王天煜,于慧,邢中夫,康璇,劉紅燕,孫久蘭,趙詩(shī)陽,趙盼

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355;2.平陰縣特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心,山東 平陰 250400)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一組由胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足,胰腺或(和)胰島素利用障礙所引起的代謝紊亂性疾病。主要分為1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)[1]。國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)(International Diabetes Federation,IDF)數(shù)據(jù)顯示,截至2021年,中國(guó)有1.7億成年人患有糖尿病,占全球患病人數(shù)的31.7%,成為全球糖尿病患者最多的國(guó)家之一[2],預(yù)計(jì)到2035年,全球糖尿病患者將達(dá)到5.92億[3]。

目前,臨床上治療糖尿病的藥物以西藥為主,如瑞格列奈、伏格列波糖、阿卡波糖等,但此類藥物在長(zhǎng)期服用過程中有著明顯的副作用如:腎功能障礙、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等[4]。近年來,從天然藥用植物中尋找和開發(fā)能有效治療糖尿病的藥物已成為新的研究熱點(diǎn)。

玫瑰為薔薇科薔薇屬,多年灌木生植物,在我國(guó)各地均有種植,具有疏肝解郁、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)等功效[5]?，F(xiàn)代研究表明玫瑰花中含有黃酮、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖等多種化合物,其中黃酮類成分是主要活性成分之一,具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗毒性、抗抑郁等作用[6]。周達(dá)等[7]通過體外小鼠實(shí)驗(yàn)證明了玫瑰花黃酮對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有顯著的降血糖作用。郭玉婷等[8]通過體外α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)證明玫瑰花對(duì)α-葡萄糖苷酶有較好的抑制作用。但其黃酮類成分降血糖作用機(jī)制仍不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論,可以從整體考察“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[9],對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科,得到學(xué)界的廣泛關(guān)注和應(yīng)用。目前已有研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對(duì)玫瑰花與疾病之間的作用機(jī)制進(jìn)行多通路的分析,如嚴(yán)寶飛等[10]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討了玫瑰花的潛在藥理作用及其機(jī)理,但未闡述玫瑰花治療糖尿病的具體機(jī)制。因此本研究在此基礎(chǔ)上以玫瑰花黃酮為研究對(duì)象,采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究玫瑰花黃酮多途徑、多層次、多靶點(diǎn)間復(fù)雜的相互作用關(guān)系,旨在從天然產(chǎn)物中尋找能夠有效治療2型糖尿病的成分,為天然藥物治療2型糖尿病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要活性成分的建立課題組前期對(duì)玫瑰花黃酮進(jìn)行提取純化并進(jìn)行質(zhì)譜定性檢測(cè),通過對(duì)照品比對(duì)以及查閱文獻(xiàn)方式建立了玫瑰花黃酮化合物庫(kù)。登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)[11],設(shè)置類別為“Chemical name”,使用化合物英文名稱作為關(guān)鍵詞,收集整理活性成分的OB值和DL值,將整理出的化合物作為玫瑰花黃酮活性成分。將在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得的相應(yīng)化合物的SMILES name輸入到SwissTargetPrediction(www.swisstargetprediction.ch)[12]網(wǎng)站中,選擇物種為“Homo sapiens”,獲取相應(yīng)的基因靶點(diǎn),建立最終的活性成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選使用Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[13](https://www.genecards.org/)以“diabetes mellitus type 2”為關(guān)鍵詞篩選與2型糖尿病有關(guān)的疾病基因靶點(diǎn)。再將上述獲得的化合物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)合并取交集,導(dǎo)入到Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中,建立疾病—化合物共同靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為進(jìn)一步了解玫瑰花黃酮成分治療糖尿病靶點(diǎn)的相互作用,將整理得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到String(https://cn.string-db.org)中,設(shè)置物種種類為“Homo sapiens”構(gòu)建ppi靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,將結(jié)果以tsv格式導(dǎo)出,導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.0中,選擇“Analyze Network”選項(xiàng)進(jìn)行分析,最終以度(degree)值為依據(jù),選擇度值前十的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.4 交集靶點(diǎn)的GO分析和KEGG通路分析將疾病—化合物交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)[14]中進(jìn)行GO生物過程富集分析以及KEGG信號(hào)通路分析,登錄“微生信”網(wǎng)站(https://www.bioinformatics.com.cn)選擇“富集氣泡圖”,將GO分析和KEGG分析的結(jié)果以圖片形式進(jìn)行展示。

