李夢君,劉波,王曉波,李妍,熊山,牟艷玲,解維林

(山東第一醫(yī)科大學藥學院<藥物研究所>,先進藥物遞釋系統(tǒng)全國重點實驗室,國家衛(wèi)健委生物技術藥物重點實驗室,山東省罕少見病重點實驗室,山東 濟南 250117)

黑色素瘤是一種源于黑色素細胞惡變而形成的腫瘤,惡性程度極高,易發(fā)生轉移[1]。盡管黑色素瘤僅占皮膚癌的5%,但它卻占皮膚癌相關死亡的75%[2]。早期首選的治療方式為手術切除,選擇做有足夠安全范圍的切除,可使患者具有良好的預后。但是對于手術無法切除,或者發(fā)生多處轉移導致切除效果欠佳的晚期患者,則預后極差,因此迫切需要尋找更有效的治療晚期黑色素瘤的藥物。

鞘磷脂是一類在調節(jié)細胞功能中具有多種重要作用的脂類。鞘磷脂的代謝產(chǎn)物,包括神經(jīng)酰胺(Cer)、鞘氨醇(Sph)和1-磷酸鞘氨醇(S1P),在細胞生長、分化、存活和凋亡中發(fā)揮著重要的作用。Sph通過鞘氨醇激酶1或2(SphK1或SphK2)磷酸化進一步產(chǎn)生S1P。S1P是一種重要的信號分子,它可以作為細胞內(nèi)傳遞信號的第二信使。S1P已被證明可以調節(jié)內(nèi)質網(wǎng)中游離鈣離子的釋放,這對細胞增殖有廣泛影響[3]。也可以通過旁分泌或自分泌的方式與細胞膜上相應的G蛋白偶聯(lián)受體結合作為第一信使參與生物效應,包括細胞增殖[4]、凋亡[5]、誘導血管生成[6]、促腫瘤炎癥[7]以及激活侵襲和轉移[8]等。SphK1和SphK2同工酶過表達有相反功能,SphK1促進細胞生長,抑制細胞凋亡,而SphK2與細胞生長抑制和增強細胞凋亡相關[9]。Sphk1表達水平在黑色素瘤[10-11]、結腸癌[12]、胃癌[13]、肺癌[14]等多種腫瘤組織中都明顯高于正常組織。SphK1抑制、沉默或功能喪失突變可降低黑色素瘤中S1P的含量,促進抗腫瘤免疫[10],抑制血管生成[15],誘導黑色素瘤細胞凋亡和自噬,因此,SphK1是黑色素瘤治療的理想靶標。

本課題組從SphK1的晶體結構出發(fā),設計篩選出具有抑制活性的SphK1抑制劑SAMS10,并通過對先導化合物SAMS10進行結構修飾,合成了一系列的新型二芳基衍生物。前期研究表明新型二芳基衍生物04022a對黑色素瘤A375細胞系具有顯著的抗癌活性,抑制A375細胞遷移,促進凋亡,并通過誘導A375細胞G2/M期阻滯來發(fā)揮抗增殖作用。通過對裸鼠構建異種移植瘤模型,表明它對腫瘤的生長具有劑量依賴性的抑制作用[11]。本研究采用肝微粒體溫孵體系,考察04022a在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性;采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯(lián)用(UPLC-QTOF-MS/MS)方法,分離檢測了04022a在肝微粒體中的代謝物,結合母藥的結構性質和二級質譜圖的碎片信息,鑒定了代謝產(chǎn)物的結構、可能的代謝途徑和裂解途徑,初步探討該化合物的代謝規(guī)律,判斷其成藥性,為之后體內(nèi)的藥代動力學研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾公司);Triple TOF 5600質譜儀(美國AB SCIEX公司),恒溫混勻儀MTH-100(杭州米歐儀器有限公司);ME155DU型電子天平(梅特勒-托利多有限公司);IKAVortex 3渦旋混勻器(廣州艾卡儀器設備有限公司);SB-5200DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 藥品與試劑04022a(純度>97%)由山東省醫(yī)學科學院藥物研究所合成;睪丸酮購自阿拉丁生化科技有限公司;PBS緩沖液(0.01 mol·L-1,pH 7.2～7.4)購自北京索萊寶生物科技有限公司;大鼠肝微粒體(RLMS,目錄號:M10011,20 mg·mL-1)、人肝微粒體(HLMS,目錄號:M10001,20 mg·mL-1)和比格犬肝微粒體(DLMS,目錄號:M10007,20 mg·mL-1)均購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術有限公司;NADPH再生系統(tǒng)(溶液A:26.1 mmol·L-1NADP+, 66 mmol·L-1葡萄糖6-磷酸,66 mmol·L-1MgCl2;溶液B:40 U·mL-1葡萄糖6-磷酸脫氫酶,5 mmol·L-1檸檬酸鈉)購自北京匯智泰康醫(yī)藥技術有限公司;甲醇由美國賽默飛世爾公司所提供;甲酸由天津科密歐化學試劑有限公司所提供;甲醇、甲酸均為色譜純。

