董軍立 賈誠(chéng)謙 姚憲寶 苗二芽 蔡 毅

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院疼痛科,湖北省武漢市 430014)

腰椎間盤(pán)退變是引起腰椎間盤(pán)突出、腰背疼痛、椎管狹窄等病癥的主要原因之一[1]。腰椎間盤(pán)退變發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,衰老、遺傳易感性增強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)障礙、機(jī)械負(fù)荷等均是導(dǎo)致腰椎間盤(pán)病變及退化的關(guān)鍵因素[2]。近年來(lái)有學(xué)者提出,炎癥浸潤(rùn)及氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致腰椎間盤(pán)退變患者出現(xiàn)髓核細(xì)胞數(shù)目減少、纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)消失、椎間盤(pán)組織彈性下降、抗壓能力減退等椎間盤(pán)病理改變的主要原因[3-4]。核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是機(jī)體內(nèi)重要的保護(hù)因子,凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等因素均可促進(jìn)Nrf2入核活化,從而誘導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子如血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)表達(dá),發(fā)揮抗氧化作用[5]。而HO-1高表達(dá)也可抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)入核活化,從而減輕組織炎癥損傷及細(xì)胞凋亡[6]。上述研究結(jié)果提示,抑制Nrf2/HO-1/NF-κB通路的活化可能是抑制或緩解腰椎間盤(pán)退變患者髓核組織炎癥、氧化應(yīng)激損傷及凋亡相關(guān)性病變的潛在機(jī)制。目前臨床上缺乏治療椎間盤(pán)退變的特異性藥物。二甲雙胍是治療糖尿病的一線藥物,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)抑制自噬、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)緩解阿爾茨海默病、帕金森等神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展[7],并通過(guò)上調(diào)髓核細(xì)胞胞外基質(zhì)合成而影響退變的髓核細(xì)胞代謝[8],提示二甲雙胍很可能對(duì)抑制椎間盤(pán)變性及退化有重要作用。本研究基于Nrf2/HO-1/NF-κB通路探討二甲雙胍對(duì)腰椎間盤(pán)退變大白兔模型椎間盤(pán)組織的影響,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只雄性無(wú)特定病原體級(jí)新西蘭大白兔,體質(zhì)量(2.50±0.50)kg,購(gòu)自武漢有度生物科技有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2015-0025]。將大白兔單籠飼養(yǎng)在溫度為(22±2)℃、濕度為(50±5)%的動(dòng)物房?jī)?nèi),并保持12 h明暗循環(huán)。本試驗(yàn)符合3R原則并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[審批號(hào):IACUC-01(20210010014)]。

1.2 主要試劑和儀器 二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號(hào):202103012003),全反式維甲酸(上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司,批號(hào):SIGMA R2625),HE染色液(北京伊塔生物科技有限公司,批號(hào):YT8310);白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):ml027836、ml027836、ml092661、ml094971),Nrf2山羊抗兔一抗、HO-1山羊抗兔一抗、NF-κB山羊抗兔一抗、磷酸化NF-κB(phosphorylated NF-κB,p-NF-κB)山羊抗兔一抗、Ⅱ型膠原蛋白山羊抗兔一抗、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)山羊抗兔一抗、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)山羊抗兔一抗、Caspase-3山羊抗兔一抗、Ⅰ型膠原蛋白山羊抗兔一抗、β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG二抗(Abcam公司,批號(hào):20210708、20210512、20210921、20210704、20210613、20210325、20210416、20210524、20210908、20210926、20210817),DAB、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)、ECL液、RIPA裂解液(上海碧云天生物科技有限公司,批號(hào):P0202、P0010S、P0018FS、P0013B),光學(xué)顯微鏡(HITACHI公司,型號(hào):S-3400N)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 椎間盤(pán)退變模型的建立、分組及干預(yù)方法:采用隨機(jī)數(shù)字表法選取100只大白兔,采用3%戊巴比妥鈉麻醉后行左側(cè)腹背部備皮,暴露L2～6椎間盤(pán),參照文獻(xiàn)[9]的方法采用髓核穿刺抽吸法破壞椎間盤(pán)建立椎間盤(pán)退變模型。術(shù)后12周行X線及MRI檢查,當(dāng)檢查結(jié)果提示椎間隙縮窄且Prirrmann分級(jí)[10]為Ⅱ級(jí)時(shí)判定為造模成功,本研究100只大白兔均造模成功。將椎間盤(pán)退變大白兔模型按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組、Nrf2抑制劑組、二甲雙胍+Nrf2抑制劑組,每組20只。取剩余的20只大白兔作為假手術(shù)組,只暴露其L2～6椎間盤(pán),不進(jìn)行破壞。

