譚強來　楊彩娟　曾臻　陳仲巍　許莉　陸馨敏　豐艷　云大和

摘 要：目的：分析對比不同雙歧桿菌液態(tài)厭氧發(fā)酵牡蠣制品的體外抗氧化能力，為牡蠣高值化利用提供科學(xué)依據(jù)。方法：通過雙歧桿菌液態(tài)厭氧發(fā)酵牡蠣獲得相應(yīng)制品；通過測定總抗氧化能力以及DPPH自由基清除、抑制羥自由基、抑制超氧陰離子自由基能力，分析并比較各發(fā)酵制品的抗氧化活性；通過BCA比色法測定各發(fā)酵制品中總肽的含量。結(jié)果：獲得青春、兩歧、嬰兒雙歧桿菌液態(tài)厭氧發(fā)酵牡蠣制品；與空白對照相比，3株雙歧桿菌的發(fā)酵牡蠣制品的總抗氧化能力均有顯著提升，且3組之間也差異顯著：兩歧雙歧桿菌組＞嬰兒雙歧桿菌組＞青春雙歧桿菌組；3組均有一定的自由基抑制清除能力；3組總肽含量相近，各組之間無顯著性差異。結(jié)論：雙歧桿菌液態(tài)厭氧發(fā)酵可提高牡蠣制品的體外抗氧化能力，且具有菌株特異性，為豐富益生菌及海洋食藥資源的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雙歧桿菌；牡蠣；體外抗氧化能力；發(fā)酵

牡蠣是我國重要的傳統(tǒng)藥食兩用資源，也是目前最主要的經(jīng)濟貝類，產(chǎn)量高居世界之首[1]。牡蠣一直以來以傳統(tǒng)加工產(chǎn)品為主，附加值較低[2]。近年來，牡蠣制品逐漸融入現(xiàn)代食品加工高新技術(shù)，進行精深加工和高附加值化利用，其功能肽成為產(chǎn)品研發(fā)的一大熱門方向[3]。陳宏等[4]通過酶解牡蠣肉制備了高抑制活性的DPP-Ⅳ抑制肽。QIAN B等[5]通過酶水解從牡蠣軟組織中提取了抗氧化和抗炎肽組分。目前，功能肽的制備方法主要以酶解法為主，但酶解過程容易產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，且酶若選擇不當(dāng)，產(chǎn)率及活性均較低[6]。微生物發(fā)酵法是通過菌種在生長代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶水解底物，是生物體自帶的復(fù)合酶系，操作便捷、經(jīng)濟且產(chǎn)物往往具有更高的產(chǎn)率和活性[7]。高潔等[8]采用納豆芽孢桿菌發(fā)酵扇貝制備的ACE抑制肽，其活性相比酶解法制備的更高。

雙歧桿菌是人體腸道常駐菌，也是食品工業(yè)中常用的發(fā)酵菌株，具有營養(yǎng)、拮抗、增進風(fēng)味、發(fā)揮益生功能等諸多作用[9]。馮紅霞等[10]利用雙歧桿菌發(fā)酵制作迷迭香扣碗酪，不僅別具風(fēng)味，還兼具良好的抗氧化活性。Nealon N J等[11]證實，長雙歧桿菌發(fā)酵米糠能影響腸道微生物組和代謝組。目前，雙歧桿菌多用于發(fā)酵乳及果蔬粗糧制品，用于發(fā)酵貝類的報道相對較少。因此，本研究以總抗氧化能力、自由基清除抑制能力等為指標(biāo)，分析并對比3株雙歧桿菌液態(tài)厭氧發(fā)酵牡蠣制品的體外抗氧化能力及總肽含量，旨在為牡蠣高值化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）、兩歧雙歧桿菌（B.bifidum）、嬰兒雙歧桿菌（B.infantis），本實驗室保存；牡蠣凍干粉，陜西東禾福；蔗糖，國藥集團；MRS肉湯培養(yǎng)基，北京索萊寶；總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（比色法）、DPPH自由基清除能力試劑盒、羥自由基測試試劑盒、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒（比色法）、總蛋白定量測定試劑盒（BCA比色法），南京建成；其余分析純化學(xué)試劑，西隴科學(xué)。

