周永福,姚如杰,黎學明,李應

(1.重慶紫光化工股份有限公司技術中心,重慶 401121;2.重慶大學化學化工學院,重慶 400044;3.重慶工業(yè)職業(yè)技術學院化學與制藥工程學院,重慶 401120)

九里香屬植物資源豐富,主要分布于我國的南部(海南、廣東、廣西、云南)和中南半島。全球有14個種和2個變種,其中我國有9個種和1個變種[1]。九里香屬植物藥用記載始于《嶺南采藥錄》?，F代藥理研究表明:九里香屬植物藥具有增強機體免疫力[2]、抗菌消炎和麻醉[3]、降血糖[4]、行氣止痛、活血化瘀之功效[5]。民間用于治療胃痛、風濕痹痛、牙痛、跌撲腫痛、蟲蛇咬傷[6-7];現代藥物化學研究表明,其主要含有咔唑生物堿、黃酮類、香豆素類等[8-9]化學成分。

四數九里香(MurrayatetrameraHuang)作為九里香屬植物的一種,主要分布于我國的廣東、海南、廣西、云南。在云南少數民族地區(qū)(彝族、黎族、苗族、回族、壯族、傣族)以其干燥葉入藥。調研發(fā)現,有將四數九里香干燥葉的醇提物和精油制成注射劑,用于治療肺癌的例子。另外,四數九里香富含咔唑生物堿類化合物[10],文獻[11-12]報道咔唑生物堿化合物具有抑制腫瘤細胞增殖的作用。然而,有效成分不明,藥效部位、藥效物質不清是民族藥四數九里香存在的問題,這嚴重影響了其質量標準的建立,為此,本文以95%乙醇為提取劑,采用冷浸漬法對四數九里香葉進行浸提、制得浸膏,再按溶劑極性大小依次對浸膏進行萃取、得萃取部位,利用傳統(tǒng)柱層析硅膠法對藥效部位進行分離和純化,制得單體化合物;以5株腫瘤細胞為模型,研究了四數九里香萃取液和7種咔唑生物堿成分對腫瘤細胞的體外生長抑制作用,并采用標準曲線法分析測定了四數九里香中咔唑類生物堿的含量,以期為四數九里香質量標準的建立提供參考。

1 儀器及材料

1.1 儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(濟南鑫貝西生物技術有限公司)、多功能酶標分析儀(Multiskan FC)、電子天平(ME204上海巴玖實業(yè)有限公司)、高效液相色譜儀LC-16(島津儀器蘇州有限公司),色譜柱:Dimension(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:乙腈-水溶液(55∶45),檢測波長:415 nm,流速:1.0 mL·min-1,柱溫:30 ℃,光電二極管陣列紫外可見光檢測器(SPD-M20A 230V),液相色譜儀溶液傳輸單元(LC-16)、脫氣機(DGU-20A3R)、自動進樣器(SIL-16)。

1.2 試劑95%乙醇,蒸餾水,鄰苯二甲酸氫鉀(AR),氫氧化鈉(AR);乙酸乙酯(分析純)、石油醚(分析純)、二氯甲烷(分析純)、甲醇(分析純)。

1.3 樣品四數九里香藥材經成都中醫(yī)藥大學陳新教授鑒定為蕓香科九里香屬四數九里香(MurrayatetrameraHuang)的葉,標本(標本編號:20160122001)存于重慶工業(yè)職業(yè)技術學院中醫(yī)藥物研究所;四數九里香葉粉末、質量標準控制物mahanimbine(自制)、5株腫瘤細胞購自中國科學院昆明植物所細胞庫。

2 方法與結果

2.1 實驗方法

2.1.1 提取、分離及鑒定方法四數九里香葉35 kg,自然晾干,粉碎,用95%的乙醇溶液提取,過濾、合并、濃縮、得黑色浸膏2.8 kg,溫水溶解,分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得石油醚萃取部分200 g、乙酸乙酯萃取部分680 g、正丁醇萃取部分460 g。課題組前期已經報道[13]化合物1-甲基-3-丙酰基咔唑(1)、1-甲氧基-3-乙基咔唑(2)、1-甲氧基-3-甲?；沁?3)、1-甲氧基-3-甲基咔唑(4)、1-羧基甲酯-3-甲基咔唑(5)、1-羧基甲酯-3-乙基咔唑(6)、mahanimbine(7)的結構鑒定及對肝癌腫瘤細胞SMMC-7721的毒活性,本論文研究和報道其對其他4株腫瘤細胞的毒活性,結構圖見圖1。

