張娟,魏霞,王海蘋,李水仙,耿雪,趙巖,祝清芬

(1.山東省食品藥品檢驗研究院,國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室,山東 濟南 250101;2.金訶藏藥<山東>健康產業(yè)有限公司,山東 濟南 250101)

白內障是由增齡、免疫和代謝異常、局部營養(yǎng)障礙、創(chuàng)傷等多種原因引起的晶狀體代謝紊亂,使晶狀體蛋白發(fā)生變性,最終導致晶狀體混濁[1]。白內障是導致老年人視力障礙的主要原因之一,位居我國致盲性眼病首位[2]。目前該病治療方法主要為單純型白內障手術、分階段手術、超聲乳化術以及聯合治療等,雖然可取得短期治療效果但長期來看手術治療后患者視網膜脫離的累積風險逐年增加,因此白內障特效藥物研發(fā)對該疾病的預防及治療至關重要[3-5]。糖性白內障發(fā)病的主要機制是血糖濃度升高,導致晶體內葡萄糖含量增加,促使晶狀體蛋白糖化,并進一步導致其結構和功能出現異常,使得晶狀體混濁,最終導致白內障的發(fā)生[6]。固本明目顆粒制備生產工藝發(fā)生改變,固本明目顆粒2(制備工藝改變)不噴入乙醇溶解的冰片、熊膽粉和丁香等揮發(fā)油,其他均與固本明目顆粒1(目前市售制劑)制備工藝一致,本研究通過D-半乳糖建立大鼠的糖性白內障模型,研究固本明目顆粒改變工藝前后對糖性白內障有無預防作用及預防作用是否存在差異。

1 材料

1.1 藥品與試劑固本明目顆粒1(國內某公司,目前市售制劑,規(guī)格:每袋裝5 g;批號:01170502-1);固本明目顆粒2(國內某公司,制備工藝改變,規(guī)格:每袋裝5 g;批號:01170502-2);吡諾克辛鈉滴眼液(湖北遠大天天明制藥有限公司,批號:170734);復方托吡卡胺滴眼液(擴瞳劑)(沈陽興齊眼藥股份有限公司,批號:170302);D-半乳糖(國藥集團化學試劑有限公司,規(guī)格:100 g;批號:20161124);總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒、谷胱甘肽-S轉移酶(GST)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、Na+-K+-ATP酶試劑盒(南京建成生物工程研究所);BCA蛋白測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司,產品編號:P0010S,200次,P0010S)。

1.2 主要儀器設備Spectramax190酶標儀(美谷分子);紫外分光光度計(日本島津公司);BS323S電子天平(Sartorius公司);YP1002N電子天平(上海精密科學儀器有限公司);恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);ZH-2型自動漩渦混合器(天津藥典標準儀器廠);3-18K臺式冷凍離心機(Sigma公司);YZ5T裂隙燈顯微鏡(蘇州六六視覺)。

1.3 實驗動物SD大鼠,SPF級,20日齡,45.15～56.84 g,雄性90只,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[生產許可證號SCXK(魯)2014 0007];飼養(yǎng)于山東省食品藥品檢驗研究院屏障環(huán)境動物實驗室[使用許可證號為SYXK(魯)2013 0012]。

飼養(yǎng)條件:溫度:20～26.0 ℃,相對濕度:40%～70%,日溫差≤3 ℃,照明時間:12 h明暗交替,換氣次數:≥15次每小時。大、小鼠繁殖飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司),飼料生產許可證號:京飼證(2014)06054;實驗動物(飼料)生產許可證號:SCXK(京)2014-0010。

2 方法[7]

2.1 劑量設計及依據試驗時以人體推薦劑量的10倍作為固本明目顆粒1和固本明目顆粒2中劑量組(根據藥理實驗設計中動物劑量換算[8],前期急性毒性及預試驗的結果設定)。本品用法用量為:一次5 g,一天2～3次。成人體重按60 kg計算,相當于每日最大用量為0.25 g·kg-1。人體推薦量的10倍可作為中劑量,即2.5 g·kg-1,低劑量和高劑量分別設計為1.25 g·kg-1和5 g·kg-1。