1.5 活性成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接首先借助Chem3D軟件對(duì)之前篩選出的化合物進(jìn)行能量最小化處理,在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www1.rcsb.org)搜索α-淀粉酶(α-amylase)的相關(guān)蛋白,選擇5mey蛋白,下載其pdb格式保存,去除水分子和配體。再通過SYBYL-X軟件將篩選出的玫瑰花黃酮化合物進(jìn)行分子對(duì)接,得到相應(yīng)的打分結(jié)果,最后運(yùn)用Pymol 2.5.0將能量最低形態(tài)的化合物與蛋白對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理,以圖片的形式導(dǎo)出并進(jìn)行展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分和作用預(yù)測(cè)靶點(diǎn)收集課題組根據(jù)對(duì)照品比對(duì)及文獻(xiàn)查詢,得到玫瑰花黃酮提取物成分解析,選擇槲皮素、芹菜素、金絲桃苷、落新婦苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、橙皮苷、木犀草素、山柰酚、柚皮素、雞豆黃素A和櫻黃素作為主要活性成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理研究,并在TCMSP網(wǎng)站中收集它們的OB和DL值。分別將以上11種活性化合物名稱輸入到PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中取得相應(yīng)的SMILES name,再將SMILES name輸入SwissTargetPrediction網(wǎng)站中,以“Homo sapiens”為調(diào)查的物種,獲得各個(gè)化合物所對(duì)應(yīng)的靶基因,建立化合物靶點(diǎn)庫(kù)。

2.2 疾病和化合物靶點(diǎn)的篩選篩選出的11種活性化合物在SwissTargetPrediction網(wǎng)站中共獲得772個(gè)靶點(diǎn),去除重復(fù)項(xiàng)后得到246個(gè)靶點(diǎn)。在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“diabetes mellitus type 2”為關(guān)鍵詞,以打分值大于43為標(biāo)準(zhǔn),去重后共檢索出與2型糖尿病相關(guān)的基因靶點(diǎn)7 548個(gè),使用Venny2.1.0對(duì)疾病靶點(diǎn)與活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行維恩圖繪制,得到共同靶點(diǎn)207個(gè),見圖1,其中靶點(diǎn)包括NOX4、AVPR2、MMP13、PIK3R1等。

圖1 玫瑰花活性成分靶點(diǎn)與糖尿病交集靶點(diǎn)

表1 玫瑰花黃酮活性成分及其參數(shù)

2.3 “藥物成分—作用基因”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將“2.2”項(xiàng)下收集到的化合物成分與其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因信息錄入到Cytoscape 3.9.0中生成“藥物成分—作用基因”網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果如圖2所示。圖中共有218個(gè)節(jié)點(diǎn),667條邊,節(jié)點(diǎn)之間的連線表明兩者之間存在相互作用關(guān)系,連線越密集則兩者關(guān)聯(lián)度越高。其中,各化合物與編號(hào)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系及各自匹配到的靶標(biāo)數(shù)如表2所示。通過靶標(biāo)數(shù)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),可以分析得到槲皮素、芹菜素、橙皮苷、木犀草素、山柰酚、柚皮素的靶標(biāo)數(shù)均較多,推測(cè)這些化合物可能在糖尿病的治療或輔助治療中發(fā)揮重要作用。

圖2 玫瑰花“藥物成分—作用基因”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 化合物編號(hào)及靶標(biāo)數(shù)

2.4 玫瑰花治療糖尿病的作用靶點(diǎn)拓?fù)浞治鍪褂肧tring數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建ppi靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)互作圖,將“2.2”項(xiàng)下得到的疾病和化合物交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String中,得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(如圖3所示),其中number of nodes=207、number of edges=2 144、average node degree=20.7、avg.local clustering coefficient=0.527、expected number of edges=851。將所得結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出,使用Cytoscape 3.9.0軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?以“Analyze Network”選項(xiàng)中共有靶點(diǎn)的自由度、介數(shù)和中心性作為參考標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)AKT1(degree=111)、TNF(degree=100)、VEGFA(degree=92)等綜合排名較高,具體情況如表3所示,表明這些靶點(diǎn)是玫瑰花黃酮成分治療糖尿病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 ppi蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖

