辛燕花，徐丁一，吳雙全，秦萌萌，劉云紅，張建華，張鐵丹，史曉晶*

（1.忻州師范學院生物系，山西 忻州 034000；2.廣州萬物生健康產業(yè)有限公司，廣東 廣州 510642）

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）原產于歐亞大陸，已在俄羅斯、英國、德國、芬蘭、羅馬尼亞和法國等多個國家馴化并大量種植[1]。沙棘（sea buckthorn，SBT）富含生物活性物質，其中包括大量的維生素、胡蘿卜素、微量元素、氨基酸[2-5]。沙棘存在多種天然活性化合物，具有抗菌、抗氧化、抗炎、免疫調節(jié)、放射防護、適應性和組織再生等多種特性[1，6-9]。因此廣泛應用于放射性損傷、燒傷、口腔炎癥、胃潰瘍的治療[10-13]。沙棘是一種含有豐富油脂的植物，其籽、果皮、果實及果渣中都可以檢測到油脂，沙棘籽成熟后，其油脂含量可高達20%，而干沙棘果中的油脂含量達到約為25%，另外，提取沙棘汁后的果渣也可含有高達20%的油脂。有文獻證實沙棘油包含多種不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素及其衍生物、甾醇以及天然維生素E 等，多數為人體必需的活性成分，這些活性物質具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗?jié)儭⒖顾ダ?、抗輻射、增強免疫力等功能[14]。

黑曲霉（Aspergillus niger），隸屬于半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬，是一種常見的大型絲狀真菌。黑曲霉是一種可以直接侵染人體導致系統(tǒng)性疾病的真菌，同時也能夠侵染食品、植物和藥材，改變它們原有的營養(yǎng)成分和藥用成分，導致質量下降從而喪失經濟價值[15-16]。沙棘及其提取出的沙棘油含有廣泛的生物活性物質，具有無毒的特性，受到了研究者們的關注。目前大多數研究集中在沙棘提取物對細菌及真菌生長的抑制作用上，已經取得了一定臨床應用進展。有學者提取了沙棘葉、果實和沙棘籽中的油，并對細菌和一些致病真菌進行了活性檢測，結果顯示這些沙棘油粗提物可以抑制細菌和致病菌的生長[14，17]，但是目前沙棘油的抗菌機制尚不明確。線粒體是生物體中一個重要的細胞器，承擔著細胞進行有氧呼吸的重要職責[18]。細胞生長發(fā)育所需的能量都要依靠線粒體來提供，除此之外，細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等過程也需要線粒體參與，細胞生長和細胞周期的調控也會在線粒體中發(fā)生，并可為膜電位調節(jié)及細胞程序性死亡控制提供場所[19]。因此，線粒體是抗真菌藥物的潛在靶點，任何線粒體功能障礙都會導致細胞死亡[20]。雖然沙棘有許多臨床療效，但以黑曲霉的細胞膜和線粒體為靶位點，探討沙棘油抗真菌的作用機理研究鮮見報道。本項目以沙棘油為研究對象，以黑曲霉的線粒體為靶位點，在細胞水平上研究沙棘油的抗菌機制，對于研究沙棘的抗菌機制及深度開發(fā)沙棘有一定的現實意義。

在本研究中，黑曲霉經沙棘油處理后，線粒體的超微結構變化由透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）進行測定；線粒體功能的評估通過測定膜電位、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平以及與三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA）循環(huán)相關的關鍵酶活性來揭示，以期為沙棘油抗真菌機理的研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger）：廣東省微生物菌種保存中心；沙棘油純品：山西省山陽藥業(yè)有限公司。琥珀酸脫氫酶活性測定試劑盒、ATP 酶活性測定試劑盒（Na+-K+，Ca2+-Mg2+）、丙二醛含量測定試劑盒、活性氧含量測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒：上海翊圣生物科技有限公司。瓊脂：福建泉州市泉港化工廠；吐溫-20：西安天茂化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、甲萘醌：上海源葉生物有限公司；氯化鈉（NaCl）、鹽酸（HCl）、硫酸（H2SO4）、乙醇（含量≥95%）：嘉興市天磊化工有限公司；苯甲基黃酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、反-4-[（2-氨基-3.5-二溴芐基）氨基]-環(huán)乙醇鹽酸鹽：上海瑞永生物科技有限公司，2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：上海百舜生物科技有限公司；丙酮：成都市科隆化學品有限公司。2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）：派科生物有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（752N）：上海精密科學儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器（THZ-82A）：金壇市榮華儀器制造有限公司；超聲波細胞粉碎機（JY92-IIDN）：寧波新芝生物科技股份有限公司；臺式低速離心機（LC-4016）：安徽中科中佳科學儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（THZ-98AB）：天津歐諾儀器儀表公司；多功能微孔板檢測儀（SYNERGY HTX）：美國伯騰儀器有限公司北京代表處；超純水器（GWA-UN4-F40）：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，加水定容至1 000 mL，pH自然。PDB 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，加水定容至1 000 mL，pH 自然。

