卞澤昌，陳健安，王亞丹，黃壯，杜春民，蔡小輝，胥鵬*，關(guān)杰耀,

（1.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530004；2.北部灣大學(xué) 海洋學(xué)院 廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州 535011）

卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）因肉質(zhì)鮮美、繁殖周期短、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高而在中國(guó)被廣泛養(yǎng)殖。但近年來(lái)，隨著卵形鯧鲹養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害頻繁暴發(fā)，鏈球菌病就是其中之一[1]。鏈球菌病的頻繁發(fā)生給世界各地的養(yǎng)魚(yú)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]，受鏈球菌影響的魚(yú)類包括牙鲆（Paralichthys olivaceus）[5]、尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）[6]、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[7]、卵形鯧鲹[3]和觀賞魚(yú)[3,8]等，感染鏈球菌的魚(yú)通常表現(xiàn)出非常相似的癥狀，如眼球突出、游泳異常、腦膜炎和內(nèi)臟出血等[2-3]。無(wú)乳鏈球菌作為鏈球菌中的一種，不僅會(huì)影響哺乳動(dòng)物[9]，還會(huì)對(duì)魚(yú)類造成感染，如齊口裂腹魚(yú)（Schizothorax prenanti）[10]、尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）[11]和尖吻鱸（Lates calcarifer）[12]等。研究顯示無(wú)乳鏈球菌引起的疾病可造成卵形鯧鲹的高死亡率，嚴(yán)重阻礙卵形鯧鲹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[3]。利用分子生物學(xué)技術(shù)研究卵形鯧鲹感染無(wú)乳鏈球菌后的免疫應(yīng)答機(jī)制是至關(guān)重要的。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）作為一種快速、方便的基因組研究方法，可以識(shí)別許多功能基因和分子標(biāo)記[13]，近年來(lái)已發(fā)展成為研究魚(yú)類病毒性和細(xì)菌性疾病發(fā)病機(jī)制的有力工具。例如，利用RNA-seq 技術(shù)檢測(cè)了牙鲆淋巴囊腫病毒、病毒性出血敗血癥和細(xì)胞腫大病毒引起的免疫應(yīng)答和感染[13-14]，以及通過(guò)RNA-seq 分析羅非魚(yú)和斑馬魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后的免疫反應(yīng)[11,15]等。本研究通過(guò)給健康的卵形鯧鲹腹腔注射無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行攻毒，然后對(duì)卵形鯧鲹脾臟進(jìn)行RNA 測(cè)序。構(gòu)建測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)后進(jìn)行分析，利用GO 和KEGG 富集分析對(duì)差異表達(dá)基因（DEGs）和信號(hào)通路進(jìn)行富集分析，并通過(guò)STEM 軟件分析，確定DEGs 的表達(dá)趨勢(shì)。本研究為進(jìn)一步篩選和研究卵形鯧鲹無(wú)乳鏈球菌感染后的免疫相關(guān)基因和通路提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)和菌株

36 條健康的卵形鯧鲹購(gòu)自廣西欽州市犀牛角鎮(zhèn)鴻鈺水產(chǎn)科技有限公司，體重為（50±0.7）g。并將其置于200 L 水箱中用處理過(guò)的海水在28 ～30 ℃下適應(yīng)10 d。無(wú)乳鏈球菌由北部灣大學(xué)蔡小輝副教授惠贈(zèng)。

1.2 試劑與儀器

TRNzol Universal 總RNA 提取試劑（100 mL），北京天根生化科技有限公司；腦心浸出液肉湯（BHI）（250 g），北京索萊寶科技有限公司；瓊脂粉（250 g），上海生工生物工程股份有限公司；無(wú)水乙醇、氯仿，分析純，成都科龍化工試劑有限公司；NaoDrop2000 核酸濃度檢測(cè)儀，美國(guó)Thermo Scientific 公司；DYY-6C凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司；GDBL-1000 凝膠成像儀，美國(guó)Axygen 公司；THZ-92CS 氣浴恒溫振蕩器，杭州川恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；2-16KL臺(tái)式低溫離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)及組織采集