圖1 化合物1～7結構

2.1.2 細胞毒活性實驗方法把培養(yǎng)液DMEM(含10%胎牛血清)配成單個細胞懸液,以每孔3 000～15 000個細胞接種到96孔板,每孔體積100 μL,細胞提前12～24 h接種培養(yǎng)。供試樣用DMSO溶解,單體化合物以40 μmol·L-1濃度初篩,粗提物以100 μg·mL-1濃度進行初篩,根據下列公式計算抑制率(%);精準稱取乙酸乙酯萃取段100 mg、用DMSO溶劑溶解,定容為200 μL,以100.00、20.00、4.00、0.80、0.16 μg·mL-1濃度梯度;精密稱取各化合物1.0～3.0 mg,用DMSO溶解,以40.000、8.000、1.600、0.320、0.064 μmol·L-1濃度梯度,計算各濃度點的細胞存活率,以濃度為橫坐標,細胞存活率為縱坐標,繪制細胞生長曲線,應用兩點法(reed and muench法)計算化合物的IC50值[14],實驗均設順鉑(DDP)和紫杉醇(Taxol)兩個陽性對照化合物。

細胞抑制率(%)=(A對照-A樣品)/(A對照-A空白)×100%

式中,A空白為含有MTS溶液、培養(yǎng)液、細胞的吸光度;A對照為含有MTS溶液、培養(yǎng)液、細胞、陽性化合物的吸光度;A樣品為具有MTS溶液、培養(yǎng)液、細胞和藥物的吸光度。

2.1.3 統(tǒng)計學方法采用軟件對所有數據進行統(tǒng)計學處理,使用單因素方差分析組間均數差異性,P<0.05或P<0.01為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.1.4 溶液制備方法[15]稱取實驗室自制咔唑生物堿mahanimbine(純度98.9%)6.1 mg,置于50 mL燒杯中,加丙酮溶解、轉移至50 mL容量瓶中、甲醇定容得0.122 mg·mL-1對照品溶液;精密稱取四數九里香葉粗粉0.950 1 g,于100 mL的磨口錐形瓶中,丙酮定容、超聲波提取1 h、冷卻、過濾、備用。

2.1.5 色譜條件色譜柱:Dimension(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:乙腈-磷酸二氫鉀溶液(51 mmol·L-1)配比:55∶45,檢測波長:415 nm,流速:1.0 mL·min-1,柱溫:30 ℃,光電二極管陣列紫外可見光檢測器(SPD-M20A 230V),相色譜儀溶液傳輸單元(LC-16)、脫氣機(DGU-20A3R)、自動進樣器(SIL-16)。

2.2 實驗結果

2.2.1 各萃取餾分細胞毒活性結果分別精準稱取粗提樣,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位,水相部位各2.0～3.0 mg于復孔中,DMSO溶解,定容為200 μL,按照“2.1.2”項下方法,研究各部位對5株腫瘤細胞體外抑制作用,結果見表1。

表1 各提取液對5株腫瘤細胞體外抑制作用結果(細胞抑制率,%)

經過實驗,發(fā)現以100 μg·mL-1濃度點初篩時,四數九里香醇提液的乙酸乙酯萃取部位對5株腫瘤細胞的抑制率(%)最大,故確定乙酸乙酯萃取部位為有效部位。精準稱取乙酸乙酯萃取部位100 mg、用DMSO溶劑溶解,定容為200 μL,以100.00、20.00、4.00、0.80、0.16 μg·mL-1為濃度梯度,根據“2.1.2”項下方法計算IC50值,結果見表2。

表2 乙酸乙酯萃取段細胞毒活性IC50研究結果(IC50±SD,μg·mL-1)

2.2.2 化合物1～7細胞毒活性結果精準稱取化合物1～7各2.0～3.0 mg于復孔中,采用DMSO溶劑溶解,定容為200 μL,在40 μmol·L-1濃度下,按照“2.1.2”項下實驗方法分析化合物1～7對4株腫瘤細胞(白血病HL-60、肺腺癌A-549、乳腺癌MCF-7、結腸癌SW-480)的抑制率(%);設順鉑(DDP)和紫杉醇(Taxol)兩個陽性化合物,結果見表3。

表3 化合物1～7的腫瘤細胞毒活性測試結果(細胞抑制率,%)

經過實驗,發(fā)現7個化合物表現出抑制作用,其中對于白血病細胞HL-60,各化合物的抑制率為化合物7>化合物1>化合物6>化合物4>化合物3>化合物2>化合物5,即化合物7的抑制率最大;對于肺癌細胞A-549,各化合物的抑制率為化合物7>化合物3>化合物1>化合物4>化合物5>化合物6>化合物2,即化合物7的抑制率最大;對于乳腺癌細胞MCF-7,各化合物的抑制率為化合物4>化合物7>化合物6>化合物5>化合物2>化合物1>化合物3,即化合物4的抑制率最大;對于結腸癌細胞SW-480,各化合物的抑制率為化合物5>化合物7>化合物6>化合物4>化合物1>化合物3>化合物2,即化合物5的抑制率最大。

在此基礎之上,精密稱取各化合物1.0～3.0 mg,用DMSO溶解,以40.000、8.000、1.600、0.320、0.064 μmol·L-1為梯度濃度坐標,按照“2.1.2”項下方法進行復篩,各化合物的IC50(μmol·L-1),結果見表4。

表4 化合物1～7的細胞毒活性測試結果(IC50±SD,μmol·L-1)

在化學成分的分離及鑒定實驗研究中,發(fā)現化合物7(mahanimbine)的量大,同時對4株腫瘤細胞的毒活性表現出良好抑制作用。故選其作為質量控制標準物,分析其在民族藥四數九里香中的含量,嘗試建立測定方法,以期為民族藥四數九里香質量標準建立提供方法。