將二甲雙胍的使用劑量按人與動(dòng)物體表面積等效劑量換算單位折算為等效劑量40 mg/kg,并設(shè)置低劑量(40 mg/kg)與高劑量(160 mg/kg),然后給予二甲雙胍低劑量組與二甲雙胍高劑量組大白兔灌胃相應(yīng)劑量的二甲雙胍,1次/d。參照文獻(xiàn)[11],給予Nrf2抑制劑組大白兔腹腔注射Nrf2抑制劑(全反式維甲酸)7 mg/kg,1次/48 h。給予二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔灌胃160 mg/kg二甲雙胍及腹腔注射7 mg/kg全反式維甲酸,1次/48 h。給予假手術(shù)組及模型組大白兔灌胃10 mL/kg生理鹽水,1次/d。各組干預(yù)4周。

1.3.2 X線及MRI檢查觀察腰椎骨質(zhì)改變及退變程度:末次干預(yù)后2 h,采用3%戊巴比妥鈉麻醉各組大白兔,參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行腰椎X線檢查及MRI檢查。通過(guò)X線圖像計(jì)算L4～5椎間盤(pán)相對(duì)高度(干預(yù)前椎間隙高度/干預(yù)后椎間隙高度×100%)通過(guò)MRI圖像觀察椎間盤(pán)髓核與纖維環(huán)的形態(tài)及信號(hào)變化,并用Prirrmann分級(jí)法對(duì)椎間盤(pán)退變程度進(jìn)行評(píng)分,Ⅰ級(jí)(正常)為0分,Ⅱ級(jí)(輕度退化)為1分,Ⅲ級(jí)(中度退化)為2分,Ⅳ級(jí)(重度退化)為3分,Ⅴ級(jí)(晚期退化)為4分,評(píng)分越高說(shuō)明椎間盤(pán)退變程度越嚴(yán)重。

1.3.3 HE染色觀察椎間盤(pán)組織病變:X線及MRI檢查2 h后,按隨機(jī)數(shù)字表法選取各組6只大白兔,將其麻醉處死后取椎間盤(pán)組織并用4%多聚甲醛固定,然后用0.5 mol/L乙二胺四乙酸脫鈣20 d,石蠟包埋后制成厚度為4 μm的連續(xù)橫斷面切片。依次行二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水,再用蘇木精浸泡染色5 min,自來(lái)水沖洗20 min,1%酸性酒精分色1～3 s,0.5%伊紅溶液染色1～3 min,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封固,于光學(xué)顯微鏡下觀察纖維環(huán)及髓核形態(tài)變化。

1.3.4 免疫組化法檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白、Nrf2陽(yáng)性表達(dá):取1.2.3制備的椎間盤(pán)組織石蠟切片,經(jīng)脫蠟、透化及抗原修復(fù)處理后,加入稀釋比為1 ∶300的Ⅱ型膠原蛋白山羊抗兔一抗、Nrf2山羊抗兔一抗孵育過(guò)夜,滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG二抗(稀釋比為1 ∶500)孵育45 min,DAB顯色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照,采用ImagePro Plus 6.0軟件分析單位面積內(nèi)(mm2)陽(yáng)性染色的平均光密度值。Ⅱ型膠原蛋白主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)中,Nrf2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有分布,棕黃色染色即為陽(yáng)性染色。

