尹瓊,張瀚濤,范春蘭,王洪平,張潤,林兆洲,趙平

(1.北京同仁堂股份有限公司科學研究所,北京 100079;2.北京中研同仁堂醫(yī)藥研發(fā)有限公司,中藥復方新藥開發(fā)國家工程研究中心,北京 100079;3.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠,北京 100079;4.中南民族大學生命科學學院,湖北 武漢 430074)

在血糖正常的高胰島素狀態(tài)下,約80%的葡萄糖攝取發(fā)生在骨骼肌,是餐后狀態(tài)下葡萄糖攝取和糖原合成的主要場所[1]。在調節(jié)骨骼肌中的葡萄糖攝取(glucose uptake)時,最重要的一步是葡萄糖通過葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter type 4,GLUT4)進入到細胞中[2]。因此葡萄糖攝取量由細胞膜上的GLUT4的數(shù)量決定的。GLUT4是一種高親和力的葡萄糖轉運蛋白,具有12個跨膜結構的蛋白,氨基端和羧基端都位于細胞膜內(nèi)側,能夠轉移并定位在細胞膜上[3],從而促進葡萄糖沿著濃度梯度以胰島素依賴的方式擴散到肌肉和脂肪細胞。在低胰島素水平的基礎條件下,大部分GLUT4被包裝在被稱為GLUT4儲存囊泡(GLUT4 storage vesicles,GSVs)的胞內(nèi)膜室中,只有大約5%的轉運蛋白位于細胞表面。當胰島素水平升高時,GSVs轉移到質膜,通過胞吐作用與質膜連接和融合。GLUT4在胰島素作用下轉移到質膜后,將增加葡萄糖攝取10～30倍[4]。

胰島素促進肌肉和脂肪組織充分攝取葡萄糖的作用對維持正常的葡萄糖穩(wěn)態(tài)至關重要。胰島素誘導的GLUT4向質膜易位受損被認為是胰島素抵抗和2型糖尿病(T2DM)發(fā)展的初始步驟之一,因此胰島素誘導的GLUT4易位成為抗糖尿病藥物研究的熱門目標[4]。目前,利用基于GLUT4易位分析的篩選方法來識別可用于提高葡萄糖清除率、降低血糖或提高胰島素敏感性的類胰島素物質的研究正受到廣泛關注[5]。

L6成肌細胞株是Yaffe[6]從大鼠大腿肌的原代培養(yǎng)物中分離得到。L6骨骼肌細胞株保留有很多骨骼肌的性質,被用于研究響應胰島素的葡萄糖代謝反應[7]。通過將人的c-myc 表位插入到GLUT4上,并將此質粒穩(wěn)定轉染到 L6 肌原細胞,形成了L6-GLUT4myc大鼠成肌細胞系,通過檢測 myc表位,可方便地用類似 ELISA 的方法測定細胞表面GLUT4 密度[8]。

傳統(tǒng)中草藥資源已經(jīng)成為發(fā)掘新型抗糖尿病藥物的熱點;生脈飲由紅參、麥冬、五味子組成。其主治范圍十分廣泛,臨床常用于治療冠心病、心力衰竭、心律失常、糖尿病等。生脈飲中的3種藥材紅參、麥冬、五味子也常見于治療消渴癥的各類藥方中[9],但是大部分關于這3種藥材的研究多集中于使用動物模型來檢測對GLUT4的影響[10-12],又或者使用的細胞模型并沒有和高內(nèi)涵成像儀方法結合[13,14],因此不確定是否可用作為篩選模型。

因此本研究將以GLUT4作為藥物篩選的一個靶點,并使用L6-GLUT4myc細胞模型,結合高內(nèi)涵篩選技術對這3種中藥的總提取物進行檢測,觀察這3種中藥的總提取物是否可以增加GLUT4易位,以確定此方法是否后續(xù)可用于大規(guī)模的藥物篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞L6-GLUT4myc-eGFP(后續(xù)寫為L6-GLUT4myc)穩(wěn)轉細胞株來自山東維真生物科技有限公司(中國);L6細胞株來自浙江美森(中國)。

