辛燕花，徐丁一，吳雙全，秦萌萌，劉云紅，張建華，張鐵丹，史曉晶*

（1.忻州師范學院生物系，山西 忻州 034000；2.廣州萬物生健康產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 廣州 510642）

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）原產(chǎn)于歐亞大陸，已在俄羅斯、英國、德國、芬蘭、羅馬尼亞和法國等多個國家馴化并大量種植[1]。沙棘（sea buckthorn，SBT）富含生物活性物質(zhì)，其中包括大量的維生素、胡蘿卜素、微量元素、氨基酸[2-5]。沙棘存在多種天然活性化合物，具有抗菌、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、放射防護、適應性和組織再生等多種特性[1，6-9]。因此廣泛應用于放射性損傷、燒傷、口腔炎癥、胃潰瘍的治療[10-13]。沙棘是一種含有豐富油脂的植物，其籽、果皮、果實及果渣中都可以檢測到油脂，沙棘籽成熟后，其油脂含量可高達20%，而干沙棘果中的油脂含量達到約為25%，另外，提取沙棘汁后的果渣也可含有高達20%的油脂。有文獻證實沙棘油包含多種不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素及其衍生物、甾醇以及天然維生素E 等，多數(shù)為人體必需的活性成分，這些活性物質(zhì)具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗?jié)?、抗衰老、抗輻射、增強免疫力等功能[14]。

黑曲霉（Aspergillus niger），隸屬于半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬，是一種常見的大型絲狀真菌。黑曲霉是一種可以直接侵染人體導致系統(tǒng)性疾病的真菌，同時也能夠侵染食品、植物和藥材，改變它們原有的營養(yǎng)成分和藥用成分，導致質(zhì)量下降從而喪失經(jīng)濟價值[15-16]。沙棘及其提取出的沙棘油含有廣泛的生物活性物質(zhì)，具有無毒的特性，受到了研究者們的關注。目前大多數(shù)研究集中在沙棘提取物對細菌及真菌生長的抑制作用上，已經(jīng)取得了一定臨床應用進展。有學者提取了沙棘葉、果實和沙棘籽中的油，并對細菌和一些致病真菌進行了活性檢測，結(jié)果顯示這些沙棘油粗提物可以抑制細菌和致病菌的生長[14，17]，但是目前沙棘油的抗菌機制尚不明確。線粒體是生物體中一個重要的細胞器，承擔著細胞進行有氧呼吸的重要職責[18]。細胞生長發(fā)育所需的能量都要依靠線粒體來提供，除此之外，細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等過程也需要線粒體參與，細胞生長和細胞周期的調(diào)控也會在線粒體中發(fā)生，并可為膜電位調(diào)節(jié)及細胞程序性死亡控制提供場所[19]。因此，線粒體是抗真菌藥物的潛在靶點，任何線粒體功能障礙都會導致細胞死亡[20]。雖然沙棘有許多臨床療效，但以黑曲霉的細胞膜和線粒體為靶位點，探討沙棘油抗真菌的作用機理研究鮮見報道。本項目以沙棘油為研究對象，以黑曲霉的線粒體為靶位點，在細胞水平上研究沙棘油的抗菌機制，對于研究沙棘的抗菌機制及深度開發(fā)沙棘有一定的現(xiàn)實意義。

在本研究中，黑曲霉經(jīng)沙棘油處理后，線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化由透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）進行測定；線粒體功能的評估通過測定膜電位、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平以及與三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA）循環(huán)相關的關鍵酶活性來揭示，以期為沙棘油抗真菌機理的研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）：廣東省微生物菌種保存中心；沙棘油純品：山西省山陽藥業(yè)有限公司。琥珀酸脫氫酶活性測定試劑盒、ATP 酶活性測定試劑盒（Na+-K+，Ca2+-Mg2+）、丙二醛含量測定試劑盒、活性氧含量測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒：上海翊圣生物科技有限公司。瓊脂：福建泉州市泉港化工廠；吐溫-20：西安天茂化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、甲萘醌：上海源葉生物有限公司；氯化鈉（NaCl）、鹽酸（HCl）、硫酸（H2SO4）、乙醇（含量≥95%）：嘉興市天磊化工有限公司；苯甲基黃酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、反-4-[（2-氨基-3.5-二溴芐基）氨基]-環(huán)乙醇鹽酸鹽：上海瑞永生物科技有限公司，2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：上海百舜生物科技有限公司；丙酮：成都市科隆化學品有限公司。2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）：派科生物有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（752N）：上海精密科學儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器（THZ-82A）：金壇市榮華儀器制造有限公司；超聲波細胞粉碎機（JY92-IIDN）：寧波新芝生物科技股份有限公司；臺式低速離心機（LC-4016）：安徽中科中佳科學儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（THZ-98AB）：天津歐諾儀器儀表公司；多功能微孔板檢測儀（SYNERGY HTX）：美國伯騰儀器有限公司北京代表處；超純水器（GWA-UN4-F40）：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，加水定容至1 000 mL，pH自然。PDB 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，加水定容至1 000 mL，pH 自然。

