黃海偉,袁松,張娜,張龍浩,劉陽,張慶生

(中國食品藥品檢定研究院,國家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品質(zhì)量研究與評價重點實驗室,北京 102629)

鹽酸普萘洛爾化學(xué)名稱為1-異丙基-3-(1-萘氧基)-2-丙醇鹽酸鹽(見圖1A),鹽酸普萘洛爾為非選擇性競爭抑制β受體阻滯劑[1],臨床上常用于高血壓、心律失常和心絞痛的治療[2-3]。2022年3月加拿大衛(wèi)生部(Health Canada)發(fā)布通告,輝瑞制藥公司自愿召回60、80、120、160 mg 4種規(guī)格共29批次鹽酸普萘洛爾緩釋膠囊,此次召回是因為在這些批次中檢測出超過每天允許攝入量的N-亞硝基普萘洛爾(見圖1B)[4-5]。

圖1 鹽酸普萘洛爾(A)及N-亞硝酸普萘洛爾(B)的結(jié)構(gòu)式

N-亞硝基類化合物具有直接或間接的致癌作用,長期小劑量接觸或單次較大劑量接觸都可能致癌[6-8],亞硝胺類化合物是由于藥物生產(chǎn)過程中發(fā)生了某些副反應(yīng)而產(chǎn)生。自2018年纈沙坦中N-二甲基亞硝胺(NDMA)檢出以來,又有N-二乙基亞硝胺(NDEA)、N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(NMBA)等雜質(zhì)陸續(xù)在藥品中檢出,國家藥品監(jiān)督管理局、美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)以及歐洲藥品管理局(EMA)都發(fā)布了有關(guān)藥品中遺傳毒性雜質(zhì)控制策略、檢測方法以及限度要求等指導(dǎo)原則,多個藥品因N-亞硝基類化合物超出每日允許攝入量被召回[9-11]。已報道的N-亞硝基類化合物主要分為兩類,一類與藥物本身結(jié)構(gòu)無關(guān),在藥品生產(chǎn)過程中由殘留溶劑等引入,例如NDMA、NDEA等;一類則直接與藥物本身相關(guān),通常是原料藥中的仲胺結(jié)構(gòu)與微量殘留的亞硝酸鹽反應(yīng)生成相應(yīng)的雜質(zhì)[12-14]。N-亞硝基普萘洛爾屬于上述的第二類雜質(zhì),只在普萘洛爾相關(guān)制劑中被發(fā)現(xiàn)。目前尚無該基因毒性雜質(zhì)檢測及限度的相關(guān)報道,本文擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)建立鹽酸普萘洛爾緩釋片中N-亞硝基普萘洛爾的檢測方法,為鹽酸普萘洛爾中遺傳毒性雜質(zhì)檢查和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器Agilent 1290-6470液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司),配備電噴霧離子源(ESI)和Masshunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);XP205DR型電子分析天平(瑞士Mettler公司),Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 藥物與試劑甲醇(質(zhì)譜級,美國Fisher Scientific公司),乙腈(質(zhì)譜級,美國Sigma-Aldrich公司),甲酸(質(zhì)譜級,德國Merck公司),甲酸銨(質(zhì)譜級,美國Fisher Scientific公司),水為超純水,N-亞硝基普萘洛爾對照品(批號:PN20220312,PERIDA公司,純度96.8%),鹽酸普萘洛爾緩釋片(市場采購)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線對照品溶液制備精密稱取N-亞硝基普萘洛爾對照品10.43 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0.1 mL,置100 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,精密量取1.0、2.0、5.0、7.0、10.0、10.0 mL上述溶液分別置100、100、100、100、100、50 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為濃度分別約為1.0、2.0、5.0、7.0、10.0、20.0 ng·mL-1的系列線性溶液。