1.3.5 ELISA檢測(cè)椎間盤(pán)組織IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平:X線及MRI檢查2 h后,按隨機(jī)數(shù)字表法選取各組6只大白兔,麻醉處死后取椎間盤(pán)組織,置于液氮凍存。取出凍存的組織,加入液氮后粉碎研磨,獲取勻漿液,按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平。

1.3.6 Western blot檢測(cè)椎間盤(pán)組織Nrf2/HO-1/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白及下游抗氧化、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá):將各組剩余8只大白兔麻醉處死后取椎間盤(pán)組織,置于液氮中凍存。取出凍存的組織,加入液氮后粉碎研磨,獲取勻漿液,加入RIPA裂解液以提取總蛋白,利用BCA法檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度。取95℃高溫變性后的50 μg蛋白,通過(guò)SDS-PAGE分離等量蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶4 ℃封閉PVDF膜1 h,再用TBST洗膜3次,5 min/次,然后將膜與Nrf2、HO-1、NF-κB、p-NF-κB、SOD2、CAT、Caspase-3、Ⅰ型膠原的山羊抗兔一抗(稀釋比均為1 ∶600)4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次,5 min/次,將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG二抗(稀釋比為1 ∶800),37 ℃孵育75 min,TBST洗膜5次,5 min/次。以β-actin抗體(稀釋比為1 ∶700)為內(nèi)參蛋白,采用ECL液顯影曝光后,利用Image J軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大白兔的腰椎骨質(zhì)改變及退變程度 X線檢查顯示,假手術(shù)組大白兔L4～5椎間隙正常,關(guān)節(jié)面光滑平整且骨質(zhì)無(wú)明顯改變;相比于假手術(shù)組,模型組大白兔L4～5椎間隙變窄,關(guān)節(jié)面毛糙,上下椎體前緣增生且呈唇狀改變,相鄰椎體終板骨質(zhì)硬化及骨贅形成明顯,L4～5椎間盤(pán)相對(duì)高度減少(P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔L4～5椎間隙增寬,相鄰椎體終板骨質(zhì)硬化及骨贅形成消失或部分可見(jiàn),L4～5椎間盤(pán)相對(duì)高度均增加,且二甲雙胍高劑量組的L4～5椎間盤(pán)相對(duì)高度大于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔L4～5椎間隙變窄,相鄰椎體終板骨質(zhì)硬化及骨贅形成更為明顯,L4～5椎間盤(pán)相對(duì)高度減少(P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔L4～5椎間隙變窄,相鄰椎體終板骨質(zhì)硬化及骨贅形成明顯,L4～5椎間盤(pán)相對(duì)高度減少(P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔L4～5椎間隙增寬,L4～5椎間盤(pán)相對(duì)高度增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組大白兔L4～5椎間盤(pán)相對(duì)高度的比較(x±s,%)

假手術(shù)組 模型組 二甲雙胍低劑量組 二甲雙胍高劑量組 Nrf2抑制劑組 二甲雙胍+Nrf2抑制劑組

2.2 各組大白兔椎間盤(pán)Prirrmann分級(jí)評(píng)分的比較 MRI檢查顯示,假手術(shù)組大白兔腰椎間盤(pán)呈高信號(hào);相比于假手術(shù)組,模型組大白兔腰椎間盤(pán)呈低信號(hào),椎間盤(pán)Prirrmann分級(jí)評(píng)分升高(P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔腰椎間盤(pán)呈高信號(hào),椎間盤(pán)Prirrmann分級(jí)評(píng)分均降低,且二甲雙胍高劑量組的椎間盤(pán)Prirrmann分級(jí)評(píng)分低于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤(pán)呈低信號(hào),椎間盤(pán)Prirrmann分級(jí)評(píng)分升高(P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤(pán)呈低信號(hào),椎間盤(pán)Prirrmann分級(jí)評(píng)分高于二甲雙胍高劑量組(均P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤(pán)呈高信號(hào),椎間盤(pán)Prirrmann分級(jí)評(píng)分降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組大白兔椎間盤(pán)Prirrmann分級(jí)評(píng)分的比較(x±s,分)

