魏潔書，胡錦珊，洪群華，邱遠(yuǎn)琦，劉禹辰，羅育文，張素中

（廣州新華學(xué)院，廣東廣州 510520）

南藥，是指我國秦嶺以南地區(qū)生產(chǎn)的藥材，常指生長于南方五嶺山脈以南的廣東、廣西、海南3 ?。▍^(qū)）的陸地和海島的中藥[1]。南藥是中藥資源的重要組成部分，資源種類繁多，含有多種有效成分，且大多具有揮發(fā)油成分[2]。多數(shù)南藥中的揮發(fā)油成分具有抗菌作用，如砂仁、肉豆蔻、八角茴香等[3-5]。

陽春砂和草豆蔻均為著名南藥。陽春砂為姜科（Zingiberaceae）植物陽春砂（Amomum villosumLour.）的干燥成熟果實(shí)，能化濕開胃，溫脾止瀉，理氣安胎。草豆蔻為姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadaiHayata.）的干燥近成熟種子，能燥濕行氣、溫中止嘔。揮發(fā)油是陽春砂和草豆蔻發(fā)揮藥效的主要成分[6]。目前，陽春砂果實(shí)與葉片中所含有揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌抑菌活性的差異性尚不明確，草豆蔻果實(shí)及葉片揮發(fā)油的抑菌活性鮮有報(bào)道。

本文擬提取陽春砂、草豆蔻2 種南藥不同部位的揮發(fā)油進(jìn)行體外抗菌藥效實(shí)驗(yàn)，初步研究2 種南藥對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌三種常見菌株的抑菌效果，為其抑菌活性在食品、藥品研究中的開發(fā)及應(yīng)用提供參考，同時(shí)為陽春砂和草豆蔻非藥用部位的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

陽春砂（Amomum villosumLour.）、草豆蔻（Alpinia katsumadaiHayata.）植株采自廣州新華學(xué)院廣州校區(qū)藥用植物園，干燥成熟果實(shí)購自廣州集芝寶中藥有限公司，由廣州新華學(xué)院藥學(xué)院張素中教授鑒定。

菌種：大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）來自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BNCC109047），來自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

LB 瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；鏈霉素（C014）和青霉素（C001），杭州濱河微生物試劑有限公司。

BHC-1300 ⅡA/B 生物潔凈安全柜，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；GF54DA 立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；GSP-9160MBE 電熱恒溫培養(yǎng)箱（隔水式），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DMF-20A 搖擺式高速中藥粉碎機(jī)，浙江溫嶺市銘大藥材機(jī)械設(shè)備有限公司；YP60IN 電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TC-15 套式恒溫器，近湖鎮(zhèn)教學(xué)儀器廠。

1.2 揮發(fā)油提取

1.2.1 陽春砂、草豆蔻陰干葉片揮發(fā)油提取

（1）摘取陽春砂新鮮葉片，洗凈、陰干，用搖擺式高速中藥粉碎機(jī)適當(dāng)粉碎后按1.0 ∶13.3（g ∶mL）的投料比加入蒸餾水，于揮發(fā)油提取器中回流提取7 h，獲得揮發(fā)油。用無水硫酸鈉干燥，得到具有刺激性氣味的無色透明液體，裝于合適的EP 管中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）草豆蔻陰干葉片同理操作，投料比為1.0 ∶12.5（g ∶mL），回流提取時(shí)間為6 h，得到具有刺激性氣味的淺黃色液體，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 陽春砂果實(shí)、草豆蔻種子團(tuán)揮發(fā)油提取

（1）用粉碎機(jī)適當(dāng)粉碎陽春砂果實(shí)，按投料比1.0 ∶12.5（g ∶mL）加入蒸餾水，用揮發(fā)油提取器回流提取6 h 得揮發(fā)油，用無水硫酸鈉干燥，得到具有刺激性氣味的黃色或淺黃色液體，裝于合適的EP管中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）草豆蔻種子團(tuán)同理操作，投料比為1.0 ∶6.67（g ∶mL），回流提取6 h，得到具有刺激性氣味的黃色或淺黃色液體，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 揮發(fā)油提取率

揮發(fā)油提取率按照公式（1）計(jì)算。

其中，T為揮發(fā)油提取率，m油和m藥分別為揮發(fā)油質(zhì)量和藥材質(zhì)量，g。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。