2 方法

2.1 代謝穩(wěn)定性研究的HPLC條件采用Inertsil ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm)進行樣品分離,柱溫25 ℃。流動相由含有0.1%甲酸的水(溶劑A)和甲醇(溶劑B)組成,采用梯度洗脫的方式,洗脫的梯度如下:0～3 min,5%B;3～25 min,5%B→50%B;25～27 min,50%B→70%B;27～30 min,70%B;30～30.01 min,70%B→5%B;30.01～35 min,5%B,分析的總時長為35 min。自動進樣器的溫度為25 ℃,流速為1 mL·min-1,進樣量為10 μL,紫外檢測器的檢測波長為280 nm。

2.2 代謝產(chǎn)物研究的UPLC-QTOF-MS/MS條件超高效液相色譜配備有島津的超高效液相色譜儀(日本京都)用于樣品分析,采用Phenomenex Kinetex C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)分離母藥與代謝產(chǎn)物,柱溫40 ℃。流動相由溶劑A(含有0.1%甲酸的水)和溶劑B(甲醇)組成。分析物以0.3 mL·min-1的流速用以下梯度洗脫:0～2 min,5%B;2～18 min,5%B→35%B;18～58 min,35%B→50%B;58～88 min,50%B→70%B;88～114 min,70%B→95%B;114～117 min,95%B;117～117.1 min,95%B→5%B;117.1～120 min,5%B,整個色譜運行時間為120 min。自動進樣器的溫度設定為25 ℃,進樣體積為10 μL。質譜檢測由配備Duo-SprayTM離子源的Triple TOFTM5600系統(tǒng)在正電噴霧電離(ESI)模式下進行。質譜儀和UPLC系統(tǒng)由帶有Analyst 1.8軟件的工作站控制。優(yōu)化的操作參數(shù)如下:離子源電噴霧電壓(IS),5 500 V;霧化氣壓力(GS1),45 psi;加熱氣壓力(GS2),45 psi;氣簾氣(CUR),35 psi;加熱氣溫度(TEM),500 ℃;去簇電壓(DP),80 eV;碰撞能量(CE),20 eV;碰撞能量的步階(CES),5 eV。IDA方法包括一次TOF-MS測量掃描(m/z100-800)和10次產(chǎn)物離子IDA掃描(m/z50～800),累積時間分別為0.25 s和0.1 s。

2.3 溶液的配制精密稱定13.58 mg的0 4022a,用1 mL的甲醇溶解,得到濃度為20 μmol·mL-1的母藥溶液,用于進行實驗組的肝微粒體孵育實驗;另外稱取1.02 mg的04022a,用1.5 mL的甲醇溶解制備成1 μmol·mL-1的儲備液,并進一步用甲醇稀釋成0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol·mL-1的系列對照品工作液,按“2.1”項下的色譜條件來檢測樣品,記錄樣品的峰面積。橫坐標X是待測物04022a的質量濃度,縱坐標Y是對應的峰面積,以此來繪制標準曲線。

用1 mL的甲醇充分溶解精密稱定的5 mg睪丸酮,制備成濃度為5 mg·mL-1的母藥溶液,用于進行陽性對照組肝微粒體的孵育實驗;另外稱取1 mg的睪丸酮,溶于甲醇當中,配制成1 mg·mL-1的儲備液,將儲備溶液用甲醇逐級稀釋來制備標準工作溶液,睪丸酮的濃度為:2、8、20、50、200、400、800 μg·mL-1。按“2.1”項下的色譜條件來檢測樣品,記錄樣品的峰面積。橫坐標X是睪丸酮的濃度,縱坐標Y是對應的峰面積,以此來構建標準曲線。

