辛曉棟 溫欣宇 降佳君 王玲 楊國斌 楊福孫

摘 要：為了篩選出控制檳榔花香的關鍵代謝物，提升檳榔花香，吸引更多授粉者，從而提高檳榔產(chǎn)量。本研究采用頂空固相微萃取氣相色譜－質譜聯(lián)合分析技術對不同時期檳榔花進行非靶向代謝組學檢測。結果共檢測到236 種代謝物。利用VIP 值和差異倍數(shù)相結合的方法共篩選出75 種差異代謝物，主要包括萜類、酮類、醇類等。其中檳榔雌花的揮發(fā)性化合物從雌花未開期到初開期發(fā)生大量積累，在盛開期又發(fā)生輕微下降，所以雌花初開期可能是檳榔雌花花香形成的關鍵時期。檳榔雄花的揮發(fā)性化合物在雄花初開期到盛開期發(fā)生了大量積累，所以雄花盛開期可能是檳榔雄花花香形成的關鍵時期。之后對差異代謝物使用KEGG 數(shù)據(jù)庫對其代謝途徑進行分析，篩選與植物花香有關且富集顯著的代謝通路。結果表明：檳榔雌花中富集顯著且與花香合成有關的代謝途徑為脂肪酸生物合成，在該通路上富集的物質為癸酸。癸酸是一種脂肪酸類物質，其多用于植物生理和信號傳遞等功能，檳榔雌花未開期到初開期癸酸含量上調(diào)，花香釋放量也發(fā)生相應的提升，這可能是由于檳榔在雌花初開期開始授粉，需要傳遞更多的化學信號，從而吸引授粉者。所以癸酸可能是檳榔雌花為了授粉而釋放的一種化學信號。檳榔雄花中富集顯著且與花香合成有關的代謝途徑分別為雙萜類生物合成和脂肪酸降解，棕櫚醛和（4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘分別富集在這2 條代謝途徑上。（4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘為萜類物質，中文名為貝殼杉烯是雙萜類物質，它的對映體ent-貝殼杉烯在貝殼杉烯合酶的作用下由反式-牻牛兒基牻牛兒焦磷酸開環(huán)而合成，是赤霉素的前體。雄花初開期到盛開期該物質含量發(fā)生下調(diào)，可能是由于雄花盛開期時所需赤霉素含量降低。棕櫚醛為醛類物質，是脂肪酸生物降解釋放出的代謝物，檳榔雄花初開期到盛開期花香釋放量升高，同時棕櫚醛的含量也發(fā)生上調(diào)，二者之間呈正相關關系。因此，以上3 種代謝物可能是影響檳榔花香的關鍵代謝物。

關鍵詞：代謝途徑；代謝組學；檳榔花；差異代謝物

中圖分類號：S792.91 文獻標識碼：A

檳榔（Areca catechu L.）屬棕櫚科檳榔屬常綠喬木，是海南農(nóng)戶的主要收入來源[1]。檳榔屬被子植物，其傳粉方式分為自花傳粉和異花傳粉2 種類型。異花傳粉主要分為風媒花與蟲媒花，以風作為授粉媒介稱為風媒花，風媒花顏色通常較為暗淡，氣味不明顯，同時不能產(chǎn)生花蜜，花粉粒較為干燥不具有黏著性，而且質量小容易被風傳送。蟲媒花指以昆蟲為授粉媒介。蟲媒花多具美麗花瓣、蜜腺和特征香味，花粉具有黏著性容易附著在昆蟲身體上的特點。檳榔雌雄花雖然同株同序，但雌雄花不同期開放，為異花授粉植物。由于檳榔授粉率較低，導致其產(chǎn)量低下。檳榔雌花顏色鮮艷、體型較大并有花香，雄花花粉質輕，易被風吹送，同時有大量香味溢出，前人認為檳榔為風媒花，但從表型分析發(fā)現(xiàn)檳榔花具有蟲媒花特性，尤其檳榔雌雄花均有香味，且能產(chǎn)蜜。而花香作為一種化學信號有助于授粉者辨別植物的種類和位置[2]，具有吸引授粉者的功能。

但由于檳榔花香味不足，吸引授粉者較少從而導致產(chǎn)量較低。

代謝組學是一門新興學科，可將樣品信息進行有效整合，具有所需時間短、精度高和涵蓋面廣的特點，能夠更加準確、全面地檢測樣品中的小分子代謝物[3-5]。其中，非靶向代謝組學有助于更加全面地反映代謝物的變化，同時對于新的代謝通路的挖掘也有利[6]。固相微萃取（solidp phasemieroextraetion， SPME）技術是一種近年來新興的處理技術，該技術對于食品香氣分析意義重大[7-9]。