假手術(shù)組 模型組 二甲雙胍低劑量組 二甲雙胍高劑量組 Nrf2抑制劑組 二甲雙胍+Nrf2抑制劑組

2.3 各組大白兔腰椎間盤(pán)組織病理變化的情況 HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大白兔腰椎間盤(pán)組織纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)及髓核細(xì)胞、纖維樣軟骨細(xì)胞的形態(tài)均正常;相比于假手術(shù)組,模型組大白兔腰椎間盤(pán)組織纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)紊亂、部分?jǐn)嗔?髓核細(xì)胞被膠原組織分裂為橢圓形的細(xì)胞島,纖維樣軟骨細(xì)胞增多;相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔腰椎間盤(pán)組織纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)逐漸清晰,髓核細(xì)胞逐漸增多,纖維樣軟骨細(xì)胞減少;相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤(pán)組織纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)斷裂更明顯,髓核細(xì)胞被纖維樣軟骨細(xì)胞代替;相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤(pán)組織纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)斷裂及髓核細(xì)胞凋亡的情況更嚴(yán)重;相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔腰椎間盤(pán)組織纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)清晰,髓核細(xì)胞增多,纖維樣軟骨細(xì)胞減少。見(jiàn)圖3。

假手術(shù)組 模型組 二甲雙胍低劑量組 二甲雙胍高劑量組 Nrf2抑制劑組 二甲雙胍+Nrf2抑制劑組

2.4 各組大白兔髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)的比較 免疫組化染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大白兔的髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性染色較深;與假手術(shù)組相比,模型組大白兔的髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性染色變淺,Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值降低(P<0.05);與模型組相比,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔的髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性染色加深,Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值均升高,且二甲雙胍高劑量組Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值高于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);與模型組相比,Nrf2抑制劑組大白兔的髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性染色變淺,Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值降低(P<0.05);與二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組相比,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔的髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性染色變淺,Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值降低(P<0.05);與Nrf2抑制劑組相比,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔的髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性染色加深,Ⅱ型膠原蛋白平均光密度值升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表3。

表3 各組大白兔椎間盤(pán)組織Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)平均光密度值的比較(x±s)

假手術(shù)組 模型組 二甲雙胍低劑量組 二甲雙胍高劑量組 Nrf2抑制劑組 二甲雙胍+Nrf2抑制劑組

2.5 各組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2陽(yáng)性表達(dá)的比較 免疫組化染色結(jié)果顯示,相比于假手術(shù)組,模型組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2陽(yáng)性染色變淺,Nrf2平均光密度值降低(P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2陽(yáng)性染色加深,Nrf2平均光密度值均升高,且二甲雙胍高劑量組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2平均光密度值高于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2陽(yáng)性染色變淺,Nrf2平均光密度值降低(P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2陽(yáng)性染色變淺,Nrf2平均光密度值降低(P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2陽(yáng)性染色加深,Nrf2平均光密度值升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5、表4。

表4 各組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2平均光密度值的比較(x±s)

假手術(shù)組 模型組 二甲雙胍低劑量組 二甲雙胍高劑量組 Nrf2抑制劑組 二甲雙胍+Nrf2抑制劑組

2.6 各組大白兔椎間盤(pán)組織IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平的比較 相比于假手術(shù)組,模型組大白兔椎間盤(pán)組織的IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平均升高(均P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔椎間盤(pán)組織的IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平均降低,且二甲雙胍高劑量組上述指標(biāo)均低于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織的IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平均升高(均P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織的IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平均升高(均P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織的IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平均降低(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組大白兔椎間盤(pán)組織IL-6、IL-1β、活性氧簇、丙二醛水平的比較(x±s)

2.7 各組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量及p-NF-κB/NF-κB值的比較 相比于假手術(shù)組,模型組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量均降低,p-NF-κB/NF-κB值升高(均P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量均升高,p-NF-κB/NF-κB值均降低,且二甲雙胍高劑量組的上述指標(biāo)均優(yōu)于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量均降低,p-NF-κB/NF-κB值升高(均P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量均降低,p-NF-κB/NF-κB值升高(均P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量升高,p-NF-κB/NF-κB值降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6、表6。