1.2 儀器與設(shè)備

Anaerobox IV型厭氧培養(yǎng)箱，美國Gene Science；3K15冷凍臺式離心機，德國SIGMA；Quintix5102電子天平，德國Sartorius；Vortex 3漩渦混勻器，德國IKA；GR88DR高壓滅菌鍋，廈門致微；UV-5100B紫外可見分光光度計，上海元析；HWS-24水浴鍋，上海一恒；FE28酸度計，上海梅特勒托利多。

1.3 雙歧桿菌液態(tài)厭氧發(fā)酵牡蠣制品的制備

將青春、兩歧、嬰兒雙歧桿菌的凍存甘油管取出，接種于MRS肉湯，37℃、厭氧培養(yǎng)48 h使其完全活化，再以1%接種量轉(zhuǎn)接，同上條件培養(yǎng)至生長對數(shù)期，制成109 CFU/mL的種子菌懸液，備用。稱取牡蠣凍干粉4.0 g、蔗糖0.4 g、蒸餾水100 g，混勻，調(diào)節(jié)pH至6.2～6.6，配成4%牡蠣培養(yǎng)基，滅菌備用。以10%接種量分別接入青春、兩歧、嬰兒雙歧桿菌的種子菌懸液，37 ℃、厭氧培養(yǎng)24 h。以未加菌液的牡蠣培養(yǎng)基為空白對照。發(fā)酵完成后，8 000 r/min離心10 min，收集的發(fā)酵上清再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，獲得雙歧桿菌液態(tài)厭氧發(fā)酵牡蠣制品。

1.4 總抗氧化能力的測定

按照總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（比色法）說明書的要求，設(shè)置測定管、對照管，分別配制并加入相應(yīng)試劑，漩渦混勻，37 ℃水浴30 min，再加后部分試劑，混勻后25 ℃靜置10 min，設(shè)置520 nm波長，1 cm光徑，以雙蒸水調(diào)零后測定吸光度并按推薦公式計算總抗氧化能力。

1.5 自由基清除抑制能力的測定

1.5.1 DPPH自由基清除能力的測定 按照DPPH自由基清除能力試劑盒說明書的要求，設(shè)置空白管、對照管、測定管，分別配制并加入相應(yīng)試劑，混勻，25℃避光靜置30 min，設(shè)置517 nm波長，1 cm光徑，以無水乙醇調(diào)零后測定吸光度并按推薦公式計算DPPH自由基清除能力。

1.5.2 抑制羥自由基能力的測定 按照羥自由基測試試劑盒說明書的要求，設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對照管、測定管，分別配制并加入相應(yīng)試劑，迅速混勻，37 ℃精確計時水浴60 s，再立即加入顯色劑，混勻，25 ℃靜置20 min，設(shè)置550 nm波長，1 cm光徑，以雙蒸水調(diào)零后測定吸光度并按推薦公式計算抑制羥自由基能力。

1.5.3 抑制超氧陰離子自由基能力的測定 按照抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒說明書的要求，設(shè)置對照管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管，分別配制并加入相應(yīng)試劑，漩渦混勻，37 ℃水浴40 min，再加入顯色劑，混勻，25 ℃靜置10 min，設(shè)置550 nm波長，1 cm光徑，以雙蒸水調(diào)零后測定吸光度

并按推薦公式計算抑制超氧陰離子自由基能力。

1.6 總肽含量的測定

按照總蛋白定量測定試劑盒（BCA比色法）說明書的要求，設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對照管，分別配制并加入相應(yīng)試劑，漩渦混勻，37 ℃孵育30 min，加入終止劑，再次漩渦混勻，靜置5 min，設(shè)置562 nm波長，0.5 cm光徑，以雙蒸水調(diào)零后測定吸光度并按推薦公式計算總肽含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

如無特別標(biāo)注，實驗平行測定3次，采用GraphPad Prism version 5.01進行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 總抗氧化能力的測定

由圖1可知，空白對照組的總抗氧化能力為（0.74± 0.11）U/mL，青春雙歧桿菌組為（3.21±0.14）U/mL，兩歧雙歧桿菌組為（4.93±0.28）U/mL，嬰兒雙歧桿菌組為（3.82±0.15）U/mL。結(jié)果表明，與空白對照相比，青春、兩歧、嬰兒雙歧桿菌液態(tài)厭氧發(fā)酵牡蠣制品的總抗氧化能力均有顯著提升（P＜0.05），而且3個實驗組之間總抗氧化能力也存在顯著性差異（P＜0.05），順序為兩歧雙歧桿菌組＞嬰兒雙歧桿菌組＞青春雙歧桿菌組。因此，在該基礎(chǔ)上繼續(xù)評估其DPPH自由基清除、抑制羥自由基、抑制超氧陰離子自由基能力。