目前對檳榔花的研究主要集中在其藥用成分和特殊功效方面[10-13]。現(xiàn)有研究只對檳榔雄花與花梗的香氣成分進行了初步分析，并未明確控制檳榔雌雄花花香的關鍵代謝物及其各時期的花香釋放規(guī)律[14]。

在植物中與花香有關的通路主要分為三大類，分別為萜烯類化合物的生物合成、苯丙烷/苯環(huán)類化合物的生物合成和脂肪酸衍生物的生物合成。因此本研究將采用頂空固相微萃取氣相色譜－質譜聯(lián)合技術，對不同時期的檳榔花進行代謝組學分析，明確檳榔花各時期的花香釋放規(guī)律，同時篩選出與花香合成有關的通路，從而確定控制檳榔花花香的關鍵代謝物，為提升檳榔花香提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 檳榔花于2021 年4 月20 日至7 月20 日取于海南省瓊中縣檳榔園，經(jīng)鑒定為海南本地品種。供試材料為雌花未開期（F1）、初開期（F2）、盛開期（F3），雄花初開期（M1）和盛開期（M2）共5 個時期的檳榔花（圖1），每個時期3 次重復。采集的樣品送至邁維（武漢）生物科技有限公司進行代謝組學檢測。

1.1.2 主要儀器設備 本研究采用的儀器主要為安捷倫（Agilent）8890-5977B 型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、安捷倫（Agilent）DB-5MS 型色譜柱、安捷倫（Agilent）120 μm DVB 萃取頭，均由安捷倫公司生產(chǎn)。

1.2 方法

本研究主要參考CHEN 等[15]和戴宇樵等[16]的實驗方法，將所取樣品使用液氮進行研磨，加入NaCl 溶液，使用全自動頂空固相微萃取對樣本進行萃取，以供GC-MS 分析。

色譜條件：DB-5MS 毛細管柱，恒流流速為1.0 mL/min，進樣口溫度為250 ℃，不分流進樣。

質譜條件：接口溫度為280 ℃，電子能量為70 eV，掃描范圍為50～500 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GC-MS 分析得到的原始數(shù)據(jù)先進行峰提取，獲取特征峰的峰面積和保留時間等信息，然后采用邁維云平臺和公共數(shù)據(jù)庫對代謝物進行鑒定。

根據(jù)差異系數(shù)（variable importance inproject， VIP≥1，P<0.05）[17]和最大差異倍數(shù)值對檢測到的代謝物進行篩選，同時對差異代謝物進行途徑分析[18]。

2 結果與分析

2.1 檳榔花中的揮發(fā)性有機化合物分析

通過HS-SPMEGC/MS 方法，在不同時期的檳榔雌花、雄花中共鑒定出236 種揮發(fā)性有機化合物，包括酯類、萜類、酸類等物質（圖2）。其中酯類的種類最豐富（約25%），其次為雜環(huán)化合物（約15%）和萜類（約15%）。在植物中雜環(huán)化合物一般對植物香味影響較小，但酯類物質與萜類物質的香氣閾值較低對植物花香貢獻很大，所以本研究認為這些揮發(fā)性有機化合物在促進檳榔花香氣中起著非常重要的作用。

2.2 不同時期檳榔花的代謝判別分析

2.2.1 主成分分析 對所得數(shù)據(jù)使用主成分分析，PCA 得分如圖3 所示。主成分1 的貢獻率為45.47%，主成分2 的貢獻率為12.97%。X 軸方向模型的累積解釋率R2X=0.751，因此該PCA 模型擬合性較好。雄花M1 與M2 和雌花F1、F2、F3 基本分離，雖然M1 與雌花樣本相距較近，可能是相同品種，代謝物種類相近導致的，但基本得到了有效區(qū)分，說明組間存在差異。

2.2.2 正交偏最小二乘判別分析 OPLS-DA 可以將與分類無關的影響信息過濾掉，有助于對組間差異進行更加精確的區(qū)分。采用OPLS-DA 對得到的質譜數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)檳榔雌花與雄花樣品分布在置信區(qū)間的左側和右側，二者被明顯區(qū)別，說明其存在顯著差異，因此對檳榔雌雄花進行分類研究（圖4）。模型累計預測率Q2＝0.758，R2X=0.631，R2Y=0.992 說明該評估模型可靠有效（圖5）。

