60×10-6作為瑞戈非尼中基因毒性雜質(zhì)的控制限度。本次研究用樣品中未檢出SM2,檢出的SM3 分別為13.6×10-6、41.4×10-6,均符合限度要求,但SM3檢出量已超30%限度,值得關(guān)切。

3.3 色譜條件的優(yōu)化色譜條件優(yōu)化試驗(yàn)中,探索了甲醇、異丙醇和乙腈 3 種有機(jī)相(B相),水相(A相)中添加不同比率的酸(0.1%甲酸水,0.05%甲酸水和0.1%乙酸水)對分離度和靈敏度的影響。結(jié)果顯示,采用 Agilent RRHD C18色譜柱,當(dāng)流動相 0.05% 甲酸水溶液-甲醇梯度洗脫時(shí),3-氟-4-氨基苯酚(SM2)、3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯(SM3)響應(yīng)較好,且兩個(gè)化合物分離度良好,故流動相中選擇0.05%甲酸水。本試驗(yàn)考察了流速0.2～0.4 mL·min-1范圍內(nèi)對苯胺類物質(zhì)響應(yīng)和峰形的影響,發(fā)現(xiàn)流速0.3 mL·min-1時(shí),SM2,SM3離子化效率最高,出峰時(shí)間合適,且峰形較好。

3.4 質(zhì)譜解析3-氟-4-氨基苯酚的質(zhì)譜圖中m/z 128.05為[M+H]+離子,主要的碎片離子有m/z 108 和 m/z 81.1,其中 m/z 108為去氟基產(chǎn)物,反映了3-氟-4-氨基苯酚的結(jié)構(gòu)特征。試驗(yàn)對3-氟-4-氨基苯酚2個(gè)離子對 m/z 128.05→108 和 m/z 128.05→81.1的 MRM 參數(shù)見表1,其中,離子對m/z 128.05→108的信噪比較離子對 m/z 128.05→81.1更高,因此選擇m/z 128.05→108作為定量離子對,m/z 128.05→81.1作為定性離子對。本法中SM3檢測采用異丙醇衍生化,分析對象為SM3與異丙醇衍生后的產(chǎn)物。衍生產(chǎn)物精確分子量為281.04,其[M-H]-為280,反應(yīng)過程見圖5。

圖5 SM3衍生化反應(yīng)

SM3衍生產(chǎn)物,在質(zhì)譜離子源中,子離子為酯鍵斷裂后重排的m/z,碎裂途徑見圖6。

圖6 SM3子離子裂解途徑

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定瑞戈非尼中的2種基因毒性雜質(zhì)(3-氟-4-氨基苯酚(SM2)、3-三氟甲基-4-氯異氰酸苯酯(SM3),并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,可以有效控制瑞戈非尼的潛在基因毒性雜質(zhì)。該方法專屬性強(qiáng),靈敏度高,滿足基因毒性雜質(zhì)測定要求,可以作為瑞戈非尼原料藥中基因毒性雜質(zhì)的質(zhì)控方法。