1.1.2 試劑Alpha MEM(α-MEM)培養(yǎng)液、胰酶、雙抗(P/S)以及胎牛血清(FBS)均來自Gibco公司(美國);CCK8試劑盒來自普利萊(中國);Myc-Tag抗體(#2272)來自CST公司(美國);胰島素溶液來自Sigma-Aldrich(美國);山羊抗兔IgG H&L(HRP)預吸附二抗(ab7090)、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor 647)預吸附二抗(ab150083)來自Abcam公司(美國);馬血清(26050088)來自Gibco公司(美國);OPD 底物片劑(鄰苯二胺二鹽酸鹽,34006)和Thermo PierceTM穩(wěn)定過氧化物底物緩沖液(10×,34062)均來自Thermo Fisher Scientific公司(美國);葡萄糖(GLU-OX)檢測試劑盒(氧化酶法)來自英科新創(chuàng)有限公司(中國)。

1.1.3 儀器超凈臺來自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;5% CO2培養(yǎng)箱和離心機均來自美國Thermo Fisher Scientific公司;Operetta CLS高內(nèi)涵儀器來自美國Perkin Elmer公司,酶標儀EPOCH2來自美國Biotech公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清以及1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基,于37 ℃,5%C02條件下培養(yǎng)L6以及L6-GLUT4myc大鼠骨骼肌細胞。L6和L6-GLUT4myc以3×103種于96孔板;L6-GLUT4myc以6×104種于24孔板。1～2 d后用低血清分化培養(yǎng)基[2%(V/V)馬血清和1%(V/V)P/S]替代成肌細胞分化培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基每2 d更換1次。成肌細胞分化后5～7 d內(nèi)融合形成多核肌管。

1.2.2 CCK8實驗細胞活力實驗通過CCK8試劑盒進行檢驗。L6以3×103/孔種于96孔板,24 h培養(yǎng)后,換成分化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3～6 d。紅參、麥冬、五味子3種藥材打碎后,加入DMSO溶解后超聲1 h。之后按照濃度進行配置,藥物濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1、2 mg·mL-1。細胞分為對照組和給藥組,對照組加入等量的DMSO溶液。給藥組加入不同濃度的3種藥物。所有組干預24 h后加入CCK8試劑孵育2 h,之后在OD450進行讀數(shù),計算細胞增殖活力,并選出合適的藥物濃度。

1.2.3 GLUT4myc易位的測定(OPD法)L6-GLUT4myc細胞以6×104/孔種于24孔板后,分化后進行血清饑餓3 h后將細胞分為對照組(無血清培養(yǎng)液),陽性對照組(胰島素100 nmol·L-1)以及給藥組(10 μg·mL-1和50 μg·mL-1的3種藥物),并孵育30 min。用預冷的含1 mmol·L-1Ca2+和1 mmol·L-1Mg2+的D-PBS清洗后,加入預冷的多聚甲醛溶液固定10 min,用D-PBS清洗一次。加入0.1 mol·L-1的甘氨酸,室溫孵育10 min。清洗后加入5%(V/V)山羊血清孵育10 min。4 ℃孵育一抗(1∶200)1 h后,D-PBS清洗3次后,4 ℃孵育二抗IgG H&L(HRP,1∶1 000)1 h。室溫洗去多于抗體,加入底物鄰苯二胺(OPD,o-phenylenediamine),避光反應30 min,加入3 mol·L-1HCL終止反應。OD492測定上清吸光值,然后減去背景孔的數(shù)值后,計算細胞膜上的量,結果表示為相對于對照組的倍數(shù)。

1.2.4 免疫熒光檢測質膜上GLUT4myc-GFPL6-GLUT4myc細胞以3×103/孔種于96孔板后,分化后進行血清饑餓3 h后將細胞分為對照組(無血清培養(yǎng)液),陽性對照組(胰島素100 nmol·L-1)以及給藥組(10 μg·mL-1和50 μg·mL-1的3種藥物),并孵育30 min。用PBS清洗后加入4% 多聚甲醛溶液,在冰上固定30 min。之后PBS清洗一次,0.1 mol·L-1的甘氨酸室溫孵育15 min。PBS清洗3次,加入5% 山羊血清的封閉液,室溫封閉30 min。加入一抗(1∶100),37 ℃孵育1 h,PBS清洗后,加入二抗(山羊抗兔Alexa Fluor 647,1∶1 000)以及DAPI進行孵育,37 ℃ 1 h。最后用PBS清洗干凈后,用高內(nèi)涵儀器進行讀數(shù)。