表6 各組大白兔椎間盤(pán)組織Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-NF-κB/NF-κB值的比較(x±s)

圖6 各組大白兔蛋白表達(dá)Western blot圖

2.8 各組大白兔椎間盤(pán)組織SOD2、CAT、Caspase-3蛋白表達(dá)量及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量的比較 相比于假手術(shù)組,模型組大白兔椎間盤(pán)組織SOD2、CAT蛋白表達(dá)量及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量均降低,Caspase-3蛋白表達(dá)量升高(均P<0.05);相比于模型組,二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組大白兔椎間盤(pán)組織SOD2、CAT蛋白表達(dá)量及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量均升高,Caspase-3蛋白表達(dá)量均降低,且二甲雙胍高劑量組上述指標(biāo)均優(yōu)于二甲雙胍低劑量組(均P<0.05);相比于模型組,Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織SOD2、CAT蛋白表達(dá)量及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量均降低,Caspase-3蛋白表達(dá)量升高(均P<0.05);相比于二甲雙胍低劑量組、二甲雙胍高劑量組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織SOD2、CAT蛋白表達(dá)量及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量均降低,Caspase-3蛋白表達(dá)量升高(均P<0.05);相比于Nrf2抑制劑組,二甲雙胍+Nrf2抑制劑組大白兔椎間盤(pán)組織SOD2、CAT蛋白表達(dá)量及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量升高,Caspase-3蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。見(jiàn)圖7、表7。

表7 各組大白兔椎間盤(pán)組織SOD2、CAT、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及Ⅰ型膠原蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