2.1.2 供試品溶液制備取本品10片,精密稱定,研細(xì),混勻,精密稱取約相當(dāng)于鹽酸普萘洛爾20 mg的細(xì)粉,置15 mL離心管中,精密加入甲醇5 mL,渦旋3 min,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件采用Waters ACQUITY UPLC CSHTMC18(150 mm×3.0 mm,1.7 μm)色譜柱;以10 mmol·L-1甲酸銨的水溶液(含0.1%甲酸)作為流動相A,乙腈溶液(含0.1%甲酸)作為流動相B,梯度洗脫:0.0～5.0 min, 50%B;5.0～7.0 min, 50%B→70%B;7.0～9.0 min, 70%B;9.0～9.0 min, 70%B→50%B;9.0～13.0 min, 50%B;流速為0.5 mL·min-1,柱溫為50 ℃,進(jìn)樣器溫度為5 ℃,進(jìn)樣體積為10 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(electrospray Ionization Source,ESI),正離子檢測模式,干燥氣溫度為300 ℃,干燥氣流量為6 L·min-1,噴霧電壓為35 psi,鞘氣溫度為350 ℃,鞘氣流量為10 L·min-1,毛細(xì)管電壓為4 500 V。采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple reaction monitor,MRM)模式,以m/z289.2→72.2作為定量離子對,碎裂電壓為78 V,碰撞電壓為12 V,以m/z289.2→145.1作為定性離子對,碎裂電壓為78 V,碰撞電壓為12 V。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗取甲醇作為空白溶劑和“2.1.1”項下1 ng·mL-1的對照品溶液,分別進(jìn)樣,記錄色譜圖(見圖2),在所建立的色譜和質(zhì)譜條件下,N-亞硝基普萘洛爾的保留時間為6.74 min,峰型良好,空白溶劑對檢測無干擾。

A.甲醇溶液;B.對照品溶液

2.3.2 檢測限與定量限試驗取“2.1.1”項下1 ng·mL-1的線性溶液,以甲醇為稀釋劑逐步稀釋,分別在信噪比(S/N)為10∶1和3∶1時作為定量限和檢測限,測得N-亞硝基普萘洛爾的定量限和檢測限分別為0.3、0.09 ng·mL-1。

2.3.3 線性關(guān)系考察精密量取“2.1.1”項下系列線性溶液,進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖。以N-亞硝基普萘洛爾峰面積Y為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度X(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得N-亞硝基普萘洛爾的線性回歸方程為Y=2 563.38X-161.38(r=0.999 9),結(jié)果表明在1.01～20.19 ng·mL-1濃度范圍內(nèi),N-亞硝基普萘洛爾峰面積與質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度和重復(fù)性試驗取“2.1.1”項下5.0 ng·mL-1的線性溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,得N-亞硝基普萘洛爾峰面積的RSD為1.13%,結(jié)果表明系統(tǒng)精密度良好。取鹽酸普萘洛爾緩釋片,按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,進(jìn)樣檢測,按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算N-亞硝基普萘洛爾含量,計算得6份供試品溶液中N-亞硝基普萘洛爾含量的RSD為3.58%。結(jié)果表明方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗取“2.1.1”項下5.0 ng·mL-1的線性溶液,放置于進(jìn)樣盤,分別在0、8 h進(jìn)樣檢測,結(jié)果N-亞硝基普萘洛爾峰面積的相對偏差為2.96%,結(jié)果表明5 ℃條件下對照品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定;取“2.3.4”項下1份重復(fù)性試驗供試溶液,放置于進(jìn)樣盤,分別在0、2、5、7 h進(jìn)樣檢測。結(jié)果N-亞硝基普萘洛爾峰面積的RSD(n=4)為2.66%,結(jié)果表明5 ℃條件下供試品溶液在7 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 提取效率試驗取鹽酸普萘洛爾緩釋片,按“2.1.2”項下方法平行制備2份供試品溶液,其中1份渦旋3 min,另一份渦旋10 min,進(jìn)樣檢測,按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算N-亞硝基普萘洛爾含量,計算得2份供試品溶液中N-亞硝基普萘洛爾含量相對標(biāo)對偏差為3.77%。結(jié)果表明渦旋3 min可提取完全。

