葉書含 趙潤元 廖永州

(1 廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,廣東省廣州市 510405;2 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科,廣東省廣州市 510405)

兒童過敏性紫癜是一種小兒常見疾病,是由IgA介導的系統(tǒng)性血管炎,多累及毛細血管、小動靜脈,主要表現(xiàn)為皮膚紫癜,常并發(fā)關節(jié)疼痛、消化道出血及腎炎等。目前兒童過敏性紫癜沒有特異性的治療方案,常使用激素及免疫抑制劑進行治療,但尚無研究表明激素及免疫抑制劑能明顯改善過敏性紫癜患兒的預后[1]。歸脾湯是臨床上治療過敏性紫癜的常用方劑,多項臨床研究表明歸脾湯治療過敏性紫癜的臨床效果良好[2-4]。網(wǎng)絡藥理學是近年來用于中醫(yī)藥方劑機制研究的熱門方法學,其通過構建“藥物-成分-靶點-疾病”多層次網(wǎng)絡,更加全面系統(tǒng)地分析中醫(yī)藥治療疾病的分子機制,與中醫(yī)藥多成分、多靶點的特點相符。本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術,探究歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的作用機制。

1 資料與方法

1.1 歸脾湯活性成分及其作用靶點的篩選 在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索歸脾湯中12味中藥(白術、當歸、茯苓、黃芪、龍眼肉、遠志、酸棗仁、人參、木香、甘草、生姜、大棗)的活性成分,檢索式為“BAIZHU”“DANGGUI”“FULING”“HUANGQI”“LONGYANROU”“YUANZHI”“SUANZAOREN”“RENSHEN”“MUXIANG”“GANCAO”“SHENGJIANG”“DAZAO”,設置篩選條件為匹配分值>20分、P≤0.05,然后使用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫內(nèi)置的分子匹配系統(tǒng)檢索活性成分的作用靶點。

1.2 歸脾湯治療兒童過敏性紫癜相關靶點的獲取 以“anaphylactoid purpura”作為檢索式,在GeneCards?數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中檢索兒童過敏性紫癜相關靶點,檢索時間為2018—2023年。將歸脾湯活性成分的作用靶點與兒童過敏性紫癜相關靶點上傳至OmicShare云平臺(https://www.omicshare.com/tools/)制作韋恩圖,從而獲得交集靶點,即歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的相關靶點。

1.3 歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的“成分-靶點”網(wǎng)絡的構建 根據(jù)歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的相關靶點,找出對應的活性成分,使用Cytoscape 3.5.3軟件構建歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的“成分-靶點”網(wǎng)絡,并使用網(wǎng)絡分析模塊對構建的網(wǎng)絡進行拓撲參數(shù)分析,按照度值由大到小進行排列,選取排名前10的活性成分作為主要活性成分,通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查詢主要活性成分的分子結構式。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建及核心靶點的提取 將歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的相關靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org),設定物種為人類,對相關靶點進行分析獲得相關靶點的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)數(shù)據(jù),將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.5.3軟件制作PPI網(wǎng)絡。使用Cytoscape 3.5.3軟件內(nèi)置的網(wǎng)絡分析模塊對PPI網(wǎng)絡進行拓撲參數(shù)分析,選取度值大于2倍中位數(shù)的靶點作為歸脾湯治療過敏性紫癜的核心靶點。

1.5 核對靶點的富集分析 將核心靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),通過功能分析模塊進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析項目包括 3 個類別,即細胞組分、分子功能、生物過程,依據(jù)富集基因數(shù)目由大到小進行排序,選取前20個條目,并排除與細胞內(nèi)特異性代謝相關的條目,整理后通過OmicShare云平臺的GO功能富集分析模塊進行可視化處理。將KEGG通路富集分析結果依據(jù)富集基因數(shù)目由大到小進行排序,選取前20條通路,并排除寄生蟲及癌癥等相關通路,整理后通過OmicShare云平臺的富集分析高級氣泡功能構建高級氣泡圖。

1.6 分子對接分析 利用歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的“成分-靶點”網(wǎng)絡反向找出核心靶點對應的活性成分,在PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)中獲取核心靶點和活性成分的結構,使用AutoDock Tools 1.5.6軟件進行去水、加氫、分離配體等處理后,使用AutoDock Vina軟件進行分子對接分析,結合能<-5 kal/mol則提示結合有意義。

