李曉莉 蔣智淵

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣西南寧市 530021)

流行病學(xué)調(diào)查顯示,我國18歲以上人群高血壓患病率高達(dá)27.9%[1]。高血壓是導(dǎo)致心室肥厚最重要的病因,也是導(dǎo)致心力衰竭的主要危險(xiǎn)因素。理想的動(dòng)物模型可以為防治高血壓等心血管疾病提供研究基礎(chǔ)。橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型是用以研究壓力負(fù)荷增加所致左心室肥厚的病理生理過程和發(fā)病機(jī)制的重要?jiǎng)游锬Ｐ?。品質(zhì)良好的動(dòng)物模型應(yīng)該具有對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷小、可復(fù)制率高、成模周期短、動(dòng)物存活率高等特點(diǎn)。橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型的構(gòu)建有多種方法,傳統(tǒng)的構(gòu)建方法為經(jīng)胸骨沿前正中線切開暴露主動(dòng)脈弓后進(jìn)行結(jié)扎[2],但該方法容易損傷滋養(yǎng)胸骨的大動(dòng)脈和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺臟。Wang等[3]選擇經(jīng)第2肋間隙作為開胸入路構(gòu)建橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型,該手術(shù)方式雖然能在一定程度上避免因損傷胸骨造成的出血,但是大鼠的肋間隙空間較小,這不僅要求術(shù)者具有熟練的操作技術(shù),而且會(huì)延長手術(shù)時(shí)間,從而增加麻醉和手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生。本研究對已有的橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型的構(gòu)建方法[4]進(jìn)行改良,即橫斷距胸骨正中約0.5 cm處的左側(cè)第3肋,經(jīng)左側(cè)第2、3肋間隙進(jìn)入胸腔暴露主動(dòng)脈弓并進(jìn)行結(jié)扎,并分析此改良方法與經(jīng)胸骨開胸構(gòu)建橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型在成功率和死亡率等方面的差異,從而優(yōu)化構(gòu)建主動(dòng)脈弓縮窄大鼠模型的方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體級健康雄性SD大鼠36只,6～8周齡,體重(200±13)g,購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證:SCXK桂2020-0003)。將大鼠常規(guī)飼養(yǎng)于溫度為(25.0±0.5)℃、相對濕度為50%～60%、12 h明暗交替的環(huán)境,自由飲食。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為實(shí)驗(yàn)組、胸骨切開組、對照組,每組12只。本實(shí)驗(yàn)所有操作步驟均嚴(yán)格遵守中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和護(hù)理的相關(guān)規(guī)定,并獲得廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物福利與倫理審查會(huì)批準(zhǔn)同意(批準(zhǔn)編號:202107005)。

1.2 橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)組采用橫斷距胸骨約0.5 cm的左側(cè)第3肋骨,經(jīng)左側(cè)第2、3肋間隙開胸后結(jié)扎主動(dòng)脈弓的方法構(gòu)建模型,胸骨切開組采用傳統(tǒng)的直接開胸后結(jié)扎主動(dòng)脈弓的方法構(gòu)建模型,對照組的開胸方法與胸骨切開組一致,但不進(jìn)行主動(dòng)脈結(jié)扎縮窄操作。所有大鼠術(shù)前禁食8 h,自由飲水;術(shù)前稱量大鼠體重后,經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg進(jìn)行麻醉,待大鼠充分麻醉后,剃除大鼠左側(cè)肋弓以上的體毛,隨后將大鼠固定在加熱墊上,并打開加熱墊。經(jīng)大鼠口腔插入氣管針[5],確認(rèn)氣管針在大鼠氣道后,連接KW-10型小動(dòng)物呼吸機(jī)(南京卡爾文生物科技有限公司),參數(shù)設(shè)置:潮氣量為3 mL/200 g,呼吸比為1 ∶1,頻率為80次/(min·200 g)。