2.4 代謝穩(wěn)定性孵育體系預孵育體系的總體積為188 μL,包括181 μL 0.01 mol·L-1的PBS緩沖液,2 μL濃度為20 μmol·mL-1的04022a母藥溶液以及5 μL不同種屬的肝微粒體,為避免肝微粒體酶失活應在冰上加入。將其在37 ℃,850 r·min-1條件下預孵育5 min后,加入12 μL的NADPH再生系統(tǒng)啟動反應(整個孵育體系中加入甲醇的最大體積為1%),繼續(xù)溫孵0、15、30、60、90、120 min后,立即加入等體積的冰甲醇使反應停止。將終止反應后的樣品渦旋1 min,于4 ℃,14 000 r·min-1離心10 min,收集上清液,按“2.1”項下的色譜條件來檢測樣品,測定各時間點待測物04022a的含量,平行實驗3次。同時設置陽性對照組(用睪丸酮代替待測物),陰性對照組(不加NADPH),空白對照組(不添加待測物,用PBS代替)。

2.5 代謝產(chǎn)物研究按“2.4”項下的孵育體系處理樣品,將實驗組和空白對照組中孵育120 min后的樣品,按照“2.2”項下的條件進樣分析。通過對比二者的總離子流圖,尋找04022a在各種屬肝微粒體中的代謝產(chǎn)物,再根據(jù)各色譜峰的準分子離子以及碎片離子信息,推測代謝產(chǎn)物可能的結構與裂解途徑。

3 結果

3.1 代謝穩(wěn)定性陽性對照組的孵育體系中用睪丸酮來代替待測物04022a,以此來驗證該溫孵體系的建立是否成功;陰性對照組的孵育體系中沒有加NADPH,以此來考察04022a在酶不起作用的情況下能否發(fā)生代謝;空白對照組中不含待測物,將實驗組和空白對照組的圖譜進行比較,來判斷是否發(fā)生了代謝,結果見圖1。在孵育120 min時,陽性對照組中睪丸酮在大鼠、人、比格犬肝微粒體中的剩余藥物百分比分別為6.59%±0.06%、7.73%±0.13%、82.75%±1.69%,可以看出睪丸酮在不同種屬的肝微粒體中均發(fā)生了明顯的代謝,且代謝速率較快,說明該孵育體系的構建是可靠的,可以用來進行待測物的體外代謝穩(wěn)定性研究。

A.陰性對照組;B.實驗組;C.陽性對照組

使用GraphPad Prism 8.0.1軟件來繪制待測物04022a在不同種屬肝微粒體中的孵育曲線,所得結果見圖1。在孵育120 min時,實驗組中04022a在大鼠、人、比格犬肝微粒體中的剩余藥物百分比分別為88.30%±1.41%、82.15%±2.23%、98.63%±0.45%。陰性對照組中04022a在大鼠、人、比格犬肝微粒體中的剩余藥物百分比分別為98.76%±1.54%、101.98%±2.98%、103.42%±0.69%。結果表明04022a在不同種屬的肝微粒體中均發(fā)生了不同程度的代謝,且原型藥的消除依賴CYPs。

3.2 酶動力學參數(shù)的計算縱坐標Y是各溫孵時間點的平均剩余藥物百分比的自然對數(shù),橫坐標X是孵育時間,以此作線性回歸,根據(jù)斜率k值來計算酶動力學參數(shù),結果見表1。根據(jù)體外半衰期可以看出該化合物代謝是否穩(wěn)定。表1得出的結果顯示,04022a在SD大鼠、人、比格犬肝微粒體中的代謝時間較長,代謝穩(wěn)定性良好。

表1 04022a在大鼠、人和比格犬肝微粒體孵育體系中的酶動力學參數(shù)比較

3.3 代謝產(chǎn)物研究通過比較含藥生物樣品與空白生物樣品的色譜圖差異,初步判斷04022a在大鼠和人肝微粒體中有5個相同的體外代謝產(chǎn)物,在比格犬肝微粒體中有4個代謝產(chǎn)物,代謝物的詳細信息見表2,包括保留時間、可能的元素組成、特征碎片離子以及可能的代謝反應類型等。母藥及其代謝物的提取離子色譜圖如圖2所示。

表2 UPLC-QTOF-MS/MS檢測的不同種屬肝微粒體中04022a代謝產(chǎn)物的質譜數(shù)據(jù)