表3 ppi核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果

2.5 GO生物學(xué)功能富集分析為進(jìn)一步探究玫瑰花黃酮治療糖尿病的多重作用機(jī)制,將207個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID中進(jìn)行GO富集分析,共得到富集結(jié)果208條。選擇前20條富集結(jié)果的生物過程(bp)、分子功能(mf)和細(xì)胞組成(cc)以氣泡圖的形式展示,如圖4所示。其中,生物過程(BP)方面主要與蛋白質(zhì)磷酸化、MAP激活酶與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的調(diào)控、蛋白酶信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡通路有關(guān);分子功能(MF)方面主要與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、酶結(jié)合與ATP結(jié)合、相同蛋白結(jié)合和蛋白磷酸酶結(jié)合等過程有關(guān);細(xì)胞組成(CC)方面則主要涉及質(zhì)膜的組成、細(xì)胞外泌體、細(xì)胞質(zhì)和胞外區(qū)等。

圖4 GO功能富集分析圖

2.6 KEGG通路分析

將207個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路分析,物種選擇“Homo sapiens”,共得到分析結(jié)果186條。將富集結(jié)果較顯著的前20條結(jié)果以富集氣泡圖的形式進(jìn)行展示,如圖5所示,圖中圓圈的大小表示相關(guān)靶點(diǎn)在該通路富集的多少,越大代表通路越多;圓圈的深淺代表富集的程度,顏色越淺程度越高。其中癌癥通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病AGE-RAGE信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路富集程度較高,推測(cè)玫瑰花黃酮化合物主要是通過與這幾條通路相互作用發(fā)揮治療2型糖尿病的作用。

圖5 KEGG富集結(jié)果氣泡圖

2.7 分子對(duì)接結(jié)果網(wǎng)絡(luò)藥理結(jié)果已經(jīng)得出部分關(guān)鍵靶點(diǎn)玫瑰花治療糖尿病方面所發(fā)揮的積極作用,于是為了進(jìn)一步探究玫瑰花對(duì)人體內(nèi)糖類分解酶的作用效果,選擇α-淀粉酶的結(jié)晶復(fù)合物蛋白5mey與玫瑰花中活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。將對(duì)接結(jié)果以總打分值(Total Score)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),選擇打分排名前十的化合物為對(duì)接結(jié)果較好的化學(xué)成分,Total Score越高說明化合物分子與蛋白結(jié)合越穩(wěn)定。篩選出的有效活性成分結(jié)果如表4所示。其中橙皮苷、落新婦苷、槲皮素等均與蛋白結(jié)合穩(wěn)定,推測(cè)將會(huì)有不錯(cuò)的作用效果。將化合物與蛋白進(jìn)行可視化展示,部分展示結(jié)果如圖6所示。

圖6 分子對(duì)接可視化結(jié)果

表4 活性成分與靶標(biāo)蛋白分子對(duì)接得分

3 討論

中藥作為我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論體系指導(dǎo)下使用的天然藥物,經(jīng)過千百年來的人用經(jīng)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)其在糖尿病及其并發(fā)癥的治療方面有著良好的療效和廣闊的發(fā)展前景。而網(wǎng)絡(luò)藥理作為近年來新興的分析學(xué)科,與玫瑰花這一傳統(tǒng)中藥相結(jié)合,能夠從靶點(diǎn)通路角度為玫瑰花治療糖尿病的機(jī)制提供新的研究思路[15]。因此本實(shí)驗(yàn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究玫瑰花治療2型糖尿病的作用機(jī)理。

結(jié)果方面,槲皮素、山柰酚、木犀草素、橙皮苷和芹菜素在PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建中靶標(biāo)數(shù)較多,說明這幾種化合物是玫瑰花黃酮成分中對(duì)糖尿病起治療作用的關(guān)鍵活性成分。其中,有相關(guān)研究證明槲皮素、山柰酚和木犀草素與AKT1、TNF、EGFR和VEGFA等靶點(diǎn)相關(guān)性較高,并且能通過癌癥通路、AGE-RAGE通路和PI3K-AK通路等關(guān)鍵信號(hào)通路發(fā)揮治療糖尿病的作用[16-18],是治療糖尿病方面關(guān)鍵的活性成分。劉春穎等[19-20]通過實(shí)驗(yàn)證明了芹菜素可以通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制小鼠腸道中α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶和麥芽糖酶的活性來發(fā)揮降血糖的藥理作用。橙皮苷則是通過抑制細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)的途徑、調(diào)控TNF相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)糖尿病有一定的預(yù)防保護(hù)和改善作用[21]。

4 結(jié)論

綜上所述,玫瑰花主要通過含有的槲皮素、木犀草素和山柰酚等黃酮成分來調(diào)控人體內(nèi)AGE-RAGE、PI3K-Akt等信號(hào)通路,從而發(fā)揮治療2型糖尿病的作用。研究結(jié)果為玫瑰花用于治療2型糖尿病的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。