1.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.3.1 制備培養(yǎng)基

稱取和量取比例為1 ∶30（g ∶mL）的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基粉末和無菌蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，用牛皮紙包扎，在高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，倒入培養(yǎng)皿里，約5 mm 的高度，冷卻后備用，以上操作均在生物安全柜進(jìn)行。

1.3.2 制備菌懸液

參考文獻(xiàn)[7]制備菌懸液。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3 種供試菌分別接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上活化，第二天用無菌接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上分別挑取各供試菌接種到LB 液體培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后吸取200 μL 各供試菌的菌懸液，用無菌蒸餾水分別稀釋10、102、103、104、105、106、107、108倍，再分別吸取各供試菌稀釋液200 μL 均勻涂到營養(yǎng)瓊脂平板上，于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。每個(gè)濃度重復(fù)三次，通過平板計(jì)數(shù)法確定菌液的稀釋度，使最后菌懸液含量為106～107/mL，待用。

1.3.3 抑菌圈測(cè)定

分別吸取三種菌液200 μL 到上述配制好培養(yǎng)基的平板中，使用涂布器將菌懸液供試菌種涂抹均勻。用滅菌的鑷子夾取已滅菌的空白藥敏片，浸泡在陽春砂、草豆蔻陰干葉子和果實(shí)提取得到的揮發(fā)油中，浸泡20 min 之后取出，稍微晾干，貼在已經(jīng)分別涂布了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的平板里，每個(gè)平板分別貼三片藥敏片，分別是陽性對(duì)照、空白對(duì)照和供試品揮發(fā)油，呈正三角形。

大腸桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)以鏈霉素（10 μL/片）作為陽性對(duì)照，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)以青霉素（10 μL/片）作為陽性對(duì)照。空白對(duì)照以空白藥敏片作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3 次。于電熱恒溫培養(yǎng)箱（隔水式）37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑大小，取平均值進(jìn)行分析。判定標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)[8]

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)油提取率

計(jì)算得到陽春砂陰干葉片及果實(shí)的揮發(fā)油提取率分別為0.40%和2.52%，草豆蔻陰干葉片和種子團(tuán)揮發(fā)油提取效率分別為0.14%和0.73%，兩種南藥果實(shí)均具有較高的含油量。

2.2 陽春砂不同部位揮發(fā)油抑菌效果

由表2 可知，陽春砂葉片和果實(shí)的揮發(fā)油對(duì)三種菌株均具有抑菌效果，其中對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果均強(qiáng)于其余兩種菌株，抑菌圈直徑分別達(dá)到18.67 mm和28.67 mm，為高度敏感；陽春砂果實(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌也有抑菌效果，抑菌圈直徑達(dá)到26.67 mm，為高度敏感；對(duì)大腸桿菌的抑菌效果均較弱。空白對(duì)照結(jié)果均無抑菌圈。陽春砂葉片和果實(shí)對(duì)3 種菌株的抑菌效果分別見圖1 和圖2。

表2 陽春砂不同提取部位揮發(fā)油對(duì)三種菌株的抑菌效果（±s，n=3） （單位：mm）

表2 陽春砂不同提取部位揮發(fā)油對(duì)三種菌株的抑菌效果（±s，n=3） （單位：mm）

提取部位大腸桿菌 金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌供試品 陽性對(duì)照 供試品 陽性對(duì)照 供試品 陽性對(duì)照葉片 8.33±0.47 20.33±0.94 8.00±0.82 37.00±5.72 18.67±1.70 21.33±3.86果實(shí) 10.00±0.00 20.00±0.00 26.67±2.36 41.67±2.36 28.67±5.73 35.00±5.72

圖1 陽春砂陰干葉片對(duì)3 種菌株的抑菌效果

圖2 陽春砂果實(shí)對(duì)3 種菌株的抑菌效果

2.3 草豆蔻不同提取部位揮發(fā)油抑菌效果

由表3 可知，草豆蔻葉片和種子團(tuán)揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑分別達(dá)到21.33 mm 和15.67 mm，為高度敏感；葉片和種子團(tuán)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果相當(dāng)，抑菌圈直徑分別為12.67 mm 和13.33 mm，具有一定的抑菌效果，為中度敏感；對(duì)大腸桿菌的抑菌效果均較弱，為偏弱的中度敏感?？瞻讓?duì)照均無抑菌圈。草豆蔻陰干葉片和種子對(duì)三種菌株的抑菌效果分別見圖3 和圖4。