1.3.2 黑曲霉孢子懸浮液的制備

采用無菌NaCl（0.9%）沖洗已活化黑曲霉（約2 cm×2 cm）后，將固體培養(yǎng)基上的菌絲體輕輕刮下，經(jīng)無菌四層紗布過濾，取濾液，得到黑曲霉孢子懸浮液。離心（4 200 r/min，25 min），棄上清液，采用無菌NaCl（0.9%）溶液調(diào)整孢子懸浮液的濃度為1.0×107個孢子/mL。

1.3.3 樣品的制備

在制備好的黑曲霉孢子懸浮液中添加沙棘油溶液（最終濃度為3、6、18 mL/L 和24 mL/L），同時設置對照樣品。28 ℃恒溫振蕩（150 r/min）培養(yǎng)3 d 后，分離得到的菌絲體，采用無菌NaCl（0.9%）洗滌3 次，冷凍，用液氮研磨備用。

1.3.4 黑曲霉線粒體的提取

黑曲霉線粒體的提取參照文獻[17]進行。稱取冷凍樣品2.0 g 于無菌離心管中，用無菌緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L Na2EDTA 和15%葡萄糖，pH7.4）洗滌兩次，懸浮于20.0 mL 上述無菌緩沖液中。將樣品超聲3 min，離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，再次離心2 次（4 200 r/min，25 min），棄上清，收集沉淀，用1.0 mL 無菌緩沖液懸浮線粒體，-20 ℃?zhèn)溆?。所有制備和提取步驟均在4 ℃進行。

1.3.5 黑曲霉線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

收集對照組和最大濃度沙棘油（24 mL/L）處理的細胞中的線粒體，采用2.5%戊二醛固定4 h，觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)。

1.3.6 黑曲霉線粒體酶活性測定

稱取0.2 g 濕菌絲體，蒸餾水洗滌兩次，經(jīng)液氮研磨后，加入1.8 mL 0.9%NaCl，收集上清液得到初酶液，用于酶活性分析。三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatases，ATP）、琥珀酸脫氫酶（succinic dehydrogenase，SDH）和總脫氫酶（total dehydrogenase，THDA）的活性測定參考試劑盒指導。

1.3.7 黑曲霉線粒體丙二醛測定

丙二醛含量的測定同樣在試劑盒指導下進行測定。

1.3.8 黑曲霉線粒體活性氧測定

在已制備好的黑曲霉孢子懸浮液中添加一定的沙棘油溶液（最終濃度為3、6、18 mL/L 和24 mL/L）后，進行培養(yǎng)（25 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)）。12 h 后，離心（4 200 r/min，30 min），收集沉淀，經(jīng)磷酸緩沖液（phos phate buffer solution，PBS）洗滌后重懸于500 μL PBS溶液中。加入DCFH-DA（1 mmol/L）至溶液終濃度為10 μmol/L，充分混勻，30 ℃，60 r/min 孵育4 h（以DMSO 作為溶劑對照）。將菌絲體離心收集后用PBS 沖洗，然后重懸于500 μL 的PBS 中，最后使用多功能微孔板檢測儀進行時間掃描（激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為528 nm）。

1.3.9 黑曲霉線粒體中膜電位變化的測定

膜電位變化的測定根據(jù)試劑盒說明書進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS statistics 21 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘油對黑曲霉線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

采用透射電鏡對經(jīng)過沙棘油處理后的黑曲霉線粒體超微結(jié)構(gòu)進行評估，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，對照組和試驗組的細胞線粒體在超微結(jié)構(gòu)方面存在明顯差異。未經(jīng)過沙棘油處理的細胞（對照組）線粒體內(nèi)外膜清晰，嵴腫脹正常。沙棘油處理后的細胞內(nèi)的線粒體表現(xiàn)出空泡化、異常小泡形成以及線粒體基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，這些現(xiàn)象可以在圖1B和圖1D 中觀察到。試驗結(jié)果顯示，沙棘油能夠引發(fā)黑曲霉細胞線粒體結(jié)構(gòu)上的損害。

圖1 沙棘油對線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of SBT oil on mitochondrial ultrastructure

2.2 沙棘油對黑曲霉線粒體琥珀酸脫氫酶活性的影響

沙棘油對黑曲霉線粒體琥珀酸脫氫酶活性的影響見圖2。

圖2 沙棘油對黑曲霉線粒體琥珀酸脫氫酶活性的影響Fig.2 Effects of SBT oil on SDH activity in Aspergillus niger cells