將實(shí)驗(yàn)菌株無(wú)菌接種到BHI 固體培養(yǎng)基中過(guò)夜，然后挑取單克隆至10 mL BHI 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下以200 r/min 振蕩孵育過(guò)夜，最后在50 mL BHI液體培養(yǎng)基中按1 ∶100（菌液∶液體培養(yǎng)基）體積比例繼續(xù)在37 ℃下以200 r/min 振蕩孵育10 h。4 ℃離心收集細(xì)菌菌體，用PBS 緩沖液（pH=7.4）重懸，通過(guò)梯度稀釋法將重懸菌液稀釋106倍，最后使用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

將36 條魚(yú)分為0 h（對(duì)照組，C）、6 h（實(shí)驗(yàn)組，W6）和24 h（實(shí)驗(yàn)組， W24）3 組，每組包含12 條魚(yú)；對(duì)照組腹腔注射100 μL PBS 緩沖液（pH = 7.4），W6 組與W24 組腹腔注射100 μL 1×107CFU/mL 無(wú)乳鏈球菌懸液。注射后0 h、6 h 和24 h 收集每組9條魚(yú)的脾臟，每3個(gè)脾臟混合成一個(gè)樣品并標(biāo)明名稱，置于-80 ℃保存至RNA 提取過(guò)程。

1.4 RNA 提取、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

使用Trizol 提取總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度檢測(cè)儀評(píng)估RNA 完整性和濃度，之后構(gòu)建cDNA 文庫(kù)，送往廣州基迪奧生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 組裝和注釋

為了保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾，以減少無(wú)效數(shù)據(jù)所帶來(lái)的分析干擾，首先利用fastp對(duì)raw reads 過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)得到clean reads，再通過(guò)Trinity 軟件進(jìn)行組裝獲得unigenes。將獲得的unigenes通過(guò)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、GO 數(shù)據(jù)庫(kù)、COG/KOG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋。

1.6 差異表達(dá)基因分析方法

使用DESeq2 軟件分析3 個(gè)不同組之間的差異表達(dá)（并在兩個(gè)樣本之間使用edgeR）。以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05 和絕對(duì)折疊變化≥2 為參數(shù)，判斷存在差異表達(dá)的基因?；赪allenius 非中心超幾何分布，GOseq 包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析。通過(guò)KEGG 顯著富集分析找出基因顯著富集的通路，通過(guò)通路顯著富集確定基因參與的最主要生化代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1.7 趨勢(shì)分析

為檢驗(yàn)DEGs 的表達(dá)模式，先將每個(gè)樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)歸一化為0、log2（v1/v0）、log2（v2/v0），再通過(guò)STEM 軟件進(jìn)行聚類。隨后，對(duì)所有圖譜中的DEGs 進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。通過(guò)顯著性分析和FDR 校正假設(shè)檢驗(yàn)，將Q 值≤0.05 的GO 條目或通路分類為顯著富集的GO 條目或通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 測(cè)序和功能注釋

測(cè)序結(jié)果顯示，raw reads 經(jīng)過(guò)過(guò)濾后，所有clean reads 被組裝成72 857 個(gè)unigenes，其中平均長(zhǎng)度和N50 分別為1 121 bp 和2 553 bp。通過(guò)主要功能數(shù)據(jù)庫(kù)（NR、KOG/COG、Swiss-Prot 和KEGG）共對(duì)72 857 個(gè)unigenes 進(jìn)行了注釋，獲得結(jié)果分別為25 089 個(gè)（占34.56%）、23 324 個(gè)（占32.01%）、18 500 個(gè)（占25.39%）和14 712 個(gè)（占20.19%）unigenes。通過(guò)DESeq2 分析共發(fā)現(xiàn)了10 014 個(gè)DEGs。相較于對(duì)照組，6 h 中發(fā)現(xiàn)了4 749 個(gè)DEGs，其中上調(diào)和下調(diào)DEGs 分別為1 812 和2 937 個(gè)（圖1a）；24 h 中共發(fā)現(xiàn)8 651 個(gè)DEGs，其中上調(diào)和下調(diào)DEGs 分別為4 418 和4 233 個(gè)（圖1b）。在6 h 和24 h 組中同時(shí)出現(xiàn)表達(dá)的DEGs 有3 386 個(gè)。