2.2 分組與給藥取20日齡雄性大鼠90只,隨機分為9組,分為空白對照組、模型對照組、吡諾克辛鈉滴眼液陽性對照組、固本明目顆粒1和2 均設 1.25、2.5、5 g·kg-13個劑量組,每組10只。分組后固本明目顆粒1和2 各組灌胃給予相應劑量的藥物溶液10 mL·kg-1,每天1次,連續(xù)21 d。空白對照組、模型對照組給予同體積的純化水,陽性對照組給予吡諾克辛鈉滴眼液,每天2次,每次1～2滴。同時大鼠22日齡起模型對照組、陽性對照組、固本明目顆粒1和固本明目顆粒2各劑量組喂養(yǎng)D-半乳糖溶液,1～7 d喂養(yǎng)12.5%D-半乳糖溶液, 8～19 d喂養(yǎng)10%D-半乳糖溶液;每周稱量2次體重。

2.3 指標檢測分別在造模第3、11、14、19天,用復方托吡卡胺滴眼液散瞳,裂隙燈顯微鏡下觀察、拍照并記錄晶狀體渾濁度,根據糖性白內障分級標準進行評分。造模第19天末次藥后處死動物,后囊法取出晶狀體,生理鹽水漂洗后,濾紙吸干表面水分,分別稱重后放入試管中,加入提前預冷的磷酸鹽緩沖液,在冰水浴的條件下,勻漿并制成20%組織勻漿液。4 ℃,2 000 r·min-1,10 min條件下離心,取上清液按照試劑盒中說明書操作,測定SOD、GSH、GST、GSH-Px、Na+-K+-ATP酶抗氧化指標。試驗結束時,每組2只大鼠取出眼球經Davidson′s氏液固定,固定24 h后移至10%中性福爾馬林液固定,石蠟包埋后切片,HE染色鏡檢并報告。

糖性白內障分級標準[9]如下:

0級:晶狀體完全透明、無任何混濁;1級(囊泡初期):晶狀體周邊出現細小囊泡或者囊泡群;2級(囊泡期):細小囊泡、中等囊泡逐漸由赤道部向前極皮質擴展,形成環(huán)狀帶,環(huán)帶逐漸增寬至晶狀體直徑的1/3～2/3,伴有或者不伴有“Y”擴張;3級(皮質期):皮質呈現不規(guī)則的條紋狀或劍竹狀向前極放射的絮狀混濁灶,并逐漸形成彌漫性灰色至灰白色的絮狀混濁,晶狀體核尚透明;4級(核混濁期):晶狀體除皮質絮狀混濁外,核密度也逐漸增高,顏色由灰色向灰白、白色發(fā)展,伴有或不伴有水泡和“Y”擴張;5級(成熟期):晶狀體皮質開始進一步由絮狀混濁向致密白色混濁發(fā)展,最終與核融為一體呈白色球狀物。

2.4 使用統(tǒng)計學方法SPSS軟件16.0單因素方差分析,各組之間比較采用LSD或者Dunnetts T3進行分析。

3 結果

3.1 固本明目顆粒對D-半乳糖性白內障晶狀體渾濁程度的影響結果見表1和圖1,空白對照組大鼠晶狀體均完全透明、無任何混濁。固本明目顆粒1各劑量組和固本明目顆粒2各劑量組大鼠晶狀體在5級(成熟期)的眼數明顯比模型對照組少。

圖1 試驗結束時各劑量組晶狀體觀察結果

表1 試驗結束時各組晶狀體渾濁眼數分布(左右眼)