以碘附消毒實(shí)驗(yàn)組大鼠左側(cè)肋弓以上皮膚,然后剪開劍突至大鼠左鎖骨外側(cè)緣的皮膚,逐層分離大小胸肌,暴露肋骨,剪斷距胸骨正中約0.5 cm處的第3肋骨,隨后在橫斷第3肋的切口處,繼續(xù)往左側(cè)剪開皮膚、肌肉等組織以暴露第2、3肋間隙(圖1A、圖1B),之后用擴(kuò)胸器擴(kuò)開切口,暴露胸腔,分離左、右胸腺,尋找無名動(dòng)脈、左鎖骨下動(dòng)脈和左頸總動(dòng)脈,以確定主動(dòng)脈弓的位置,充分暴露主動(dòng)脈弓后用5號手術(shù)縫線將自制的小于大鼠橫向主動(dòng)脈直徑的縮窄針與大鼠橫向主動(dòng)脈一起結(jié)扎(圖1C),確認(rèn)結(jié)扎完全后拔出自制縮窄針,隨后觀察主動(dòng)脈弓縮窄處凹陷程度,若結(jié)扎處較兩端血管凹陷,即可確認(rèn)結(jié)扎成功。檢查無出血后用生理鹽水濕潤的紗布擦拭胸腺等組織,逐層關(guān)胸。

圖1 經(jīng)左第2、3肋間隙開胸構(gòu)建大鼠橫向主動(dòng)脈縮窄模型

以碘附消毒胸骨切開組大鼠胸部正中線至鎖骨處皮膚,直接切開胸骨,然后用擴(kuò)胸器垂直胸骨擴(kuò)開切口,依照上述方法尋找主動(dòng)脈弓并結(jié)扎縮窄。對照組開胸方法與胸骨切開組一致,但不進(jìn)行后續(xù)的主動(dòng)脈縮窄操作。

待大鼠恢復(fù)自主呼吸后,撤除小動(dòng)物呼吸機(jī)。術(shù)后8 h恢復(fù)進(jìn)食,密切觀察大鼠的基本情況。為了排除手術(shù)操作者熟練程度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,以上操作均由同一名術(shù)者獨(dú)立完成。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大鼠死亡情況及手術(shù)時(shí)間:記錄實(shí)驗(yàn)期間大鼠的死亡情況。比較實(shí)驗(yàn)組與胸骨切開組的大鼠存活率及手術(shù)時(shí)間。

1.3.2 一般情況:術(shù)后每日觀察各組大鼠的手術(shù)傷口有無滲血、有無膿液滲出、是否有紅腫等表現(xiàn),以及進(jìn)食和排泄情況、體重增減情況、毛發(fā)光澤度,并通過觀察大鼠嘴唇、肢體、尾巴等部位的皮膚黏膜是否紅潤來判斷大鼠的循環(huán)情況。

1.3.3 心臟超聲指標(biāo):術(shù)后4周采用心臟超聲儀(Esaote公司,型號:EPX-3500HD)測量各組大鼠的心臟相關(guān)指標(biāo)。通過腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)對大鼠進(jìn)行麻醉,充分麻醉后對大鼠胸部進(jìn)行剃毛備皮,將其平放在操作臺(tái)的保溫墊上,同時(shí)使用B型和M型超聲儀在胸骨旁左室長軸切面、二尖瓣腱索水平進(jìn)行測量。測量指標(biāo)包括舒張末期室間隔厚度(interventricular septum thickness at end diastole,IVSTd)、舒張末期左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastole,LVPWTd)、舒張末期和收縮末期左室容積,然后計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF),LVEF=(左室舒張期容積-左室收縮期容積)/左室舒張期容積×100%。各指標(biāo)均測量3個(gè)連續(xù)的心動(dòng)周期,取均值。

1.3.4 心臟組織學(xué)指標(biāo):完成心臟超聲檢查后,通過腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)再次麻醉3組大鼠,剪開肋骨,用止血鉗夾住主動(dòng)脈并快速剪下心臟置于生理鹽水,然后用50 mL注射器往主動(dòng)脈注入生理鹽水以沖洗干凈余下的血液。取部分心臟標(biāo)本,以4%多聚甲醛固定。取材完成后,取出4%多聚甲醛中的心肌組織并置于10%中性甲醛溶液固定2 d,經(jīng)過蒸餾水沖洗、脫水等步驟后進(jìn)行石蠟包埋切片,同時(shí)制備兩份石蠟切片,一份用于HE染色,另一份用于Masson染色,最后在相應(yīng)倍數(shù)的光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)組12只大鼠中,1只在術(shù)后2 d因急性左心衰竭而死亡,最終共11只大鼠存活,存活率為91.7%。胸骨切開組12只大鼠中,2只因術(shù)中大出血而死亡,2只于術(shù)后3 d因急性心力衰竭而死亡,2只于術(shù)后7 d后因可疑肺水腫而死亡,最終共有6只大鼠存活,存活率為50.0%。實(shí)驗(yàn)組的存活率高于胸骨切開組(χ2=5.042,P=0.034)。對照組12只大鼠中,2只因術(shù)中大出血而死亡,1只因擴(kuò)胸器壓迫損傷肺造成氣胸而死亡,最終共9只大鼠存活,存活率為75.0%。統(tǒng)計(jì)存活大鼠的手術(shù)時(shí)間,實(shí)驗(yàn)組的手術(shù)時(shí)間為(23.48±2.53)min,短于胸骨切開組的(36.03±3.59 )min(t=9.602,P<0.001)。