圖7 各組大白兔蛋白表達(dá)Western blot圖

3 討 論

椎間盤(pán)由髓核、纖維環(huán)及軟骨終板構(gòu)成。髓核內(nèi)豐富的Ⅱ型膠原纖維隨機(jī)排列在蛋白多糖基質(zhì)中,使髓核具有膨脹性,發(fā)揮抗壓縮作用[13]。纖維環(huán)內(nèi)含有豐富的Ⅰ型膠原纖維,由25層平行膠原纖維以60°交叉排列在椎體與脊柱軸線之間,從而有效抵抗脊柱彎曲及扭轉(zhuǎn)拉力[14]。由軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的軟骨終板,是為椎間盤(pán)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)的重要通道[15]。纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)排列混亂并逐漸消失,髓核細(xì)胞體積及含水成分減少,軟骨終板內(nèi)軟骨細(xì)胞退化、骨贅形成,而骨贅大量形成可導(dǎo)致椎間盤(pán)營(yíng)養(yǎng)通道閉塞、纖維環(huán)及髓核大量減少,并最終引起椎間盤(pán)抗壓縮、抗脊柱彎曲及扭轉(zhuǎn)的作用減退[16]。關(guān)于椎間盤(pán)纖維環(huán)、髓核細(xì)胞及軟骨細(xì)胞減少的機(jī)制,國(guó)內(nèi)外學(xué)者尚未達(dá)成一致,目前公認(rèn)氧化應(yīng)激、炎癥可能是引起椎間盤(pán)組織結(jié)構(gòu)破壞的主要原因。研究表明,在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,活性氧簇及丙二醛的大量聚集,可通過(guò)一系列途徑破壞并降解髓核細(xì)胞內(nèi)的聚糖蛋白、Ⅱ型膠原蛋白等,從而引起髓核組織皺縮、細(xì)胞凋亡及功能丟失[17]。氧化應(yīng)激過(guò)程往往伴隨著炎癥的發(fā)生。既往研究表明,炎癥調(diào)節(jié)因子如NF-κB對(duì)活性氧簇極為敏感,機(jī)體活性氧簇的大量蓄積可激活酪氨酸激酶并誘導(dǎo)NF-κB二聚體與NF-κB抑制蛋白解離而入核活化,活化的NF-κB可與相應(yīng)DNA的κB結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,誘導(dǎo)椎間盤(pán)組織中基質(zhì)金屬蛋白酶及水通道蛋白酶降解而誘發(fā)凋亡;活化的NF-κB也可誘導(dǎo)IL-6、IL-1β轉(zhuǎn)錄并釋放,而IL-6、IL-1β可通過(guò)脂肪酸合成酶/脂肪酸合成酶配體途徑誘導(dǎo)髓核細(xì)胞及軟骨細(xì)胞凋亡,并參與椎間盤(pán)退變[18]。本研究采用髓核穿刺抽吸法建立腰椎間盤(pán)退變模型,發(fā)現(xiàn)大白兔的椎間盤(pán)組織纖維環(huán)破壞、髓核細(xì)胞減少,部分髓核被類骨質(zhì)取代,椎間隙變窄、關(guān)節(jié)面毛糙,椎體前緣骨質(zhì)增生并呈唇狀改變,椎間盤(pán)退變程度加重(椎間盤(pán)Prirrmann分級(jí)評(píng)分升高),髓核細(xì)胞凋亡加重(Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性染色減弱),纖維環(huán)減少明顯(Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)降低),提示大白兔椎間盤(pán)退變明顯。另外,椎間盤(pán)組織中氧化應(yīng)激產(chǎn)物(活性氧簇及丙二醛)及炎癥因子水平(IL-6、IL-1β)均升高,提示氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)參與椎間盤(pán)退變過(guò)程。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn),用活性氧簇及IL-1β阻斷劑抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng),可明顯延緩髓核細(xì)胞及纖維環(huán)組織破壞,達(dá)到延緩椎間盤(pán)退變的目的[3,17],提示抗炎及抗氧化應(yīng)激可能是治療椎間盤(pán)退變的潛在策略。二甲雙胍除了具有降糖作用,還具有抗炎及抗氧化作用。田徑等[19]發(fā)現(xiàn),二甲雙胍的抗炎及抗氧化作用可減輕脂多糖誘導(dǎo)的腦損傷;趙季偉等[20]發(fā)現(xiàn),二甲雙胍的抗凋亡作用可抑制脊髓組織壞死;Chen等[21]發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可通過(guò)刺激自噬來(lái)抑制體內(nèi)及體外髓核細(xì)胞的衰老及凋亡,提示二甲雙胍也可能為緩解椎間盤(pán)退變的潛在藥物。但二甲雙胍的抗炎、抗氧化、抗凋亡作用是否能緩解椎間盤(pán)組織應(yīng)激性退變,相關(guān)研究仍較少。本研究結(jié)果顯示,給予低劑量、高劑量二甲雙胍干預(yù)后,腰椎間盤(pán)退變模型大白兔的椎間盤(pán)退變程度減輕,椎間隙變窄及骨質(zhì)改變、椎間盤(pán)組織纖維環(huán)破壞、髓核細(xì)胞減少及骨贅增加等病理表現(xiàn)得以緩解,髓核細(xì)胞(Ⅱ型膠原蛋白陽(yáng)性染色)、纖維環(huán)(Ⅰ型膠原蛋白表達(dá))均有所增加,椎間盤(pán)組織中的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)也明顯減弱,表明二甲雙胍可減輕椎間盤(pán)組織纖維環(huán)減少及髓核細(xì)胞凋亡等退變表現(xiàn),且其抑制作用可能與抑制炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。此外,高劑量二甲雙胍對(duì)椎間盤(pán)組織損傷的改善程度優(yōu)于低劑量二甲雙胍,推測(cè)二甲雙胍對(duì)椎間盤(pán)組織損傷的改善作用可能具有劑量依賴性,在后續(xù)的研究中將對(duì)二甲雙胍的最佳給藥劑量及是否存在劑量依賴性進(jìn)行深入探究。