3.2 固本明目顆粒對D-半乳糖性白內障抗氧化指標的影響結果見表2,與空白對照組比較,模型對照組大鼠晶狀體中GSH和SOD含量明顯降低(P<0.01);與模型對照組比較,固本明目顆粒1低劑量組GSH、中劑量組SOD、高劑量組GST明顯升高(P<0.05);固本明目顆粒2中、高劑量組GSH、中劑量組SOD明顯升高(P<0.05和P<0.01);其他指標未見統(tǒng)計學差異。

表2 固本明目顆粒對D-半乳糖性白內障晶狀體抗氧化指標的影響

3.3 組織病理學檢查結果結果見圖2,空白對照組、陽性對照組以及固本明目顆粒1和顆粒2各劑量組動物角膜、視網膜結構完整、層次分明,均未見明顯組織病理學改變。模型對照組出現晶狀體萎縮,晶狀體囊與虹膜粘連,晶狀體變性,晶狀體纖維排列不規(guī)則、分界不清,局灶性晶狀體纖維肥大,晶狀體纖維液化等。本實驗室條件下,陽性對照組、固本明目顆粒1和顆粒2組與模型對照組比較,均未見明顯改善。

圖2 試驗結束時各劑量組晶狀體組織的病理學改變

4 討論

外傷、營養(yǎng)障礙等均可引起晶狀體代謝紊亂,從而導致白內障的產生。其對于視力危害極大,嚴重影響日常生活[10]。D-半乳糖介導的嚙齒動物衰老模型已廣泛應用于衰老相關性疾病及抗衰老研究[1]。本研究采用20日齡大鼠給予D-半乳糖造模,建立了成熟的糖性白內障模型,從而進行研究固本明目顆粒對糖性白內障損傷的保護作用,比較固本明目顆粒工藝改變前后的作用差別。試驗結果表明,試驗建立的糖性白內障模型,在較短的時間(19 d)內,大鼠能夠發(fā)生典型的白內障,100%的大鼠晶狀體渾濁度達到3級以上,80%晶狀體渾濁度達到4級以上,70%晶狀體渾濁度達到5級。而且發(fā)生的階段容易控制,有利于進行研究藥物對白內障損傷的保護效果。

據文獻報道[11],在糖尿病性或者糖性白內障模型中,晶狀體的首發(fā)改變是在赤道部發(fā)生球狀變性和混濁。采用照相法對造模第3、11、14、19天大鼠晶狀體渾濁程度進行記錄并評分,結果發(fā)現晶狀體的最開始的改變是從赤道部發(fā)生空泡、球狀變性和渾濁。因此,除了檢測生化指標的改變,用照相法記錄大鼠的晶狀體形態(tài)改變,是非常重要的[12]。本研究結果顯示,固本明目顆粒1和固本明目顆粒2均能明顯緩解大鼠晶狀體渾濁,且固本明目顆粒工藝改變前后未見明顯差異。

晶狀體滲透性膨脹的同時伴隨著氧化還原狀態(tài)的失衡[13]。選擇測定谷胱甘肽生化指標,因為其在晶狀體中含量高,容易檢測[12]。晶狀體中谷胱甘肽濃度降低,是已知的不可逆轉的白內障發(fā)生首先出現的生化異常,而且是特征性的[14]。除了谷胱甘肽(GSH),選擇了總超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽-S轉移酶(GST)、Na+-K+-ATP酶的生化指標,結果表明,固本明目顆粒1能夠明顯促進GSH、SOD、GST濃度的升高;固本明目顆粒2能夠明顯促進 GSH、SOD濃度的升高,固本明目顆粒1和固本明目顆粒2未見相關抗氧化指標有明顯差異,提示其發(fā)揮治療D-半乳糖性白內障藥效可能與保護細胞免受氧化損傷相關。

綜上所述,提示固本明目顆粒1和固本明目顆粒2對D-半乳糖性白內障有一定的抗氧化作用。研究結果未發(fā)現固本明目顆粒制備工藝改變前后有明顯變化,本研究為固本明目顆粒的生產工藝提供了參考依據。