由圖2 可知，對照組測得黑曲霉線粒體中的SDH酶活性為（470.29±26.30）U/mg 蛋白。經(jīng)不同濃度沙棘油處理后，黑曲霉線粒體中的SDH 活性水平下降，分別為（376.23±25.41）、（340.27±15.06）、（304.26±37.10）U/mg 蛋白質(zhì)和（251.31±23.41）U/mg 蛋白。結(jié)果表明，SDH 酶活性在沙棘油處理后呈劑量依賴性降低。

2.3 沙棘油對ATP 酶活性的影響

沙棘油對ATP 酶活性的影響見圖3。

圖3 沙棘油對ATP 酶活性的影響Fig.3 Effects of SBT oil on ATPase activity

由圖3 可知，對照組中Na+-K+ATP 酶活性為（108.94±1.98）U/mg 蛋白。用3、6、18 mL/L 和24 mL/L沙棘油處理后，Na+-K+ATP 酶活性為分別為（94.41±1.64）、（83.96±4.28）、（61.13±1.64）U/mg 蛋白和（36.71±1.07）U/mg 蛋白。并且對Ca2+-Mg2+ATP 酶活性進行測定，發(fā)現(xiàn)對照組的活性為（109.84±6.77）U/mg 蛋白，經(jīng)不同濃度的沙棘油處理后，Ca2+-Mg2+ATP 酶活性分別為（90.52±6.77）、（67.62±0.60）、（60.92±3.91）U/mg 蛋白和（34.69±3.29）U/mg 蛋白。在沙棘油濃度為24 mL/L處理時，Na+-K+ATP 酶和Ca2+-Mg2+ATP 酶分別比對照降低66.3%和68.4%。結(jié)果表明，ATP 酶活性在沙棘油處理后呈劑量依賴性下降。

2.4 沙棘油對丙二醛含量的影響

沙棘油對丙二醛含量的影響見圖4。

圖4 沙棘油對丙二醛含量的影響Fig.4 Effects of SBT oil on malondialdehyde content

從圖4 中可以看出，黑曲霉線粒體丙二醛含量受沙棘油的影響。對照組測得丙二醛水平為（0.46±0.02）nmol/mg 蛋白。用3、6、18 mL/L 和24 mL/L 沙棘油處理細胞后，線粒體中丙二醛含量顯著升高，分別為（0.63±0.05）、（0.86±0.12）、（1.24±0.22）nmol/mg 蛋白和（4.10±0.30）nmol/mg 蛋白，均顯著高于對照細胞（p＜0.05）。24 mL/L 沙棘油處理的細胞比對照細胞高550.79%。

2.5 沙棘油對活性氧含量的影響

沙棘油對活性氧含量的影響見圖5。

圖5 沙棘油對活性氧含量的影響Fig.5 Effects of SBT oil on ROS levels

由圖5 可知，黑曲霉細胞內(nèi)ROS 積累與沙棘油處理有一定的關系，活性氧的積累與沙棘油的濃度呈正相關。相對于對照組細胞中的標準化水平（100.00%），用3、6、18 mL/L 和24 mL/L 沙棘油處理使ROS 水平分別增加到（158.30±14.65）%、（163.57±12.06）%、（179.35±16.43）%和（276.67±6.96）%，均高于對照細胞（p＜0.05）。

2.6 沙棘油對線粒體膜電位的影響

沙棘油對黑曲霉細胞線粒體膜電位的影響見圖6。

圖6 沙棘油對膜電位變化的影響Fig.6 Effects of SBT oil on mitochondrial membrane potential levels

由圖6 可知，線粒體膜電位在不同濃度沙棘油處理后呈劑量依賴性下降。經(jīng)過12 h 處理后，在整個試驗劑量范圍內(nèi)，膜電位下降顯著，分別為（82.93±2.04）%、（59.41±3.28）%、（57.06±2.12）%和（3.52±2.12）%，均低于對照組（p＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

沙棘油含有豐富的活性物質(zhì)，針對沙棘油的研究已取得了一定的進展，但是沙棘油抗菌活性的機制的探討比較少，有研究者發(fā)現(xiàn)沙棘油可抑制真菌和細菌的生長[21]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)沙棘油可誘導黑曲霉細胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷（圖1）。研究表明，在用茶樹油處理過的灰霉病桿菌中，線粒體的外觀和構(gòu)造會受到破壞，這對于抑制真菌生長起到了積極作用[17]。檸檬醛能夠破壞線粒體的結(jié)構(gòu)，從而導致線粒體的功能發(fā)生改變，這進而限制了指狀假單胞菌的生長[22]。