1.3.2 黑曲霉孢子懸浮液的制備

采用無菌NaCl（0.9%）沖洗已活化黑曲霉（約2 cm×2 cm）后，將固體培養(yǎng)基上的菌絲體輕輕刮下，經無菌四層紗布過濾，取濾液，得到黑曲霉孢子懸浮液。離心（4 200 r/min，25 min），棄上清液，采用無菌NaCl（0.9%）溶液調整孢子懸浮液的濃度為1.0×107個孢子/mL。

1.3.3 樣品的制備

在制備好的黑曲霉孢子懸浮液中添加沙棘油溶液（最終濃度為3、6、18 mL/L 和24 mL/L），同時設置對照樣品。28 ℃恒溫振蕩（150 r/min）培養(yǎng)3 d 后，分離得到的菌絲體，采用無菌NaCl（0.9%）洗滌3 次，冷凍，用液氮研磨備用。

1.3.4 黑曲霉線粒體的提取

黑曲霉線粒體的提取參照文獻[17]進行。稱取冷凍樣品2.0 g 于無菌離心管中，用無菌緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L Na2EDTA 和15%葡萄糖，pH7.4）洗滌兩次，懸浮于20.0 mL 上述無菌緩沖液中。將樣品超聲3 min，離心（3 000 r/min，10 min），取上清液，再次離心2 次（4 200 r/min，25 min），棄上清，收集沉淀，用1.0 mL 無菌緩沖液懸浮線粒體，-20 ℃?zhèn)溆谩Ｋ兄苽浜吞崛〔襟E均在4 ℃進行。

1.3.5 黑曲霉線粒體超微結構觀察

收集對照組和最大濃度沙棘油（24 mL/L）處理的細胞中的線粒體，采用2.5%戊二醛固定4 h，觀察線粒體的超微結構。

1.3.6 黑曲霉線粒體酶活性測定

稱取0.2 g 濕菌絲體，蒸餾水洗滌兩次，經液氮研磨后，加入1.8 mL 0.9%NaCl，收集上清液得到初酶液，用于酶活性分析。三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatases，ATP）、琥珀酸脫氫酶（succinic dehydrogenase，SDH）和總脫氫酶（total dehydrogenase，THDA）的活性測定參考試劑盒指導。

1.3.7 黑曲霉線粒體丙二醛測定

丙二醛含量的測定同樣在試劑盒指導下進行測定。

1.3.8 黑曲霉線粒體活性氧測定

在已制備好的黑曲霉孢子懸浮液中添加一定的沙棘油溶液（最終濃度為3、6、18 mL/L 和24 mL/L）后，進行培養(yǎng)（25 ℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)）。12 h 后，離心（4 200 r/min，30 min），收集沉淀，經磷酸緩沖液（phos phate buffer solution，PBS）洗滌后重懸于500 μL PBS溶液中。加入DCFH-DA（1 mmol/L）至溶液終濃度為10 μmol/L，充分混勻，30 ℃，60 r/min 孵育4 h（以DMSO 作為溶劑對照）。將菌絲體離心收集后用PBS 沖洗，然后重懸于500 μL 的PBS 中，最后使用多功能微孔板檢測儀進行時間掃描（激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為528 nm）。

1.3.9 黑曲霉線粒體中膜電位變化的測定

膜電位變化的測定根據試劑盒說明書進行測定。

1.4 數據處理

數據采用SPSS statistics 21 軟件對數據進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 沙棘油對黑曲霉線粒體超微結構的影響

采用透射電鏡對經過沙棘油處理后的黑曲霉線粒體超微結構進行評估，結果如圖1 所示。由圖1 可知，對照組和試驗組的細胞線粒體在超微結構方面存在明顯差異。未經過沙棘油處理的細胞（對照組）線粒體內外膜清晰，嵴腫脹正常。沙棘油處理后的細胞內的線粒體表現出空泡化、異常小泡形成以及線粒體基質結構的破壞，這些現象可以在圖1B和圖1D 中觀察到。試驗結果顯示，沙棘油能夠引發(fā)黑曲霉細胞線粒體結構上的損害。