圖1 差異表達(dá)火山圖

2.2 GO 和KEGG 富集分析

基于GO 注釋，進(jìn)行GO 分析以得知DEGs 的功能，GO 分析的3 個(gè)主要類別是分子功能（Molecular Function）、細(xì)胞成分（Cellular Component）和生物過(guò)程（Biological Process）（圖2）。在生物過(guò)程類別中，6 h 和24 h 的DEGs 主要在細(xì)胞過(guò)程（Cellular process）、單有機(jī)體過(guò)程（Single organism process）和代謝過(guò)程（Metabolic process）中富集，其中免疫系統(tǒng)過(guò)程（Immune system process）在6 h 和24 h 組中同時(shí)出現(xiàn)。對(duì)于細(xì)胞成分類別，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的DEGs 富集在細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞部分（Cell part）和膜（Membrane）等條目中。在分子功能類別中，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的DEGs 主要富集在結(jié)合（Binding）、催化活性（Catalytic activity）和分子傳感器活動(dòng)（Molecular transducer activity）等條目中。

圖2 GO 富集分類柱狀圖

KEGG 富集分析顯示，在6 h 和24 h 分別確定了30 個(gè)和8 個(gè)顯著富集的通路（圖3）。在6 h 顯著富集的前3 條通路主要有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、瘧疾（Malaria）和炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease）等。在24 h 顯著富集的前3 條通路包括蛋白酶體（Proteasome）、溶酶體（Lysosome）和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）。在6 h 和24 h 組中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis）兩個(gè)通路。

2.3 趨勢(shì)分析

利用STEM 分析，將20 691 個(gè)DEGs 聚類為8 個(gè)剖面圖，其中0、1、3 和7 這4 個(gè)剖面顯著聚類（P＜0.05），分別包含3 860 個(gè)、4 116 個(gè)、3 463 個(gè)和2 444 個(gè)DEGs（圖4）。通過(guò)KEGG 富集分析從這4 個(gè)剖面中發(fā)現(xiàn)了7 條主要免疫相關(guān)通路，其中產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、Th1 和Th2 細(xì)胞分化、白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移、造血細(xì)胞譜系、Th17 細(xì)胞分化和T 細(xì)胞受體信號(hào)通路6 條通路顯著下調(diào)，僅胞質(zhì)DNA 傳感通路顯著上調(diào)。

圖4 基因趨勢(shì)圖

3 討論與結(jié)論

本研究構(gòu)建了卵形鯧鲹感染無(wú)乳鏈球菌后的脾臟轉(zhuǎn)錄組圖譜。研究結(jié)果顯示，無(wú)乳鏈球菌感染改變了10 014 個(gè)基因的表達(dá)，在感染6 h 處理組中發(fā)現(xiàn)4 749個(gè)DEGs，其中上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)量分別為1 812個(gè)和2 937 個(gè)；在感染24 h 處理組中發(fā)現(xiàn)8 651 個(gè)DEGs，其中上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)量分別為4 418 個(gè)和4 233 個(gè)。通過(guò)STEM 分析發(fā)現(xiàn)，DEGs 被聚類為8 個(gè)趨勢(shì)圖譜，其中0、1、3 和7 四個(gè)圖譜顯著聚集，在這4 張顯著富集的圖譜中發(fā)現(xiàn)了7 條主要與免疫相關(guān)的信號(hào)通路，其中產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、Th1 和Th2 細(xì)胞分化、白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移、造血細(xì)胞譜系、Th17 細(xì)胞分化、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路6 條通路顯著下調(diào)，僅胞質(zhì)DNA 傳感通路顯著上調(diào)。在羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌感染的研究中，早期時(shí)間點(diǎn)的DEGs 被快速誘導(dǎo)，晚期時(shí)間點(diǎn)的DEGs 表達(dá)水平逐漸下降，表明羅非魚(yú)可能具有快速識(shí)別入侵細(xì)菌并通過(guò)激活幾種免疫相關(guān)途徑來(lái)清除細(xì)菌的強(qiáng)大能力[11]。與羅非魚(yú)研究結(jié)果不同，本研究中大多數(shù)基因在早期迅速下調(diào)，在后期逐漸穩(wěn)定，這可能意味著卵形鯧鲹在早期缺乏快速識(shí)別和抵抗細(xì)菌入侵的能力，導(dǎo)致細(xì)菌在早期抑制了大多數(shù)免疫相關(guān)基因和通路，使其無(wú)法發(fā)揮免疫作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步篩選卵形鯧鲹無(wú)乳鏈球菌病的免疫關(guān)鍵基因和通路提供了基礎(chǔ)信息，為卵形鯧鲹疾病預(yù)防和治療提供了新見(jiàn)解。