圖2 RLMS(A)、HLMS(B)和DLMS(C)中04022a代謝物的提取離子流圖

3.3.1 04022a的質譜分析為了鑒定04022a的代謝物,了解母體藥物(M0)的裂解過程具有重要意義。采用UHPLC-Q-TOF-MS在正ESI掃描模式下研究了M0的色譜和質譜行為。M0在21.68 min時被檢測到,在m/z339處顯示出分子離子[M+2H]2+,化學式為C26H35Br3N2O4。因為結構中含有3個Br,MS圖中顯示出Br的同位素峰,[M+2H]2+(339)∶[M+2H+2]2+(340)∶[M+2H+4]2+(341)∶[M+2H+6]2+(342)=1∶3∶3∶1,又因各同位素峰之間的分子量相差1 Da,因此均為[M+2H]2+峰。m/z415、131的碎片離子為N-C鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生,m/z397比415少18 Da,是其脫去一分子H2O所形成的產(chǎn)物離子;m/z330為M0脫水形成的碎片離子,O-C鍵繼而斷裂形成m/z為175的[M+2H]2+碎片;C-C鍵斷裂形成m/z為153的[M+2H]2+碎片;在m/z為126的[M+2H]2+碎片離子是由O-C鍵斷裂產(chǎn)生的。M0的MS/MS譜圖和碎裂途徑如圖3所示。

圖3 04022a的MS2質譜圖和可能的裂解途徑

3.3.2 04022a的代謝產(chǎn)物分析在保留時間5.14 min觀察到代謝產(chǎn)物M1的m/z293的質子化分子離子[M+H]+,因其MS圖中并不存在Br的同位素峰,說明該化合物不含有Br元素,化學式為C17H28N2O2,推測其為母藥發(fā)生N-脫烷基化所產(chǎn)生的I相代謝產(chǎn)物。N-C鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生m/z為163的碎片;M1的O-C鍵發(fā)生斷裂形成m/z為126的碎片離子,126分別失去CH3、C2H5形成m/z112、m/z99的產(chǎn)物離子。M1的MS/MS譜圖和碎裂途徑如圖4所示。

圖4 04022a代謝產(chǎn)物的MS2質譜圖和可能的裂解途徑

代謝產(chǎn)物M2在18.07 min的色譜圖中出現(xiàn),分子離子[M+2H]2+在m/z297,MS圖中含有3個Br的同位素峰,[M+2H]2+(297)∶[M+2H+2]2+(298)∶[M+2H+4]2+(299)∶[M+2H+6]2+(300)=1∶3∶3∶1,說明結構中有Br的存在[16-17],且各同位素峰之間的分子量相差1 Da,因此均為[M+2H]2+峰?；瘜W式為C20H25Br3N2O4。推測其為母藥的哌啶環(huán)發(fā)生開環(huán)繼而N脫烷基化形成的I相代謝產(chǎn)物。m/z415、90為M2的N-C鍵發(fā)生斷裂所產(chǎn)生的兩個碎片離子,m/z397與415相差18 Da,推測由失去一分子H2O所形成,m/z90失去CH2CH2NH2形成m/z為137的關鍵碎片離子。M2的MS/MS譜圖和碎裂途徑如圖4所示。

代謝產(chǎn)物M3在19.57 min洗脫,在m/z347處顯示分子離子[M+2H]2+,MS圖中存在Br的同位素峰,[M+2H]2+(347)∶[M+2H+2]2+(348)∶[M+2H+4]2+(349)∶[M+2H+6]2+(350)=1∶3∶3∶1,說明結構中有3個Br的存在[16-17],且因各同位素峰之間的分子量相差1 Da,因此均為[M+2H]2+峰,化學式為C26H35Br3N2O5。M3的m/z347的分子離子[M+2H]2+以及m/z為 338、183、161、139的主要碎片離子[M+2H]2+與M0的m/z339的分子離子[M+2]2+以及m/z為330、175、153、131的主要碎片離子[M+2H]2+相比均多了8 Da,M3的m/z142的碎片離子比M0的m/z為126的碎片離子大16 Da,因此推測M3為母藥發(fā)生單羥基化產(chǎn)生的I相代謝產(chǎn)物。m/z415為N-C鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生;m/z137是由m/z139中的O-C鍵發(fā)生斷裂所產(chǎn)生。由于m/z415、142、137這些特征碎片離子的存在,推測羥基化發(fā)生在哌啶環(huán)上,但具體的位置無法根據(jù)現(xiàn)有的質譜信息推斷。M3的MS/MS譜圖和碎裂途徑如圖4所示。