圖1 沙棘油對線粒體超微結構的影響Fig.1 Effects of SBT oil on mitochondrial ultrastructure

2.2 沙棘油對黑曲霉線粒體琥珀酸脫氫酶活性的影響

沙棘油對黑曲霉線粒體琥珀酸脫氫酶活性的影響見圖2。

圖2 沙棘油對黑曲霉線粒體琥珀酸脫氫酶活性的影響Fig.2 Effects of SBT oil on SDH activity in Aspergillus niger cells

由圖2 可知，對照組測得黑曲霉線粒體中的SDH酶活性為（470.29±26.30）U/mg 蛋白。經不同濃度沙棘油處理后，黑曲霉線粒體中的SDH 活性水平下降，分別為（376.23±25.41）、（340.27±15.06）、（304.26±37.10）U/mg 蛋白質和（251.31±23.41）U/mg 蛋白。結果表明，SDH 酶活性在沙棘油處理后呈劑量依賴性降低。

2.3 沙棘油對ATP 酶活性的影響

沙棘油對ATP 酶活性的影響見圖3。

圖3 沙棘油對ATP 酶活性的影響Fig.3 Effects of SBT oil on ATPase activity

由圖3 可知，對照組中Na+-K+ATP 酶活性為（108.94±1.98）U/mg 蛋白。用3、6、18 mL/L 和24 mL/L沙棘油處理后，Na+-K+ATP 酶活性為分別為（94.41±1.64）、（83.96±4.28）、（61.13±1.64）U/mg 蛋白和（36.71±1.07）U/mg 蛋白。并且對Ca2+-Mg2+ATP 酶活性進行測定，發(fā)現對照組的活性為（109.84±6.77）U/mg 蛋白，經不同濃度的沙棘油處理后，Ca2+-Mg2+ATP 酶活性分別為（90.52±6.77）、（67.62±0.60）、（60.92±3.91）U/mg 蛋白和（34.69±3.29）U/mg 蛋白。在沙棘油濃度為24 mL/L處理時，Na+-K+ATP 酶和Ca2+-Mg2+ATP 酶分別比對照降低66.3%和68.4%。結果表明，ATP 酶活性在沙棘油處理后呈劑量依賴性下降。

2.4 沙棘油對丙二醛含量的影響

沙棘油對丙二醛含量的影響見圖4。

圖4 沙棘油對丙二醛含量的影響Fig.4 Effects of SBT oil on malondialdehyde content

從圖4 中可以看出，黑曲霉線粒體丙二醛含量受沙棘油的影響。對照組測得丙二醛水平為（0.46±0.02）nmol/mg 蛋白。用3、6、18 mL/L 和24 mL/L 沙棘油處理細胞后，線粒體中丙二醛含量顯著升高，分別為（0.63±0.05）、（0.86±0.12）、（1.24±0.22）nmol/mg 蛋白和（4.10±0.30）nmol/mg 蛋白，均顯著高于對照細胞（p＜0.05）。24 mL/L 沙棘油處理的細胞比對照細胞高550.79%。

2.5 沙棘油對活性氧含量的影響

沙棘油對活性氧含量的影響見圖5。

圖5 沙棘油對活性氧含量的影響Fig.5 Effects of SBT oil on ROS levels

由圖5 可知，黑曲霉細胞內ROS 積累與沙棘油處理有一定的關系，活性氧的積累與沙棘油的濃度呈正相關。相對于對照組細胞中的標準化水平（100.00%），用3、6、18 mL/L 和24 mL/L 沙棘油處理使ROS 水平分別增加到（158.30±14.65）%、（163.57±12.06）%、（179.35±16.43）%和（276.67±6.96）%，均高于對照細胞（p＜0.05）。

2.6 沙棘油對線粒體膜電位的影響

沙棘油對黑曲霉細胞線粒體膜電位的影響見圖6。

圖6 沙棘油對膜電位變化的影響Fig.6 Effects of SBT oil on mitochondrial membrane potential levels

由圖6 可知，線粒體膜電位在不同濃度沙棘油處理后呈劑量依賴性下降。經過12 h 處理后，在整個試驗劑量范圍內，膜電位下降顯著，分別為（82.93±2.04）%、（59.41±3.28）%、（57.06±2.12）%和（3.52±2.12）%，均低于對照組（p＜0.05）。

3 討論與結論

沙棘油含有豐富的活性物質，針對沙棘油的研究已取得了一定的進展，但是沙棘油抗菌活性的機制的探討比較少，有研究者發(fā)現沙棘油可抑制真菌和細菌的生長[21]。在本研究中，發(fā)現沙棘油可誘導黑曲霉細胞線粒體結構損傷（圖1）。研究表明，在用茶樹油處理過的灰霉病桿菌中，線粒體的外觀和構造會受到破壞，這對于抑制真菌生長起到了積極作用[17]。檸檬醛能夠破壞線粒體的結構，從而導致線粒體的功能發(fā)生改變，這進而限制了指狀假單胞菌的生長[22]。