2.3 檳榔雌花不同時期差異代謝物篩選

通過VIP≥1，P<0.05 對不同時期的檳榔雌花進行差異代謝物篩選，其中F1 VS F2 共篩選出17種差異代謝物，17 種差異代謝物全部發(fā)生上調(diào)，其中酯類物質4 種、雜環(huán)類化合物4 種、醛類2種、酮類2 種、鹵代烴2 種、酸類1 種、醚類1種、萜類1 種。F2 VS F3 共篩選出6 種差異代謝物，6 種物質全部發(fā)生下調(diào)，其中烴類5 種、酸類1 種。F1 VS F3 共篩選出8 種差異代謝物，其中2 種物質發(fā)生下調(diào)，6 種物質上調(diào)，其中酮類物質2 種、酯類物質2 種、雜環(huán)類化合物2 種、醛類1 種、酸類1 種。由此可見，在檳榔雌花發(fā)育過程中，揮發(fā)性有機化合物在F2 時期發(fā)生大量積累，在F3 時期又發(fā)生了一定程度的下降，但相對于F1 時期，F(xiàn)2 和F3 時期揮發(fā)性有機化合物都發(fā)生了大量的積累，這些結果表明揮發(fā)性有機物在檳榔雌花的初開期和盛開期發(fā)生了大量積累。

差異表達的代謝物可能是檳榔雌花發(fā)育過程中香氣形成的重要因素。

本課題組對這些差異代謝物進行研究發(fā)現(xiàn)（表1），相比與F1 時期，F(xiàn)2 時期的檳榔雌花中酯類物質發(fā)生了大幅度的提升，在植物中酯類物質主要通過脂肪酸氧化形成，使植物呈現(xiàn)花香味，這表明在F2時期檳榔雌花的香味也相應的大幅度提升。除酯類物質外，酸類物質的提升將近7 倍，在植物中酸類物質主要賦予植物酸味，在F2 時期差異表達的酸類物質為癸酸，癸酸屬于脂肪酸物質在植物中一般具有脂香和柑橘味，同時用于傳遞化學信號，在F2 時期檳榔雌花剛剛開放將要授粉，此時癸酸含量激增，所以癸酸可能是檳榔雌花開放的一種化學信號物質。相比與F2 時期，F(xiàn)3時期揮發(fā)性化合物發(fā)生下降，但主要下降物質為烴類物質，在植物中烴類物質一般對香味影響較低，所以F3時期檳榔雌花香味只發(fā)生了輕微下降，不做具體分析。綜上所述，F(xiàn)2 時期可能是檳榔雌花花香形成的關鍵時期。

2.4 檳榔雄花不同時期差異代謝物篩選

通過VIP≥1，P<0.05 對不同時期的檳榔雄花進行差異代謝物篩選，其中M1 VS M2 共篩選出44 種差異顯著代謝物，其中萜類12 種、酯類10種、雜環(huán)化合物5 種、酮類物質4 種、芳烴3 種、酸類物質2 種、胺類物質2 種、醇類物質2 種、醛類2 種、酚類1 種、烴類物質1 種，其中40 種上調(diào)物質占91%，4 種下調(diào)物質占9%。由此可見，在M2 時期揮發(fā)性有機化合物開始大量積累，差異表達的代謝物可能是檳榔雄花香氣形成的重要因素。

本課題組對雄花差異代謝物進一步研究發(fā)現(xiàn)（表2），相比于M1，M2 中萜類物質、酯類物質均發(fā)生了大幅度的提升，在植物中酯類物質和萜類物質其香氣閾值普遍較低，對植物花香影響較大，所以在M2 時期檳榔雄花的花香發(fā)生了大幅度的升高，綜上所述M2 時期可能是檳榔雄花花香形成的關鍵時期。