2.3.7 回收率試驗取鹽酸普萘洛爾緩釋片,精密稱定,研細(xì),混勻,精密稱取細(xì)粉約57 mg(約相當(dāng)于鹽酸普萘洛爾20 mg),置15 mL離心管中,精密加入“2.1.1”項下10 ng·mL-1(高濃度)、5 ng·mL-1(中濃度)、2 ng·mL-1(低濃度)的線性溶液5 mL,渦旋3 min,濾過,取續(xù)濾液作為回收率溶液,每個濃度點平行制備3份,進(jìn)樣檢測,結(jié)果見表1,低、中、高濃度點的回收率分別為98.4%(RSD2.7%,n=3)、101.6%(RSD1.1%,n=3)、103.2%(RSD1.5%,n=3),結(jié)果表明回收率良好。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.4 樣品測定按“2.1”項下制備鹽酸普萘洛爾緩釋片供試品溶液,照“2.2”項下條件進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖,以峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算供試品溶液中N-亞硝基普萘洛爾的含量,測得鹽酸普萘洛爾緩釋片中N-亞硝基普萘洛爾含量為1.8 μg·g-1。

3 討論

由于鹽酸普萘洛爾供試品溶液濃度較高,普萘洛爾峰與N-亞硝基普萘洛爾峰需要達(dá)到較大的分離度,才能將普萘洛爾峰切入廢液不至于干擾雜質(zhì)的檢測,所以首先對不同類型的色譜柱進(jìn)行了考察,最終選用Waters ACQUITY UPLC CSHTMC18色譜柱,N-亞硝基普萘洛爾峰型良好,且可與普萘洛爾峰完全分離,但兩者洗脫時間較長,為提高實驗效率在此基礎(chǔ)上對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化,增加有機相比例以縮短分析時間;不同流動相系統(tǒng)對色譜保留和雜質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)影響非常大,對流動相系統(tǒng)進(jìn)行了考察,當(dāng)采用乙腈為流動相時體系,N-亞硝基普萘洛爾出峰較快,且質(zhì)譜響應(yīng)增強,可滿足分析的分離度要求。前期的試驗顯示N-亞硝基普萘洛爾在甲醇中易溶,在乙腈中微溶,以甲醇-水作為溶劑為較優(yōu)選擇,但緩釋片加極少量水后即成凝膠狀無法進(jìn)樣檢測,為保證提取完全和樣品檢測的準(zhǔn)確性,選擇了以甲醇作為溶劑,以甲醇作為溶劑時,存在一定的溶劑效應(yīng),N-亞硝基普萘洛爾峰前沿,峰形變寬,靈敏度降低,為此,采用較大內(nèi)徑的色譜柱,并增加進(jìn)樣體積至10 μL,即可滿足N-亞硝基普萘洛爾檢測靈敏度的要求。

目前未見N-亞硝基普萘洛爾的毒理學(xué)數(shù)據(jù),暫無明確控制限度,提示藥品研發(fā)生產(chǎn)、相關(guān)科研機構(gòu)應(yīng)對雜質(zhì)進(jìn)行深入的毒理研究以建立合理的控制限度,保障用藥安全。

4 結(jié)論

本研究建立了鹽酸普萘洛爾緩釋片中N-亞硝基普萘洛爾的UHPLC-MS/MS檢測方法,并進(jìn)行了相關(guān)方法學(xué)驗證,結(jié)果表明,所建立的方法具有良好的專屬性、靈敏度和準(zhǔn)確度,可準(zhǔn)確測定鹽酸普萘洛爾緩釋片中潛在的N-亞硝基普萘洛爾的含量,有助于鹽酸普萘洛爾緩釋片的市場監(jiān)管,保障藥品質(zhì)量安全。