2.2 自由基清除抑制能力的測定

由圖2A可知，青春雙歧桿菌組的DPPH自由基清除能力為（40.75±1.22）μg Trolox/mL，兩歧雙歧桿菌組為（41.89±1.37）μg Trolox/mL，嬰兒雙歧桿菌組為（37.41±1.09）μg Trolox/mL，表明3組均有一定的DPPH自由基清除能力，且兩歧雙歧桿菌組＞青春雙歧桿菌組＞嬰兒雙歧桿菌組，其中兩歧雙歧桿菌組與青春雙歧桿菌組之間無顯著性差異（P＞0.05），但兩者與嬰兒雙歧桿菌組相比，均顯著更高（P＜0.05）。由圖2B可知，青春雙歧桿菌組的抑制羥自由基能力為（35.78±0.09）U/mL，兩歧雙歧桿菌組為（34.98±0.57）U/mL，嬰兒雙歧桿菌組為（35.31±0.82）U/mL，表明3組均有一定的抑制羥自由基能力，且青春雙歧桿菌組＞嬰兒雙歧桿菌組＞兩歧雙歧桿菌組，但3組之間均無顯著性差異（P＞0.05）。由圖2C可知，青春雙歧桿菌組的抑制超氧陰離子自由基能力為（33.73±0.08）U/L，兩歧雙歧桿菌組為（22.93±0.38）U/L，嬰兒雙歧桿菌組為（28.04±0.65）U/L，表明3組均有一定的抑制超氧陰離子自由基能力，順序為青春雙歧桿菌組＞嬰兒雙歧桿菌組＞兩歧雙歧桿菌組，且3組之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 總肽含量的測定

由圖3可知，青春雙歧桿菌組中總肽含量為（4.05±0.18）mg/mL，兩歧雙歧桿菌組為（4.17±0.15）mg/mL，嬰兒雙歧桿菌組為（4.23±0.07）mg/mL，表明3組中總肽含量相近，各組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

利用低附加值但又富含蛋白的加工副產(chǎn)物制備抗氧化肽逐漸受到關(guān)注[12]。潘風(fēng)光等[13]等利用大豆殘存渣粕，制備出較好活性的抗氧化肽。洪燕婷[14]酶解制備了海鱸魚鱗抗氧化肽。研究表明，相比陸源抗氧化肽，海洋源抗氧化肽具有更廣泛的原料來源、獨特的氨基酸序列結(jié)構(gòu)、美好的發(fā)展前景[15]。此外，利用益生菌雙向發(fā)酵中藥可促進體系內(nèi)有效組分析出，并轉(zhuǎn)化出新的活性成分，從而增強、增加藥效[16]。紅曲霉與金釵石斛雙向發(fā)酵可調(diào)節(jié)代謝途徑、提升制品的抗氧化活性[17-18]。李慧星等[20]發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草菌質(zhì)-山藥基質(zhì)雙向發(fā)酵體系具有抗氧化活性增效特點。中國的牡蠣產(chǎn)量高居世界之首，而福建省產(chǎn)量又高居全國之首，資源尤為豐富[1-2]。然而，福建牡蠣產(chǎn)業(yè)目前精深加工不足，產(chǎn)品附加值低[3]。因此，為提高牡蠣原料利用率、提升其藥食同源價值，本研究選用青春、兩歧、嬰兒雙歧桿菌，通過液態(tài)厭氧發(fā)酵增強牡蠣制品的抗氧化活性。結(jié)果表明，牡蠣經(jīng)不同的雙歧桿菌發(fā)酵后，其制品的總抗氧化能力均有顯著提升，為通過益生菌發(fā)酵以高值化利用牡蠣提供了科學(xué)依據(jù)。