2.2.3 精密度試驗結果取mahanimbine對照品溶液,進樣量為2.0 μL,連續(xù)進樣6次,記錄峰面積值,考察在擬定條件下儀器的精密度,結果見表5。

表5 精密度試驗結果

經過試驗,RSD=1.9%,小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.2.4 標準曲線繪制取咔唑生物堿mahanimbine對照品溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 μL,依次進樣,測定峰面積,結果見表6;以進樣量X(μL)為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行線性回歸,得數學模型Y=879 307X-389 981(R2= 0.999 2)。

表6 標準曲線測定結果

研究表明,對照品咔唑生物堿mahanimbine溶液在0.11～1.45 μg之間線性關系良好。

2.2.5 穩(wěn)定性考察在色譜條件下,自動取1 μL供試品溶液進樣,每隔2 h進樣一次,記錄峰面積,結果見表7。

表7 穩(wěn)定性試驗結果

經過試驗,樣品在保存至8 h,RSD=1.28%,小于3.00%,符合穩(wěn)定性試驗的要求。

2.2.6 重復性考察取四數九里香粗粉,超聲提取,進樣量為1.0 μL,平行制備5份樣,在色譜條件下,依次進樣,記錄峰面積并計算含量,結果見表8。

表8 重復性試驗結果

重復性試驗RSD為1.98%,小于3.0%,試驗結果表明儀器重復性良好,符合重復性試驗規(guī)定。

2.2.7 加樣回收率試驗精密稱取四數九里香葉粗粉約0.1 g,共9份,分成3組,分別精密加入對照品溶液1.0、3.0、5.0 mL,每個濃度對應一個組,按提取和色譜條件進行提取和測定,記錄峰面積值,考察加樣回收率,結果見表9。

表9 加樣回收率試驗結果

試驗平均回收率值為101.33%,在95%～105%之間,RSD為1.77%,結果表明,符合加樣回收率試驗規(guī)定。

2.2.8 Mahanimbine的含量測定按照“2.1.4”項下操作方法,提取四數九里香葉待測液,連續(xù)自動進樣3次,每一次進樣量為2.0 μL,按上述擬定的色譜條件進行測定,記錄峰面積,將峰面積帶入標準曲線,計算含量,結果見表10。

表10 四數九里香中mahanimbine含量測定結果

把試驗結果代入標準曲線方程,分析測定,得民族藥四數九里香中mahanimbine的含量為61.08 μg·g-1。

3 結論與討論

本論文圍繞前期的調研,從民族藥四數九里香的藥效部位篩選、藥效物質基礎的揭示、質量控制標準物的篩選及含量測定三個方面來研究民族藥四數九里香。目前,《中國藥典》2020年版收錄九里香屬植物的兩個種,即九里香[Murrayapanaculata(L.)Jack]和小葉九里香[Murrayapaniculata(L.)var.exotica(L.)Huang];而四數九里香作為民族藥収載于地標《云南省中藥材標準》(2005年版)(第一冊·彝族藥)中,由于四數九里香抑制腫瘤細胞增殖作用藥效物質基礎的相關研究較少,從而制約了四數九里香質量控制標準體系建立,為此,本實驗以95%乙醇為提取溶劑、采用浸漬法對四數九里香進行提取、濃縮、制得粗提物,采用不同極性溶劑對粗提物進行萃取,得萃取部位,研究了各萃取部位對5株腫瘤細胞體外抑制作用。研究表明,各萃取部位對5株腫瘤細胞都具有抑制作用,但經比較,在幾個萃取部位中,乙酸乙酯萃取部位對5株腫瘤細胞的抑制(率)作用最大,從而確定醇提物的乙酸乙酯萃取部位為民族藥四數九里香的有效部位。

近些年,因咔唑生物堿具有抗炎、抗氧化和抗癌等藥理作用[16-17],故含有咔唑類生物堿的植物和咔唑類生物堿的合成成為研究的熱點。本研究從民族藥四數九里香的藥效部位即乙酸乙酯萃取部位分離、鑒定7個咔唑生物堿,并研究了這7個咔唑生物堿對4株腫瘤細胞的抑制增殖活性。結果表明,7個咔唑生物堿化合物對4株腫瘤細胞顯示出良好的抑制作用,此結果進一步揭示民族藥四數九里香抑制腫瘤細胞增殖作用的藥效物質基礎。

目前,關于民族藥四數九里香質量標準物是哪一個化合物還未確定。本研究在揭示民族藥四數九里香抑制腫瘤細胞增殖作用的藥效物質基礎之后,我們以自制的咔唑生物堿mahanimbine為質量控制標準物,采用高效液相色譜法,進一步分析咔唑生物堿mahanimbine在民族藥四數九里香中的含量,并嘗試建立快速分析四數九里香中咔唑生物堿mahanimbine的測定分析方法。本法操作簡便,結果可靠,重現性好,為四數九里香的質量標準研究提供了實驗依據。