2.5 差異代謝物分類

為了對不同時期的檳榔雌雄花的差異代謝物進行進一步分析，本研究對富集在代謝通路上不同時期檳榔花的差異代謝物進行熱圖分析（圖6，圖7），圖中行與代謝物質相對應，列與樣本相對應，檳榔雌花9 個樣本，雄花6 個樣本。含量的高低使用不同顏色進行表示，上調(diào)為紅色，下調(diào)為藍色，從藍色到紅色是由低到高的表達。由圖6 可知，檳榔雌花的聚類熱圖主要有3 種物質，分別為癸酸、L-α-松油醇、水楊酸，F(xiàn)1 VS F2 這3種物質均發(fā)生了上調(diào)，F(xiàn)2 VS F3 這3 種物質均發(fā)生了下調(diào)。由圖7 可知，檳榔雄花的聚類熱圖主要有4 種物質，分別為（4aR，6aS，9R，11aR， 11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘、L-α-松油醇、對二甲苯、棕櫚醛，在M1 VS M2中， （4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b- 三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘發(fā)生了下調(diào)，L-α-松油醇、對二甲苯、棕櫚醛3 種物質發(fā)生了上調(diào)。

2.6 差異代謝物KEGG 富集分析

通過KEGG 數(shù)據(jù)庫對檳榔雌雄花差異代謝物所在通路進行分析，雌花差異代謝物主要分布在6 條代謝通路中（圖8）。雄花差異代謝物主要分布在5 條代謝通路中（圖9）。

檳榔雌花中富集顯著的通路分別為代謝物通路、脂肪酸生物合成和植物激素信號轉導3 條通路。其中與花香合成有關的通路為脂肪酸生物合成，在該通路上富集的物質為癸酸，癸酸是一種脂肪酸類物質，植物多使用脂肪酸來合成?；|，用于生理、防御和信號傳遞等功能。在檳榔雌花未開期到初開期開始授粉，此時癸酸含量發(fā)生上調(diào)，花香釋放量也發(fā)生大幅度的提升。所以，癸酸可能是檳榔雌花釋放的一種化學信號，用來吸引授粉者提升授粉率。

檳榔雄花中富集顯著的通路分別為雙萜類生物合成和脂肪酸降解2 條通路。2 條通路都與花香合成有關。有2 種物質分別被富集到這2 條通路中，分別為（4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘和棕櫚醛。（4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘中文名為貝殼杉烯是雙萜類物質，是植物花香的一種重要組成物質，它的對映體ent-貝殼杉烯在貝殼杉烯合酶的用作下由反式-牻牛兒基牻牛兒焦磷酸開環(huán)而合成，是赤霉素的前體。在雄花初開期到雄花盛開期該物質發(fā)生下調(diào)，可能是檳榔雄花此時已經(jīng)過了脫落期，對赤霉素的需求發(fā)生了降低。棕櫚醛是醛類物質有花和蠟的香氣，是脂肪酸生物降解釋出的代謝物，檳榔雄花初開期到盛開期花香釋放量升高，同時棕櫚醛的含量也發(fā)生上調(diào)，釋放出大量香味，以吸引授粉者采集花粉。

3 結論

檳榔是海南省一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物，具有極高的經(jīng)濟價值。本研究建立了基于非靶向代謝組學對不同時期檳榔花差異代謝物的分析方法。研究表明，檳榔雌花中共檢測出155 種芳香化合物，其中雌花初開期花香釋放量最高、盛開期次之、未開期最低，不同時期的檳榔雌花代謝物差異主要來源是脂類和酸類，其中癸酸可能是控制檳榔雌花花香的關鍵代謝物。檳榔雄花中共檢測出166 種芳香化合物，其中雄花盛開期的花香釋放量高于初開期，不同時期的檳榔雄花代謝物差異主要來源是萜類、酯類、醛類， 其中（4aR，6aS，9R，11aR，11bR）-4，4，11b-三甲基-8-亞甲基十四氫-6a，9-甲基環(huán)庚[a]萘和棕櫚醛可能是控制檳榔雄花花香的關鍵代謝物。本研究結果明確了控制檳榔雌雄花花香的關鍵代謝物和各時期的花香釋放規(guī)律，而這些關鍵代謝物的具體合成機制有待進一步探索，從而為定向調(diào)控檳榔花香提高產(chǎn)量提供一定的理論參考價值。

參考文獻

[1] CHEN W J， ZHANG C M， HUANG Y L， CHENG F F，SHEN Y， WANG R C， TANG M M， ZHENG Y J， ZHAO S L. The inhibiting activity of areca inflorescence extracts on human low density lipoprotein oxidation induced by cupric ion[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition，2012， 63（2）： 236-241.

[2] KNUDSEN J T， ERIKSSON R， GERSHENZON J， STAHL B. Diversity and distribution of floral scent[J]. The Botanical Review， 2006， 72（1）： 1-120.