3組存活大鼠術(shù)后皆無術(shù)野滲血、傷口紅腫、化膿和滲液等情況,并且每日的排泄和進(jìn)食量正常。大鼠的體重在術(shù)后前兩周增長最快,平均10 g/周。同時(shí),大鼠的四肢、嘴唇和尾巴均保持紅潤,軀體活動(dòng)也無明顯異常,精神良好。

2.2 3組大鼠心臟超聲指標(biāo)的比較 與對照組比較,實(shí)驗(yàn)組和胸骨切開組大鼠的IVSTd和LVPWTd均增厚(均P<0.05),但實(shí)驗(yàn)組和胸骨切開組上述兩個(gè)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。3組大鼠的LVEF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖2。

表1 3組大鼠心臟超聲指標(biāo)的比較(x±s)

圖2 3組大鼠典型的經(jīng)胸骨旁左室長軸切面超聲影像

2.3 3組大鼠心肌組織學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示:對照組大鼠心肌組織未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤,心肌細(xì)胞形態(tài)、大小基本一致,細(xì)胞邊界清晰;實(shí)驗(yàn)組和胸骨切開組大鼠心肌組織有較多炎癥細(xì)胞浸潤,心肌細(xì)胞形態(tài)各異,細(xì)胞邊緣分界不明顯,部分細(xì)胞體積變大、水腫。Masson染色結(jié)果顯示:對照組大鼠心肌細(xì)胞排列有序,少見膠原纖維組織填充;而實(shí)驗(yàn)組和胸骨切開組大鼠心肌肌節(jié)排列紊亂,心肌細(xì)胞間有較多膠原纖維組織填充。見圖3。

圖3 3組大鼠心肌組織學(xué)變化

3 討 論

動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ),理想的動(dòng)物模型不僅要考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理,盡量減少手術(shù)操作對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害,而且還要考慮是否能很好地模擬疾病的發(fā)生和發(fā)展。橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型是一種通過縮窄動(dòng)物主動(dòng)脈弓管徑來增加大鼠心臟射血后負(fù)荷,利用壓力負(fù)荷改變心肌形態(tài)和功能,最終達(dá)到模擬人類高血壓、心力衰竭等疾病狀態(tài)的動(dòng)物模型,該模型對研究心血管疾病具有重要的作用。既往以主動(dòng)脈弓縮窄為主的橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型,多以大鼠正中線即胸骨作為手術(shù)入路[6],此方法雖然可以很好地顯露大鼠的心臟和主動(dòng)脈,但胸骨作為大鼠較大的軀干骨,具有一定數(shù)量的滋養(yǎng)動(dòng)脈,手術(shù)過程中如操作稍有不當(dāng)可損傷動(dòng)脈而造成出血。本研究中,采用胸骨切開入路的胸骨切開組和對照組,皆有2只大鼠因術(shù)中出現(xiàn)大出血而死亡。有研究表明,經(jīng)肋間隙入路逐層分離暴露手術(shù)視野的方法可在一定程度上減少術(shù)中出血量,改善大鼠的預(yù)后[7]。但是即使使用擴(kuò)胸器擴(kuò)張大鼠肋間隙,操作空間仍較為有限,不利于隨后分離及結(jié)扎主動(dòng)脈的精細(xì)操作,這有可能造成手術(shù)時(shí)間延長,以及麻醉和手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率的增加。此外,使用擴(kuò)胸器強(qiáng)行擴(kuò)張容易引起肋骨變形,不利于后期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的恢復(fù)。