1.2.5 葡萄糖攝取實驗L6細胞以3×103/孔種于96孔板后,細胞分化后進行血清饑餓3 h后將細胞分為對照組(無血清培養(yǎng)液),陽性對照組(胰島素100 nmol·L-1)以及給藥組(10 μg·mL-1和50 μg·mL-1的3種藥物),并孵育30 min。30 min后另取一個新的 96 孔板,按照試劑盒說明書對每孔加入 200 μL 葡萄糖氧化酶試劑,并另取一排加入氧化酶試劑后加入 2 μL 葡萄糖標準蛋白液,從舊 96 孔板中一對一地取上清液 2 μL 加入新板中,隨后用酶標儀505 nm測量吸光值,以下公式計算[樣本管吸光度(30 min)]/[校準管吸光度(30 min)×校準品中的葡萄糖濃度(mmol·L-1)]來表示葡萄糖濃度(mmol·L-1),葡萄糖濃度的差值即得葡萄糖攝取(消耗率)。

1.2.6 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)都顯示為平均值±標準差(mean±SD)。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行評估。采用Bonferroni多重比較檢驗評估平均值之間的差異。使用了SPSS和Graph Pad Prism軟件進行統(tǒng)計結果分析,P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 24 h不同濃度藥物對細胞損傷效果為了避免過高的濃度引起細胞死亡,我們使用CCK8法對3種藥物的總提取物的給藥時間和濃度進行檢測。結果顯示在干預24 h后,相較于正常組 ,當濃度低于0.1 mg·mL-1時,除了五味子,麥冬和紅參均不會影響細胞活性。而3種藥物總提取物濃度從0.2 mg·mL-1到 2 mg·mL-1都顯著地降低了細胞活性,因此不予考慮(見圖1A)。為進一步檢測合適的濃度,在0到0.1 mg·mL-1濃度中設置了兩個低濃度組,為0.01 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1(10 μg·mL-1和50 μg·mL-1)。相較于正常組,當3種藥物總提取物濃度在0.01 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1濃度時,細胞活性均無影響(見圖1B)。因此后續(xù)實驗每種藥物都將使用0.01 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1的濃度。

A.24 h不同濃度的3種藥物對L6細胞的損傷效果;B.24 h低劑量濃度的3種藥物對L6細胞的損傷情況

2.2 3種中藥單體對L6細胞葡萄糖攝取的影響為了驗證3種中藥提取物可能的降糖活性,我們首先研究了它們的葡萄糖攝取效果。L6細胞經(jīng)過血清饑餓后,加入胰島素(100 nmol·L-1)和不同濃度的3種藥物總提取物孵育30 min后進行檢測,結果如圖2顯示(L6細胞以3×103/孔種于96孔板后,分化后進行血清饑餓3 h,加入胰島素100 nmol·L-1以及不同濃度藥物孵育30 min)。胰島素作為陽性對照顯著地促進了L6肌細胞的葡萄糖攝取,說明選擇的系統(tǒng)和構建的模型成功。與正常組(Control)相比,麥冬總提取物在10 μg·mL-1與50 μg·mL-1的平均葡萄糖攝取率為(2.01±0.11)倍與(2.10±0.17)倍(P<0.05)。紅參總提取物在10 μg·mL-1和 50 μg·mL-1的平均攝取率分別為(1.66±0.08)和(1.67±0.16)倍(P<0.05)。麥冬和紅參總提取物都顯著增加了細胞的葡萄糖攝取,而五味子的總提取物只有在10 μg·mL-1時提高了葡萄糖攝取率,50 μg·mL-1的與正常組相比并沒有顯著區(qū)別。

圖2 3種藥物總提取物的葡萄糖攝取實驗結果

2.3 OPD法測定細胞膜上GLUT4myc為了探討3種藥物總提取物誘導L6肌細胞葡萄糖攝取增加的機制,我們通過OPD法檢測了它們的總提取物對L6-GLUT4myc 細胞中GLUT4的易位效果。如圖3結果顯示與正常組(Control)相比,胰島素組(Insulin,100 nmol·L-1)明顯增加了細胞膜表面GLUT4-myc的數(shù)量(2.19倍,P<0.001),證明實驗體系是成功的。麥冬、五味子、紅參的總提取物在10 μg·mL-1下刺激L6-GLUT4myc肌管細胞膜表面GLUT4myc的數(shù)量為基礎狀態(tài)(正常組)的(1.32±0.08)、(1.66±0.12)、(1.60±0.07)倍(P<0.05)。這3種藥物的總提取物增加GLUT4myc的倍數(shù)基本相似,但水平都低于胰島素組。而在50 μg·mL-1濃度時,麥冬和紅參增加的倍數(shù)為(1.56±0.07)和(1.61±0.05)(P<0.05)。而五味子在50 μg·mL-1時并不能刺激GLUT4myc的易位。此實驗表明,3種藥物僅在低濃度(10 μg·mL-1)時顯著地刺激了L6-GLUT4myc肌管GLUT4myc易位,而在高濃度時(50 μg·mL-1)只有麥冬和紅參刺激了GLUT4myc易位。