[3] WISHART D S， FEUNANG Y D， MARCU A， GUO A C，LIANG K， VAZQUEZ-FRESNO R， SAJED T， JOHNSON D， LI C， KARU N， SAYEEDA Z， LO E， ASSEMPOUR N，BERJANSKII M， SINGHAL S， ARNDT D， LIANG Y，BADRAN H， GRANT J， SERRA-CAYUELA A， LIU Y，MANDAL R， NEVEU V， PON A， KNOX C， WILSON M，MANACH C， SCALBERT A. HMDB 4.0： the human metabolome database for 2018[J]. Nucleic Acids Research，2018， 46（D1）： D608-D617.

[4] BINO R J， HALL R D， FIEHN O， KOPKA J， SAITO K，DRAPER J， NIKOLAU B J， MENDES P， ROESSNERTUNALIU， BEALE M H， TRETHEWEY R N， LANGE B M， WURTELE E S， SUMNER L W. Potential of metabolomics as a functional genomics tool[J]. Trends in Plant Science， 2004， 9（9）： 418-425.

[5] 戴宇樵， 呂才有. 代謝組學技術在茶學中的應用研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2019， 47（2）： 24-28.

[6] JOHNSON C H， IVANISEVIC J， SIUZDAK G. Metabolomics： beyond biomarkers and towards mechanisms[J]. Nature Reviews. Molecular Cell Biology， 2016， 17（7）：451-459.

[7] 李洪波， 劉勝輝， 李映志， 毛琪， 葉春海. 頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜法測定菠蘿蜜果肉中的香氣成分[J].熱帶作物學報， 2013， 34（4）： 755-763.

[8] 代毅， 須海榮. 采用SPME-GC/MS 聯(lián)用技術對龍井茶香氣成分的測定分析[J]. 茶葉， 2008， 34（2）： 85-88.

[9] 劉拉平， 史亞歌， 張瑞明， 李嵐， 楊蓉. 午子綠茶香氣物質固相微萃取GC-MS 分析[J]. 西北植物學報， 2007， 27（2）：371-376.

[10] 黃玉林， 陳洋平， 陳衛(wèi)軍， 張春梅. 響應面法優(yōu)化提取檳榔花總酚的研究[J]. 熱帶作物學報， 2011， 32（6）： 1158-1164.

[11] 戰(zhàn)晴晴， 周亞奎， 劉洋洋， 盧麗蘭， 甘炳春， 秦以國. 不同花期檳榔花檳榔堿的含量分析[J]. 精細化工， 2013， 30（3）：285-287.

[12] 張春梅. 檳榔花提取物抗衰老作用研究[D]. 長沙： 湖南農(nóng)業(yè)大學， 2011.

[13] 程芳芳， 海洪， 黃玉林， 張春梅， 陳衛(wèi)軍. 檳榔花沸水提取物對酪氨酸酶抑制作用的研究[J]. 熱帶作物學報， 2010，31（11）： 1932-1936.

[14] 張明， 黃玉林， 宋菲， 陳衛(wèi)軍， 趙松林， 鄧福明.SPME-GC/MS 聯(lián)合分析檳榔花香氣成分[J]. 熱帶作物學報， 2014， 35（6）： 1244-1249.

[15] CHEN W， GONG L， GUO Z， WANG W， ZHANG H， LIU X，YU S， XIONG L， LUO J. A novel integrated method for large-scale detection， identification， and quanti of widely targeted metabolites： application in the study of rice metabolomics[J]. Molecular Plant， 2013， 6（6）： 1769-1780.

[16] 戴宇樵， 呂才有， 何魯南， 易超， 劉學艷， 黃雯， 陳加敏.基于代謝組學的‘云抗10 號’曬青茶加工過程代謝物變化[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2020， 53（2）： 357-370.

[17] 洪森榮， 吳夏俊鵬， 徐文慧， 占學林， 謝妮妮， 蔣妍， 汪金華， 凌飛， 吳麗霞， 萬琳. 低溫離體保存黃獨微型塊莖轉錄組、蛋白質組和代謝組的關聯(lián)分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2017， 29（11）： 1827-1834.

[18] ARAPITSAS P， CORTE A D， GIKA H， NARDUZZI L，MATTIVI F， THEODORIDIS G. Studying the effect of storage conditions on the metabolite content of red wine using HILIC LC-MS based metabolomics[J]. Food Chemistry，2016， 197（10）： 1331-1340.