表3 草豆蔻不同提取部位揮發(fā)油對(duì)三種菌株的抑菌效果（±s，n=3） （單位：mm）

表3 草豆蔻不同提取部位揮發(fā)油對(duì)三種菌株的抑菌效果（±s，n=3） （單位：mm）

提取部位 大腸桿菌 金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌供試品 陽性對(duì)照 供試品 陽性對(duì)照 供試品 陽性對(duì)照葉片 11.33±1.89 22.00±2.16 12.67±0.47 43.00±0.00 21.33±0.94 24.00±0.00果實(shí) 9.33±0.82 20.67±0.47 13.33±1.89 44.70±0.94 15.67±1.25 24.33±0.94

圖3 草豆蔻陰干葉片對(duì)3 種菌株的抑菌效果

圖4 草豆蔻種子團(tuán)對(duì)3 種菌株的抑菌效果

3 討論

多數(shù)南藥中的揮發(fā)油成分具有抗菌作用，如八角茴香揮發(fā)油對(duì)多種革蘭氏陽性菌和陰性菌具有抗菌效果，如金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌等。紫蘇葉揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有較強(qiáng)的抗菌作用[9]。肉豆蔻揮發(fā)油可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等，是一種天然的廣譜抗菌藥。此外，廣藿香、丁香、姜黃等南藥中揮發(fā)油成分也具有此方面的藥理作用[10-12]。

陽春砂和草豆蔻是著名的南藥，其揮發(fā)油含量較高。本研究發(fā)現(xiàn)，陽春砂和草豆蔻藥用部位（果實(shí)/種子團(tuán)）及非藥用部位（葉片）提取的揮發(fā)油均對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，陽春砂果實(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果較葉片明顯，草豆蔻葉片和種子團(tuán)對(duì)金黃色葡萄球菌都有一定的抑菌效果，2 種南藥揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌的抑菌效果均不明顯。由于揮發(fā)油在水中溶解度低，故在培養(yǎng)基中不易擴(kuò)散，同時(shí)揮發(fā)油的揮發(fā)也降低了其在濾紙表面的濃度，故陽春砂和草豆蔻揮發(fā)油的實(shí)際抑菌作用可能更強(qiáng)。

有研究表明，陽春砂果實(shí)揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和糞腸球菌表現(xiàn)出顯著的抑制活性[13]。本研究中，陽春砂果實(shí)和葉片揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出一定的抑菌效果，其中果實(shí)揮發(fā)油的抑菌效果更優(yōu)。研究表明，陽春砂果實(shí)揮發(fā)油中主要含有乙酸龍腦脂、樟腦和烏藥醇，葉片揮發(fā)油中主要含有α-蒎烯、β-蒎烯和檸檬烯[14-15]。乙酸龍腦酯作為陽春砂果實(shí)的主要藥效成分，有顯著的抑菌效果，因而果實(shí)揮發(fā)油抑菌效果更優(yōu)。陽春砂葉片中的β-蒎烯是植物中廣泛分布的揮發(fā)性萜類[16]，α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯同樣具有抑菌殺菌作用[17-20]。草豆蔻果實(shí)及葉片揮發(fā)油主要含有法尼醇和桉葉油素[21-22]，其中法尼醇具有殺菌作用[23]。

研究表明，揮發(fā)油的整體抑菌活性優(yōu)于其中若干化學(xué)成分的組合，整體抑菌活性與其化學(xué)成分之間的協(xié)同作用有密切關(guān)系[24-26]，微量成分與主要成分更有可能形成協(xié)同抑菌作用?；陉柎荷昂筒荻罐]發(fā)油中含有的主要化學(xué)成分，可認(rèn)為陽春砂揮發(fā)油抑菌活性可能是乙酸龍腦酯、樟腦與其他成分協(xié)同作用的結(jié)果，草豆蔻揮發(fā)油的抑菌活性可能是法尼醇、桉葉油素與其他成分協(xié)同作用的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究表明，陽春砂葉片和果實(shí)、草豆蔻葉片和種子團(tuán)的揮發(fā)油對(duì)枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌效果，對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出一定的抑菌活性。陽春砂果實(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果。本研究初步探討了南藥陽春砂和草豆蔻的抑菌活性，為其抑菌活性在食品、藥品研究中的開發(fā)及應(yīng)用提供了參考，同時(shí)為陽春砂和草豆蔻非藥用部位的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。