圖3 OPD法檢測GLUT4-myc易位

2.4 高內(nèi)涵儀器檢測L6細胞內(nèi)GLUT4的易位由于細胞內(nèi)GLUT4易位到細胞表面可以發(fā)揮葡萄糖攝取功能,我們結合高內(nèi)涵成像儀(免疫熒光法)進一步分析了3種藥物提取物處理下L6細胞的GLUT4易位。如圖4A顯示,高內(nèi)涵成像儀檢測的結果基本和OPD法相似。其中胰島素顯著增加了GLUT4-myc的表達為(1.40±0.06)(P<0.05)。紅參和麥冬的總提取物在10 μg·mL-1和50 μg·mL-1時都增加了GLUT4-myc的易位(P<0.05)。同OPD法,五味子僅在10 μg·mL-1的濃度下增加GLUT4-myc的易位(P<0.05)。圖4B顯示的是細胞膜上GLUT4myc-GFP的情況,如圖4所示,紅參和麥冬50 μg·mL-1以及胰島素的熒光強度明顯較強。

3 討論

葡萄糖轉運蛋白4 是抗糖尿病的靶點之一,其在肌肉和脂肪組織中廣泛分布,是維系機體血糖平衡的關鍵因子?；鵊LUT4研發(fā)新一代抗糖尿病藥物已成為研究熱點,中草藥資源也已經(jīng)成為發(fā)掘新型抗糖尿病藥物的熱點。紅參、麥冬、五味子作為治療消渴癥常見中藥,大部分的研究都集中于動物體上,對于應用在體外的篩選模型的相關研究非常少。本實驗通過使用高內(nèi)涵成像儀檢測了3種中藥的提取物對GLUT4易位的效果。在L6-GLUT4myc的細胞模型上證明了紅參、麥冬、以及五味子的總提取物均增加了葡萄糖代謝和GLUT4的易位。此外,本實驗也證明L6-GLUT4myc細胞株是可用于研究葡萄糖攝取和 GLUT4 易位的細胞模型,在結合高內(nèi)涵儀器檢測后,可以進行高通量(96孔板或者384孔板)的半定量和定性的結果統(tǒng)計,并用于研究新型抗糖尿病藥物的篩選。

葡萄糖攝取的量是由肌細胞膜上GLUT4分子的數(shù)量決定的,因此檢測葡萄糖攝取量的多少也從側面反映了細胞膜上GLUT4的數(shù)量。在本研究中葡萄糖攝取的結果顯示麥冬和紅參的提取物都刺激了肌細胞攝取葡萄糖,而五味子只在低濃度下加速了葡萄糖攝取。此結果與高內(nèi)涵儀器檢測的細胞膜表面GLUT4的數(shù)量的結果相匹配,證明高內(nèi)涵檢測GLUT4易位是可行的。

紅參是經(jīng)高溫處理過的人參,多年前就用于降血糖的輔助治療。文獻顯示在肥胖造成胰島素抵抗的SD大鼠實驗中,紅參可能通過增加IR-b、IRS-1、Akt和GSK3a/b的磷酸化,以及增加骨骼肌中GLUT4的易位來提高胰島素敏感性,從而在產(chǎn)生抗糖尿病和抗肥胖作用[15]。Kim等[16]研究亦發(fā)現(xiàn)由果膠裂解酶修飾的紅參提取物GS-E3D可增加肥胖小鼠模型里GLUT4的表達以及易位,并改善脂肪外膜外組織的胰島素敏感性及與肥胖相關的糖耐量受損。這些研究均指出紅參通過增加GLUT4易位并改善胰島素敏感性。麥冬具有抗糖尿病、保護心血管、增強免疫力、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[17]。在胰島素抵抗的L6細胞中,麥冬多糖給藥后細胞葡萄糖消耗量顯著上升,并可顯著增強IRS-1酪氨酸磷酸化蛋白水平和GLUT4蛋白水平,表明麥冬多糖可通過增強IRS-1酪氨酸磷酸化和GLUT4蛋白表達來增強胰島素抵抗L6細胞葡萄糖攝取能力[13]。五味子具有斂肺滋腎、生津斂汗、寧心安神的作用,常用于治療肺腎陰虛、津傷口渴等證。在臨床實踐過程中,人們發(fā)現(xiàn)五味子化治療糖尿病尤其是2型糖尿病方面有一定的療效[18]。相較于紅參和麥冬,五味子針對GLUT4易位方面的研究非常少,僅有的研究提到從五味子中提取的低分子量多糖可上調肝源性成纖維細胞(水牛大鼠肝)中GLUT4的表達,并改善葡萄糖攝取[19]。此外五味子的提取物可以增加3T3-L1細胞的葡萄糖攝取[20]。根據(jù)文獻中體內(nèi)外研究的結果可以證實,紅參、麥冬、五味子確實有增加GLUT4易位的效果,而在本研究中,證明了紅參、麥冬、五味子的總提取物在體外肌細胞模型L6-GLUT4myc中,同樣可以增加GLUT4的易位和葡萄糖攝取。此外,實驗結果也展示了L6-GLUT4myc細胞株可以作為體外研究工具并結合高內(nèi)涵成像儀用以篩選影響GLUT4易位的中藥或者單體。