2 結 果

2.1 歸脾湯的活性成分及其作用靶點 白術的活性成分5個,作用靶點56個;當歸的活性成分73個,作用靶點1 186個;茯苓的活性成分18個,作用靶點515個;黃芪的活性成分17個,作用靶點354個;龍眼肉的活性成分3個,作用靶點301個;遠志的活性成分6個,作用靶點173個;酸棗仁的活性成分23個,作用靶點575個;人參的活性成分109個,作用靶點1 334個;木香的活性成分50個,作用靶點1 192個;甘草的活性成分49個,作用靶點279個;生姜的活性成分95個,作用靶點1 306個;大棗的活性成分33個,作用靶點740個。匯總后刪除重復的活性成分和作用靶點,共獲得活性成分411個,作用靶點2 193個。

2.2 歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的相關靶點 共獲得兒童過敏性紫癜相關靶點715個,與歸脾湯活性成分的作用靶點取交集,共獲得223個交集靶點。見圖1。

圖1 韋恩圖

圖2 歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的“成分-靶點”網(wǎng)絡

2.3 歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的“成分-靶點”網(wǎng)絡 223個交集靶點共對應230個活性成分,使用Cytoscape 3.5.3軟件構建“成分-靶點”網(wǎng)絡,見圖 2。將度值由大到小進行排序,選取排名前10的活性成分作為主要活性成分,分別為樺木醇、β-紫羅蘭酮、(E)9-異丙基-6-甲基-5,9-癸二烯-2-酮、青蒿酮、豆甾醇、肉豆蔻醇、腺苷三磷酸、1-甲基-2-十二烷基-4(1H)-喹諾酮、苯乙酸、棕櫚酸,將活性成分上傳至 PubChem 數(shù)據(jù)庫,獲取分子結構式,見圖3。

圖3 主要活性成分的分子結構式

2.4 PPI網(wǎng)絡及核心靶點 構建歸脾湯治療兒童過敏性紫癜相關靶點的PPI網(wǎng)絡后進行拓撲參數(shù)分析,共篩選出歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的核心靶點35個。見表1。

表1 核心靶點的度值

2.5 核心靶點的GO功能富集分析結果 GO功能富集分析結果顯示,核心靶點涉及6種細胞組分,主要與溶酶體和濾泡的生成有關;涉及7個生物過程,主要與炎癥反應、免疫應答、內(nèi)皮的保護有關;涉及7種分子功能,主要與各種激酶的活性代謝及血小板的活性有關。見圖4和表2。

圖4 GO功能富集分析圈圖

2.6 核心靶點的KEGG通路富集分析結果 依據(jù)富集基因數(shù)目由大到小進行排序,選取前20條通路,并排除與癌癥、寄生蟲等相關的信號通路,最終獲得17條信號通路,包括TNF信號通路、Janus激酶(Janus kinase,JAK)/STAT信號通路、TLR信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/AKT信號通路、叉頭框蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3)信號通路、MAPK信號通路、Erb-B2受體酪氨酸激酶2(Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2,ErbB)信號通路、MTOR信號通路、造血細胞系、NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)信號通路、TGF-β信號通路、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路、B淋巴細胞受體信號通路、白細胞跨內(nèi)皮遷移、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信號通路、細胞凋亡、幽門螺桿菌感染相關的上皮細胞信號通路,見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析高級氣泡圖

2.7 分子對接分析結果 根據(jù)核心靶點的篩選結果和富集分析結果可知,歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的核心靶點及其涉及的信號通路主要集中在炎癥及免疫反應方面。其中TGF-β1是抑制炎癥及免疫反應的重要靶點,且在T淋巴細胞向調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T lymphocyte,Treg)分化過程中起著關鍵作用[5]。因此,本研究選擇TGF-β1進行分子對接分析,利用“成分-靶點”網(wǎng)絡反向找出TGF-β1對應的活性成分并逐一進行分子對接。結果顯示,共有11個活性成分的結合能<-5 kcal/mol,主要包括榆耳三醇、蒼術醇等,見表3和圖6。