發(fā)酵制品活性強弱與所選用的微生物菌株密切相關(guān)，陳應(yīng)運等[20]發(fā)現(xiàn)，納豆芽孢桿菌GL-12用于發(fā)酵蛤蜊比其他菌株具有更好的活性。孫百虎[21]對比了植物乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌4株乳酸菌發(fā)酵桑葚汁的抗氧化活性，結(jié)果表明，以植物乳桿菌的發(fā)酵性能最好、抗氧化活性最高。本研究也發(fā)現(xiàn)，兩歧、嬰兒、青春雙歧桿菌發(fā)酵牡蠣制品的總抗氧化能力存在顯著性差異，以兩歧雙歧桿菌的最高。兩歧雙歧桿菌被認(rèn)為是健康母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸道主導(dǎo)菌，不僅具有較好的細(xì)胞粘附性和免疫調(diào)節(jié)活性，還具有生物轉(zhuǎn)化增效能力[22]。此外，司倩等[23-24]發(fā)現(xiàn)，兩歧雙歧桿菌可用于緩解2型糖尿病和結(jié)腸炎癥狀。因此，兩歧雙歧桿菌或是較適于發(fā)酵牡蠣制備高抗氧化活性制品的益生菌菌株。

值得關(guān)注的是，雖然兩歧雙歧桿菌發(fā)酵牡蠣制品的總抗氧化能力最高，且DPPH自由基清除能力也較強，但抑制羥自由基能力與其他兩株并無顯著差異，其抑制超氧陰離子自由基的能力反而在3組中最弱，這預(yù)示各菌株發(fā)酵或存在不同的代謝轉(zhuǎn)化途徑，從而具有不同的自由基清除抑制機制。李思寧[25]也發(fā)現(xiàn)類似研究結(jié)果，相比植物乳桿菌，動物雙歧桿菌發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率更高，但羥自由基清除率卻更低。此外，經(jīng)初步測定，3組中總肽含量相近，而其抗氧化活性卻差異顯著，表明兩歧雙歧桿菌發(fā)酵牡蠣制品中或存在高活性的抗氧化肽，需要后續(xù)純化、鑒定及驗證[26]。

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Analysis of Antioxidant Capacity in vitro of Oyster Fermented by Bifidobacteria

TAN Qiang-lai1，2，YANG Cai-juan1，ZENG Zhen1，2，CHEN Zhong-wei2，

XU Li1，LU Xin-min1，F(xiàn)ENG Yan1，YUN Da-he1

（1Engineering Research Center of Marine Biopharmaceutical Resource of Fujian Province，Xiamen Medical College，Xiamen 361023，China;

2Engineering Research Center of Natural Cosmeceuticals College of Fujian Province，Xiamen Medical College，Xiamen 361023，China）

Abstract：ObjectiveTo analyze the antioxidant capacity in vitro of oyster fermented by bifidobacteria，provide scientific basis for high-value utilization of oyster.MethodOyster were liquid anaerobic fermented by bifidobacteria;the antioxidant activity of fermented products was analyzed by measuring the total antioxidant capacity，DPPH radical scavenging，hydroxyl radical inhibiting and superoxide anion radical inhibiting capacity.The content of total peptides was determined by BCA colorimetry. ResultOyster fermented by Bifidobacterium adolescens，B. bifidum and B. infantis were obtained.Compared with the blank control，the total antioxidant capacity oyster fermented by the three bifidobacteria strains was significantly improved，and there was also significant difference among the three groups：B.bifidum group＞B.infantis group＞B.adolescens group.The three groups had certain free radical inhibition and scavenging ability.The contents of total peptides in the three groups were similar，and there was no significant difference among them.ConclusionBifidobactera liquid anaerobic fermentation of oyster can improve the antioxidant capacity in vitro with strain specificity，which provides a reference for the application of enriching probiotics and marine food and drug resources.

Keywords： bifidobacteria; oyster; antioxidant capacity in vitro; fermentation

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年項目（項目編號：32200100）；福建省自然科學(xué)基金青創(chuàng)項目（項目編號：2022J05322、2022J05324）；海洋生物醫(yī)藥資源福建省高校工程研究中心（廈門醫(yī)學(xué)院）開放課題（項目編號：XMMC-MBS201901）；廈門醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（項目編號：201912631053）。

作者簡介：譚強來（1988— ），男，博士，副教授，研究方向：益生菌及發(fā)酵食品的營養(yǎng)與安全。

通信作者：曾 臻（1985— ），女，博士，副教授，研究方向：海洋藥學(xué)與海洋生物學(xué)。