線粒體內(nèi)的三羧酸循環(huán)需要脫氫酶這一類必不可少的酶[17]。琥珀酸脫氫酶是線粒體內(nèi)膜上催化琥珀酸進行代謝的關鍵酶[23]。已有研究結(jié)果表明，茶樹油會影響琥珀酸脫氫酶活性，而且還能介導抗真菌活性[17]。琥珀酸脫氫酶活性可以很好地反映線粒體功能障礙的程度[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，應用羽苔素E 治療白色念珠菌時，會導致線粒體中的脫氫酶活性降低，從而抑制白色念珠菌的生長[26]。黃曲霉經(jīng)蒔蘿揮發(fā)油處理后，其細胞膜被破壞，導致細胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶的活性下降[27]。本研究發(fā)現(xiàn)琥珀酸脫氫酶活性與沙棘油的濃度正相關（圖2），這表明沙棘油可能引起線粒體結(jié)構(gòu)改變并進一步影響線粒體功能，這與上述提到的研究結(jié)果相似。

線粒體中進行的一系列代謝反應中，三羧酸循環(huán)是較為重要的代謝途徑，為細胞產(chǎn)生能量[28]。Li 等[18]證實灰霉病桿菌細胞內(nèi)的TCA 循環(huán)受到茶樹油抑制，ATP 酶活性顯著降低。在本研究中，加入沙棘油培養(yǎng)黑曲霉時發(fā)現(xiàn)，ATP 酶的活性受到沙棘油的抑制（圖3），從而黑曲霉的生長和存活產(chǎn)生了影響。

丙二醛是用來評估脂質(zhì)過氧化的主要指標，當細胞膜遭受氧化損傷時，丙二醛的含量會上升[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，當青霉菌經(jīng)肉桂醛與檸檬醛聯(lián)合處理后，細胞中的丙二醛含量明顯增加[30]。研究百里酚的抗菌機制時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)百里酚處理的谷鐮刀菌，細胞內(nèi)丙二醛的水平明顯升高[31]。本試驗發(fā)現(xiàn)沙棘油可以提升黑曲霉細胞中丙二醛的積累（圖4）通過影響膜流動性從而對線粒體膜造成破壞。

細胞的線粒體在呼吸變化時會產(chǎn)生ROS，當細胞受損時，ROS 水平會大幅上升[27]。ROS 可以通過破壞細胞核酸、酶和細胞膜，從而對細胞活力產(chǎn)生影響[23]。細胞凋亡和活性氧的堆積有密切的關系，除了會引發(fā)細胞核碎裂、染色體濃縮和磷脂酰絲氨酸外露等細胞器的形態(tài)學變化，活性氧的積累還可能對其他方面的細胞功能產(chǎn)生影響[32]。研究表明，通過使用硼酸鹽處理炭疽菌孢子會引起線粒體受損，同時導致活性氧水平顯著上升[33]。同樣有研究證實，羽苔素E 在抑制白念珠菌生長時，檢測到ROS 含量處于上升水平[26]；蒔蘿揮發(fā)油也可以引起黃曲霉細胞細胞內(nèi)ROS 含量增加，從而導致黃曲霉生長受限[27]；在研究肉桂醛和檸檬醛組合抑制擴展青霉菌時發(fā)現(xiàn)，細胞中的ROS 水平較對照組增加了很多[30]；檸檬醛還可以導致小指藻線粒體的電子呼吸鏈受到破壞，從而改變細胞內(nèi)的ROS 水平[22]。通過使用沙棘油處理，本研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉中ROS 積累增加（圖5），可能是線粒體功能障礙和氧化損傷的原因。

當化合物用于治療真菌感染時，線粒體膜電位的變化是一種明顯的特征，而線粒體膜電位的喪失是細胞凋亡的一種共同表現(xiàn)[34]。研究表明，化合物2，5-雙（4-氨基苯基）呋喃可以使釀酒酵母中的線粒體膜電位顯著下降[35]。許多凋亡系統(tǒng)中，過量的活性氧生成是導致Δψm 去極化的主要誘因[34]。經(jīng)過使用沙棘油處理的黑曲霉細胞中，膜電位的損失與ROS 的積累增加表現(xiàn)出一致的變化趨勢（圖5），同時該處理使得Δψm 值明顯降低（圖6）。黑曲霉會使得細胞內(nèi)的ROS 增加，進而導致線粒體膜內(nèi)孔洞變大，讓線粒體內(nèi)部更加通透，導致去極化、丟失Δψm 并最終導致細胞死亡。

本研究考察了沙棘油介導下的黑曲霉線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化，發(fā)現(xiàn)沙棘油通過破壞線粒體的結(jié)構(gòu)進而損傷線粒體的功能，可以為開發(fā)天然的抗真菌藥物提供一定參考。