研究表明,大鼠升主動(dòng)脈經(jīng)心臟發(fā)生后,在相當(dāng)于第四胸椎水平穿出心包,形成主動(dòng)脈弓,并向左向上走行,在相當(dāng)于第2胸椎水平達(dá)到最高位置,并逐漸向足側(cè)走行,形成降主動(dòng)脈,隨后在主動(dòng)脈弓起點(diǎn)約10 mm處發(fā)出無名動(dòng)脈,在主動(dòng)脈弓最高位置后發(fā)出左頸總動(dòng)脈和左鎖骨下動(dòng)脈[8]?；诖笫蟮闹鲃?dòng)脈解剖特點(diǎn),我們認(rèn)為在近胸骨處,左側(cè)第2、3肋間隙較易于暴露和結(jié)扎主動(dòng)脈弓。因此,我們先橫斷距離大鼠胸骨約0.5 cm的左側(cè)第3肋,再從左側(cè)第2、3肋間隙進(jìn)入,利用擴(kuò)胸器擴(kuò)開胸腔后進(jìn)行后續(xù)操作。采用此方法開胸能夠在擴(kuò)開肋骨并撥開左右兩片胸腺后快速找到主動(dòng)脈弓,在較好的手術(shù)視野中進(jìn)行結(jié)扎,而且此方法無須過多翻動(dòng)大鼠胸腔內(nèi)臟器,從而減少對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害。本研究結(jié)果顯示,采用此方法進(jìn)行建模的實(shí)驗(yàn)組,無論是手術(shù)存活率還是手術(shù)時(shí)間,均優(yōu)于胸骨切開組(均P<0.05)。此外,實(shí)驗(yàn)組未出現(xiàn)術(shù)中大出血的情況。上述結(jié)果表明,改良的開胸結(jié)扎主動(dòng)脈弓方法,不僅可以避免經(jīng)胸骨切開結(jié)扎主動(dòng)脈弓引發(fā)的大出血,還可以提高手術(shù)的安全性和縮短手術(shù)時(shí)間。

為了驗(yàn)證改良方法構(gòu)建橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型的有效性,本研究比較了3組大鼠的心臟超聲指標(biāo)及心臟組織學(xué)變化。結(jié)果顯示,與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組和胸骨切開組大鼠均出現(xiàn)了明顯的左心室肥厚、心肌炎癥和心肌纖維化,而實(shí)驗(yàn)組和經(jīng)胸骨切開組大鼠的心臟超聲指標(biāo)及心臟組織學(xué)變化均無明顯差異。上述結(jié)果表明改良與傳統(tǒng)的開胸結(jié)扎主動(dòng)脈弓方法均能有效構(gòu)建橫向主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的壓力超負(fù)荷大鼠心肌肥厚模型。

然而,本研究改良的建模方法也存在不足:(1)本研究未能建立不橫斷肋骨而直接經(jīng)左側(cè)第2、3肋間隙開胸結(jié)扎主動(dòng)脈弓的對照組,只是推測改良方法可能優(yōu)于經(jīng)肋間隙開胸法,這有待今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。(2)是否有比本研究改良方法更優(yōu)的建模方式,還有待進(jìn)一步探索。有研究表明,相比于經(jīng)胸腔入路的建模方法,腹主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠模型具有手術(shù)安全性高、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成活率較高等優(yōu)點(diǎn)[9],但是腹主動(dòng)脈縮窄的成模周期明顯延長[10],故本研究并未采用此種方法構(gòu)建壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠模型。此外,近期有研究報(bào)告,與傳統(tǒng)方法相比,經(jīng)第2肋水平切開胸骨并結(jié)扎小鼠主動(dòng)脈弓的創(chuàng)傷性更小,手術(shù)時(shí)間更短[11]。但是,在大鼠上建模是否也可獲得同樣的效果,且是否優(yōu)于本研究的建模方法,都有待于今后的研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述,與傳統(tǒng)的經(jīng)胸骨正中開胸并結(jié)扎主動(dòng)脈弓方法比較,通過橫斷距胸骨正中約0.5 cm處的第3肋,經(jīng)左側(cè)第2、3肋間隙開胸后結(jié)扎主動(dòng)脈弓的方法構(gòu)建橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型,建模成功率高,手術(shù)時(shí)間明顯縮短。上述方法可以為科研工作者構(gòu)建橫向主動(dòng)脈縮窄大鼠模型提供參考。