代謝產(chǎn)物M4在m/z338以分子離子[M+2H]2+的形式出現(xiàn),保留時間為20.75 min,MS圖中可以觀察到Br的同位素峰,[M+2H]2+(338)∶[M+2H+2]2+(339)∶[M+2H+4]2+(340)∶[M+2H+6]2+(341)=1∶3∶3∶1,說明含有3個Br[16-17],且各同位素峰之間的分子量相差1 Da,因此均為[M+2H]2+峰,化學式為C26H33Br3N2O4。其[M+2H]2+峰m/z338比M0小1 Da,推測M4為母藥脫氫產(chǎn)生的I相代謝產(chǎn)物。m/z415為N-C鍵發(fā)生斷裂形成的產(chǎn)物離子;主要的碎片離子m/z329、174、152、130均比母藥MS2圖中的碎片離子330、175、153、131少1 Da,因此推測這些碎片離子與母藥具有相同的裂解途徑。因為m/z415、130這兩個特征性產(chǎn)物離子的存在,推測脫氫發(fā)生在1-乙基-4-甲基哌啶環(huán)上。M4的MS/MS譜圖和碎裂途徑如圖4所示。

在UPLC體系中,代謝產(chǎn)物M5的峰位于m/z332,洗脫時間為24.16 min,MS圖中存在Br的同位素峰,[M+2H]2+(332)∶[M+2H+2]2+(333)∶[M+2H+4]2+(334)∶[M+2H+6]2+(335)=1∶3∶3∶1,說明含有3個Br原子[16-17],同時各同位素峰之間的分子量相差1 Da,因此均為[M+2H]2+峰,化學式為C25H33Br3N2O4。M5在m/z為332的分子離子[M+2H]2+以及其在m/z為323、168的主要碎片離子[M+2H]2+與M0在m/z為339的分子離子[M+2H]2+以及其在m/z為330、175的主要碎片離子[M+2H]2+相比均少了7 Da,因此推測M5為母藥去甲基產(chǎn)生的I相代謝產(chǎn)物。m/z401、131為M5的N-C鍵發(fā)生斷裂產(chǎn)生的關鍵碎片離子,m/z383比401的分子量小18 Da,是其脫去一分子H2O所形成的;M5中的O-C鍵斷裂產(chǎn)生m/z為126碎片離子。因為m/z401、131和126這些診斷性碎片離子的存在,推測是母藥N原子上的甲基丟失。M5的MS/MS譜圖和碎裂途徑如圖4所示。

在肝微粒體中共鑒定出5種代謝產(chǎn)物。04022a在體外肝微粒體中主要通過脫烷基化、羥基化、脫氫等途徑來進行代謝,結果如圖5所示。

圖5 04022a在RLMS、HLMS和DLMS中可能的代謝途徑

4 討論

肝臟是人體的主要代謝器官,對于外界侵入的物質可以通過代謝轉化以降低所帶入的毒性,從而有效達到保護機體的作用,當有毒外源性物質侵入機體內(nèi)部時,必然會受到毒副作用影響或對機體產(chǎn)生不良反應,因此藥物體外代謝模型主要基于肝臟。肝微粒體方法不僅制備簡便,重現(xiàn)性好,而且酶混合物易于保存,培養(yǎng)條件易于優(yōu)化。因此,在新藥開發(fā)初期,常采用肝微粒體模型考察化合物代謝的速度和程度,對候選化合物的藥代動力學特征進行初步的研究,以確定候選化合物在研發(fā)初期是否值得進一步開發(fā)[14]。本研究成功創(chuàng)建了一種簡單、穩(wěn)定、專屬性較強且重復性較高的HPLC分析方法,測定肝微粒體中04022a的質量濃度。從測定結果可以看出,該化合物代謝穩(wěn)定性良好,在HLMS和RLMS中的代謝行為較為相似。

本實驗利用高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質譜技術,建立了簡單、快速、靈敏度和分辨率高的分析方法,對04022a及其代謝產(chǎn)物進行分離鑒定。從樣品的總離子流色譜圖中可以得到的保留時間;從一級質譜圖中可以獲得母藥及代謝產(chǎn)物的相對分子質量,根據(jù)常見的氧化、還原、水解和結合等代謝反應規(guī)律,再結合母藥的結構分析,可以對代謝產(chǎn)物的結構和生物轉化途徑進行推測;通過二級質譜圖的碎片信息,可以進一步推測代謝產(chǎn)物碰撞誘導產(chǎn)生碎片離子的裂解途徑;通過計算理論質荷比和實測質荷比的誤差,輔助驗證推測的結果。研究表明,04022a在體外肝微粒體中主要通過脫烷基化、羥基化、脫氫等途徑來進行代謝。該化合物在大鼠和人肝微粒體中產(chǎn)生了相同的代謝產(chǎn)物,在體外具有相同的代謝途徑,之后選擇大鼠來研究體內(nèi)的生物轉化情況。