表3 TGF-β1的分子對接分析結果

圖6 結合能最高的兩個活性成分的分子對接圖

3 討 論

兒童過敏性紫癜的病理基礎為血管炎,是一種自身免疫性血管炎癥疾病。體液免疫異常是兒童過敏性紫癜發(fā)病的主要機制,其中IgA起著重要作用。細胞免疫異常也是兒童過敏性紫癜的發(fā)病機制之一,特別是T淋巴細胞免疫異常。此外,凝血機制、炎癥因子等因素在其免疫學發(fā)病機制中也起著重要的作用[6-7]。歸脾湯由白術、當歸、茯苓、黃芪、龍眼肉、遠志、酸棗仁、人參、木香、甘草、生姜、大棗組成,活性成分主要包括樺木醇、β-紫羅蘭酮、肉豆蔻醇、豆甾醇、腺苷三磷酸、苯乙酸、棕櫚酸等。其中樺木醇、肉豆蔻醇、腺苷三磷酸可以通過調(diào)節(jié)免疫細胞的凋亡及細胞因子的分泌來發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能的作用[8-10],β-紫羅蘭酮、豆甾醇可以通過調(diào)控PI3K/AKT等信號通路來調(diào)節(jié)炎癥反應[10-12]。

本研究結果顯示,歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的核心靶點主要與免疫反應和炎癥反應有關,包括TGF-β1、IL-6、TNF、IL-17A、FOXP3等。其中TGF-β1是重要的抑炎因子,而TNF是重要的炎癥介質(zhì),二者表達失衡是導致兒童過敏性紫癜發(fā)病的重要因素[13]。此外,上述靶點均與Th17/Treg比例失衡相關[14-15],而Th17/Treg比例失衡引起的免疫功能亢進是導致兒童過敏性紫癜發(fā)生的重要因素[16]。研究顯示,在只有TGF-β1存在的情況下, FOXP3可誘導CD4+T淋巴細胞分化為Treg[17]。IL-17A可促進IL-6分泌,而IL-6又可以通過STAT3促使CD4+T淋巴細胞分化為Th17,并能抑制FOXP3的表達,從而抑制CD4+T淋巴細胞向Treg分化,引起Th17/Treg比例失衡,導致免疫功能失調(diào),引發(fā)兒童過敏性紫癜[18-20]。

本研究的GO功能富集分析結果提示,核心靶點涉及的生物過程主要集中在炎癥反應、免疫應答、內(nèi)皮的保護等方面,涉及的細胞組分主要與溶酶體和濾泡的生成有關,而涉及的分子功能主要與各種激酶的活性代謝和血小板的活性有關,提示歸脾湯可能通過調(diào)控炎癥因子分泌、調(diào)節(jié)血小板功能和保護血管內(nèi)皮細胞來治療兒童過敏性紫癜。KEGG通路富集分析結果顯示,核心靶點涉及的主要信號通路包括TLR信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路、JAK/STAT信號通路、PI3K/AKT 信號通路。TLR/NLR可以激活NF-κB、MAPK等炎癥相關信號通路,刺激B淋巴細胞釋放TNF-α、IL-6等細胞因子,并通過JAK/STAT通路抑制 Treg 的功能[21]。PI3K/AKT信號通路可通過抑制 TGF-β信號通路,抑制CD4+T淋巴細胞向Treg分化[22]。由此可見,歸脾湯可能通過抑制上述信號通路來調(diào)節(jié)免疫平衡及炎癥反應,從而發(fā)揮治療兒童過敏性紫癜的作用。此外,歸脾湯可能具有促進血小板生成及提高血小板活性的作用,能夠保護血管內(nèi)皮細胞,避免血管壁受到損傷,減少變態(tài)反應的發(fā)生,從而抑制兒童過敏性紫癜的發(fā)生[23]。本研究分子對接技術結果顯示,有11個活性成分與TGF-β1的結合活性較好,主要包括榆耳三醇、蒼術醇等,說明歸脾湯主要通過這些活性成分來抑制炎癥反應及促進Treg的分化,從而發(fā)揮治療兒童過敏性紫癜的作用。

綜上所述,歸脾湯治療兒童過敏性紫癜的作用機制可能與其多種活性成分調(diào)控TGF-β1、IL-6、TNF、IL-17A、FOXP3等靶點及TLR、NF-κB、MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT等信號通路,從而調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡及抑制炎癥反應有關。此外,歸脾湯也可能通過調(diào)節(jié)血小板功能和保護血管內(nèi)皮細胞來發(fā)揮治療兒童過敏性紫癜的作用。