王燕美

（1.深圳市光明區(qū)科技創(chuàng)新服務(wù)中心，廣東深圳 518000；2.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，廣東深圳 518000）

近年來，對(duì)植物miRNA 的功能研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各方面都發(fā)揮著重要作用[1]。陸地棉因其產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣而成為世界上最主要的棉花栽培種，目前針對(duì)陸地棉miR156 基因家族尚未進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和分析。本研究對(duì)陸地棉miR156 基因家族17 個(gè)成員進(jìn)行了染色體定位、前體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、成熟序列保守性分析、靶基因預(yù)測(cè)及表達(dá)模式分析，為揭示miR156 在陸地棉生長(zhǎng)發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在Plant miRNA Encyclopedia 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載陸地棉（Gossypium hirsutumL.）miR156 家族成員的前體和成熟序列及陸地棉7 個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

1.2 方法

用陸地棉miR156（Gh-miR156）家族成員的前體序列在Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）中BLAST陸地棉基因組序列進(jìn)行染色體定位。用WebLogo（http://weblogo.berkeley.edu/）網(wǎng)站分析Gh-miR156 成熟序列的保守情況。

用The UNAFold Web Server（http://www.unafold.org/）網(wǎng)站中的RNA Folding Form在線分析Gh-miR156家族成員前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，參數(shù)選擇為系統(tǒng)默認(rèn)值。用psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/home）網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)Gh-miR156 家族成員的靶基因，默認(rèn)系統(tǒng)參數(shù)值，設(shè)定罰分1 及以下的基因作為靶基因，罰分越低代表預(yù)測(cè)的靶基因可信度越高。用EXCEL 2010 軟件將轉(zhuǎn)錄組中Gh-miR156 家族成員的RPM（Reads Per Million reads）值取對(duì)數(shù)后做圖，篩選出顯著性差異表達(dá)的miRNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gh-miR156 家族序列分析及染色體分布

Gh-miR156 家族由17 個(gè)基因組成，長(zhǎng)度為20 ～21 bp（見表1）。成熟序列比對(duì)表明，17 個(gè)成員的序列一致性很高，僅在5’端第1 個(gè)、第15 個(gè)和第22個(gè)核苷酸處存在差異（見圖1）。

圖1 Gh-miR156 成熟序列一致性分析

表1 陸地棉miR156 基因家族的成熟序列及其染色體定位

染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，Gh-miR156 家族成員集中分布在A 亞組和D 亞組的4、5、6、7、13 號(hào)這5 條染色體上，其中Gh-miR156a 和Gh-miR156n，Gh-miR156f 和Gh-miR156g，Gh-miR156h 和Gh-miR156i 分別在A 亞組7 號(hào)、D 亞組13 號(hào)、A 亞組13 號(hào)染色體上成簇存在（見表1）。

2.2 Gh-miR156 前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Gh-miR156 家族17 個(gè)成員的前體序列長(zhǎng)度不完全一致，長(zhǎng)度為82 ～210 bp。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，17 個(gè)Gh-miR156 成員都能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，除Gh-miR156p 成熟的miRNA 序列位于均3’端外，其他成員成熟的miRNA 序列均位于5’端。詳見圖2。

圖2 Gh-miR156 家族成員前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3 Gh-miR156 的靶基因預(yù)測(cè)

靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，17 個(gè)Gh-miR156 家族成員共有107 個(gè)靶基因，主要為SQUAMOSA 啟動(dòng)子結(jié)合蛋白樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員，即SPL 轉(zhuǎn)錄因子，且均由一個(gè)以上的Gh-miR156 家族成員靶向調(diào)控。說明Gh-miR156 家族調(diào)控靶基因SPL 的作用網(wǎng)絡(luò)是十分復(fù)雜的，暗示在陸地棉中Gh-miR156 通過調(diào)控此類靶基因參與發(fā)育調(diào)控。

2.4 Gh-miR156 的表達(dá)模式分析

表達(dá)模式分析表明，Gh-miR156 家族成員在陸地棉7 個(gè)組織中存在差異表達(dá)（見圖3）。Gh-miR156m、Gh-miR156o、Gh-miR156p、Gh-miR156q 在莖端中不表達(dá)，但在胚、纖維、葉和根中卻顯著高表達(dá)。Gh-miR156q 在纖維的表達(dá)量顯著高于其他成員，但在花藥的表達(dá)量顯著低于其他成員。以上結(jié)果表明Gh-miR156 家族成員通過動(dòng)態(tài)表達(dá)參與陸地棉不同組織的生長(zhǎng)發(fā)育過程。

圖3 Gh-miR156 家族成員的表達(dá)模式

3 討論與結(jié)論

目前，大量的研究表明miR156 在植物中作為一種正向調(diào)控因子，靶向SPL 轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控芽的分化、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換等過程。QIU 等[2]運(yùn)用生物信息學(xué)方法在陸地棉中首次預(yù)測(cè)到Gh-miR156的靶基因是SPL 轉(zhuǎn)錄因子。直至2012 年，WANG 等[3]使用Solexa 高通量測(cè)序首次在基因組水平上鑒定到Gh-miR156，并證實(shí)了Gh-miR156 的一個(gè)靶基因是SPL9 轉(zhuǎn)錄因子，且在陸地棉早期階段抑制纖維發(fā)育。XUE 等[4]在伸長(zhǎng)期的棉纖維中發(fā)現(xiàn)，Gh-miR156 通過介導(dǎo)其靶基因SPL9 mRNA 的剪切，負(fù)調(diào)控花青素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致纖維細(xì)胞中花青素的合成降低，促進(jìn)過氧化氫的迸發(fā)，使纖維細(xì)胞終止伸長(zhǎng)、轉(zhuǎn)入次生壁合成增厚期的發(fā)育。有趣的是，LIU 等[5]在海島棉中發(fā)現(xiàn)，抑制miR156 的功能將導(dǎo)致成熟纖維的長(zhǎng)度縮短，表明miR156 可以促進(jìn)纖維伸長(zhǎng)。

本研究對(duì)陸地棉中17 個(gè)Gh-miR156 家族成員進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并預(yù)測(cè)了靶基因，為后續(xù)通過實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證Gh-miR156 家族成員在陸地棉生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)控功能提供了理論基礎(chǔ)。