Nrf2/HO-1/NF-κB通路是調(diào)控炎癥、氧化應(yīng)激及凋亡反應(yīng)的關(guān)鍵通路之一。研究表明,活性氧簇及丙二醛可與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1的Cys273及Cys288位點(diǎn)相互作用并誘導(dǎo)其構(gòu)象改變,導(dǎo)致Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1解離活化入核,活化的Nrf2可與抗氧化反應(yīng)元件的DNA啟動(dòng)子結(jié)合序列結(jié)合并形成復(fù)合物,啟動(dòng)下游抗氧化酶、抗炎蛋白及Ⅱ相解毒酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗炎、抗氧化[22]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),Nrf2的表達(dá)隨著椎間盤(pán)退變程度的加重而降低,并認(rèn)為提高Nrf2的抗氧化及抗炎作用,對(duì)延緩椎間盤(pán)退變有顯著效果[22]。另外,HO-1為Nrf2的下游轉(zhuǎn)錄因子之一,Nrf2活化后可促進(jìn)HO-1的轉(zhuǎn)錄,HO-1的高表達(dá)可促進(jìn)SOD2及CAT等抗氧化酶的表達(dá),從而清除活性氧簇及丙二醛,發(fā)揮抗氧化作用,HO-1的高表達(dá)還可抑制活化NF-κB介導(dǎo)的炎癥應(yīng)答及凋亡途徑的活化[23]。張雪梅等[24]發(fā)現(xiàn),上調(diào)HO-1表達(dá)可抑制髓核細(xì)胞中磷酸化NF-κB的活化,從而減少IL-1β促發(fā)的凋亡。本研究結(jié)果顯示,Nrf2在腰椎間盤(pán)退變模型大白兔中表達(dá)降低,且其下游HO-1及抗氧化酶表達(dá)均降低,NF-κB介導(dǎo)的炎癥及凋亡反應(yīng)增強(qiáng),而進(jìn)一步抑制Nrf2/HO-1表達(dá)后,腰椎間盤(pán)退變模型大白兔的椎間盤(pán)退變程度加重,炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),髓核細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯,提示Nrf2/HO-1介導(dǎo)的抗氧化、抗炎、抗凋亡活性降低可能參與椎間盤(pán)退變的過(guò)程。二甲雙胍各劑量組大白兔椎間盤(pán)退變組織中的Nrf2、HO-1表達(dá)升高,NF-κB活化及炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡反應(yīng)均受到抑制,提示二甲雙胍具有抗椎間盤(pán)退變的作用,這可能與其促進(jìn)Nrf2/HO-1介導(dǎo)的抗氧化、抗炎及抗凋亡作用有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證二甲雙胍在椎間盤(pán)退變中的作用機(jī)制,本研究采用Nrf2抑制劑進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),并在二甲雙胍處理的基礎(chǔ)上應(yīng)用Nrf2抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,與單獨(dú)應(yīng)用Nrf2抑制劑相比,二甲雙胍與Nrf2抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后,大白兔椎間盤(pán)退變組織中的Nrf2、HO-1表達(dá)升高,NF-κB活化及炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡反應(yīng)均受到抑制,表明二甲雙胍可以緩解Nrf2抑制劑對(duì)兔椎間盤(pán)退變程度、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及髓核細(xì)胞凋亡的影響。此外,與單獨(dú)應(yīng)用二甲雙胍相比,二甲雙胍與Nrf2抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后,大白兔椎間盤(pán)退變組織中Nrf2、HO-1表達(dá)降低,NF-κB活化及炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡反應(yīng)均增強(qiáng),表明Nrf2抑制劑可在一定程度上削弱二甲雙胍的抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡作用,從而加重椎間盤(pán)退變程度。

綜上所述,二甲雙胍可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路,抑制NF-κB活化,來(lái)發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡的作用,從而延緩椎間盤(pán)退變,且高劑量二甲雙胍的干預(yù)效果更好。這或許可為椎間盤(pán)退變的治療提供新的策略,但Nrf2抑制劑并不能完全逆轉(zhuǎn)二甲雙胍的抗椎間盤(pán)退變作用,提示二甲雙胍還可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮抗椎間盤(pán)退變作用,這需要深入研究以進(jìn)一步探討。