自幾十年前發(fā)現(xiàn)胰島素刺激體內(nèi)葡萄糖轉運以來,了解胰島素作用的分子機制一直是人們關注的焦點。早期檢測GLUT4易位到質膜的生化方法包括Western blot分析或細胞松弛素B結合分析[21]、免疫沉淀[22]、流式細胞術[23]等技術。每一種方法都有自己的優(yōu)點和局限性,但是大多數(shù)方法都包含不止一個步驟,比較耗時和費力,并且存在方法學上的不準確性。OPD法是一種快速檢測細胞中 GLUT4 易位的簡單方法,并且具有高靈敏度,該方法可以準確計算細胞表面 GLUT4 分子的數(shù)量[9]。這種免疫學測定法經(jīng)常用于穩(wěn)定表達myc標記的GLUT4的細胞,并成為現(xiàn)在最常用的檢測方法之一[24-25]。然而,該方法包括許多洗滌、結合和孵育步驟,因此使得此方法耗時、費力且容易出錯。此外,由于第二抗體的非特異性結合和交叉反應,酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結果[26]。

近年來,隨著高通量技術的發(fā)展,高內(nèi)涵技術也被用于細胞生物學實驗,使得大規(guī)模細胞生物學研究成為可能。高內(nèi)涵技術即高內(nèi)涵篩選(high content screening,HCS)是一種結合了細胞生物學的分子工具和自動高分辨率顯微鏡及自動分析功能的活細胞成像技術[27]。在保持細胞結構完整性的條件下,通過活細胞成像、熒光探針等技術同時監(jiān)測被篩選藥品對細胞生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導等多個環(huán)境的影響,涉及膜受體、胞內(nèi)成分、細胞器和離子通道等眾多靶點,從而能夠得到多方面的篩選結果[28]。在本研究中,結合L6-GLUT4myc細胞系,我們使用了高內(nèi)涵檢測GLUT4的易位,其結果與OPD法的結果相似,并且與葡萄糖攝取的結果也保持一致。相較于OPD法使用24孔板進行檢測,高內(nèi)涵檢測可對96孔板或者更多孔板(384)進行檢測,適合用于大規(guī)模的藥物篩選,而且結果具有可視化的優(yōu)點。但不同于OPD法可以進行定量檢測,高內(nèi)涵儀器只能對結果進行半定量檢測。從步驟和時間上來看,高內(nèi)涵檢測法省去了最后OPD孵育的時間,步驟和時間稍少于OPD法。從計算結果上看,OPD需要通過酶標儀讀數(shù)后,在使用EXCEL等軟件進行計算,而高內(nèi)涵檢測儀器配備的軟件(Harmony軟件,PE),可以在圖形讀取后就進行計算,節(jié)省了時間。

綜上所述,紅參、麥冬、五味子作為常用治療消渴癥的藥物均有增加GLUT4易位和葡萄糖攝取的效果,其中麥冬,紅參總提取物在低劑量(10 μg·mL-1)和高劑量(50 μg·mL-1)均有效果,而五味子總提取物只在低劑量(10 μg·mL-1)有效果。這可能就是3種藥物可以用于治療消渴癥的可能的機制之一。研究結果還顯示L6-GLUT4myc是可用于研究葡萄糖攝取和 GLUT4 易位的細胞模型,并且與高內(nèi)涵檢測儀可以搭配以用于新型抗糖尿病藥物的篩選,為之后使用高內(nèi)涵成像儀篩選刺激GLUT4易位的藥物或單體成分提供了研究基礎,也進一步為中藥對于治療糖尿病的可行性機制提供了研究思路。