線粒體內的三羧酸循環(huán)需要脫氫酶這一類必不可少的酶[17]。琥珀酸脫氫酶是線粒體內膜上催化琥珀酸進行代謝的關鍵酶[23]。已有研究結果表明，茶樹油會影響琥珀酸脫氫酶活性，而且還能介導抗真菌活性[17]。琥珀酸脫氫酶活性可以很好地反映線粒體功能障礙的程度[24-25]。研究發(fā)現，應用羽苔素E 治療白色念珠菌時，會導致線粒體中的脫氫酶活性降低，從而抑制白色念珠菌的生長[26]。黃曲霉經蒔蘿揮發(fā)油處理后，其細胞膜被破壞，導致細胞內琥珀酸脫氫酶的活性下降[27]。本研究發(fā)現琥珀酸脫氫酶活性與沙棘油的濃度正相關（圖2），這表明沙棘油可能引起線粒體結構改變并進一步影響線粒體功能，這與上述提到的研究結果相似。

線粒體中進行的一系列代謝反應中，三羧酸循環(huán)是較為重要的代謝途徑，為細胞產生能量[28]。Li 等[18]證實灰霉病桿菌細胞內的TCA 循環(huán)受到茶樹油抑制，ATP 酶活性顯著降低。在本研究中，加入沙棘油培養(yǎng)黑曲霉時發(fā)現，ATP 酶的活性受到沙棘油的抑制（圖3），從而黑曲霉的生長和存活產生了影響。

丙二醛是用來評估脂質過氧化的主要指標，當細胞膜遭受氧化損傷時，丙二醛的含量會上升[29]。有研究發(fā)現，當青霉菌經肉桂醛與檸檬醛聯合處理后，細胞中的丙二醛含量明顯增加[30]。研究百里酚的抗菌機制時發(fā)現，經百里酚處理的谷鐮刀菌，細胞內丙二醛的水平明顯升高[31]。本試驗發(fā)現沙棘油可以提升黑曲霉細胞中丙二醛的積累（圖4）通過影響膜流動性從而對線粒體膜造成破壞。

細胞的線粒體在呼吸變化時會產生ROS，當細胞受損時，ROS 水平會大幅上升[27]。ROS 可以通過破壞細胞核酸、酶和細胞膜，從而對細胞活力產生影響[23]。細胞凋亡和活性氧的堆積有密切的關系，除了會引發(fā)細胞核碎裂、染色體濃縮和磷脂酰絲氨酸外露等細胞器的形態(tài)學變化，活性氧的積累還可能對其他方面的細胞功能產生影響[32]。研究表明，通過使用硼酸鹽處理炭疽菌孢子會引起線粒體受損，同時導致活性氧水平顯著上升[33]。同樣有研究證實，羽苔素E 在抑制白念珠菌生長時，檢測到ROS 含量處于上升水平[26]；蒔蘿揮發(fā)油也可以引起黃曲霉細胞細胞內ROS 含量增加，從而導致黃曲霉生長受限[27]；在研究肉桂醛和檸檬醛組合抑制擴展青霉菌時發(fā)現，細胞中的ROS 水平較對照組增加了很多[30]；檸檬醛還可以導致小指藻線粒體的電子呼吸鏈受到破壞，從而改變細胞內的ROS 水平[22]。通過使用沙棘油處理，本研究發(fā)現黑曲霉中ROS 積累增加（圖5），可能是線粒體功能障礙和氧化損傷的原因。

當化合物用于治療真菌感染時，線粒體膜電位的變化是一種明顯的特征，而線粒體膜電位的喪失是細胞凋亡的一種共同表現[34]。研究表明，化合物2，5-雙（4-氨基苯基）呋喃可以使釀酒酵母中的線粒體膜電位顯著下降[35]。許多凋亡系統(tǒng)中，過量的活性氧生成是導致Δψm 去極化的主要誘因[34]。經過使用沙棘油處理的黑曲霉細胞中，膜電位的損失與ROS 的積累增加表現出一致的變化趨勢（圖5），同時該處理使得Δψm 值明顯降低（圖6）。黑曲霉會使得細胞內的ROS 增加，進而導致線粒體膜內孔洞變大，讓線粒體內部更加通透，導致去極化、丟失Δψm 并最終導致細胞死亡。

本研究考察了沙棘油介導下的黑曲霉線粒體結構和功能的變化，發(fā)現沙棘油通過破壞線粒體的結構進而損傷線粒體的功能，可以為開發(fā)天然的抗真菌藥物提供一定參考。