劉 婷 錢雅琴 宋若會(huì) 朱 玲

(1 合肥市第八人民醫(yī)院耳鼻喉科,安徽省合肥市 238000;2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科,安徽省合肥市 230000)

喉癌是臨床上常見的一種原發(fā)于喉部的惡性腫瘤,以鱗狀細(xì)胞癌最為常見[1]。目前研究認(rèn)為,吸煙、飲酒、環(huán)境污染、病毒感染、放射線、性激素代謝紊亂、基因突變等是喉癌的致病因素[2]。手術(shù)、新輔助放化療等是治療喉癌的主要方法,其可以在一定程度上改善患者的病情[3],但中晚期喉癌患者治療后的預(yù)后仍較差,病死率高[4]。因此,尋找一種能夠早期診斷并預(yù)測(cè)喉癌患者預(yù)后的指標(biāo),對(duì)臨床具有積極意義。細(xì)胞凋亡抑制蛋白1(cell-inhibitor of apoptosis protein 1,c-IAP1)是一種細(xì)胞凋亡抑制因子,主要存在于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中,可通過抑制Caspase-3等蛋白酶的活性來抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖[5]。研究發(fā)現(xiàn),c-IAP1參與了多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6],但c-IAP1對(duì)喉癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值如何,目前鮮見報(bào)告。為此,本研究通過檢測(cè)喉癌患者癌組織與癌旁組織中c-IAP1的表達(dá)情況,分析c-IAP1表達(dá)水平與喉癌病理分級(jí)的關(guān)系,探討c-IAP1對(duì)喉癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值,為臨床研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2014年1月至2015年12月合肥市第八人民醫(yī)院收治的60例喉癌患者的臨床資料。其中男性54例、女性6例;年齡41～70(65.87±10.28)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)已被確診為喉癌,經(jīng)病理檢查證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌,分化程度明確;(2)臨床病歷資料信息完整;(3)喉癌組織與癌旁組織標(biāo)本保存完好。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病;(2)合并心、肝、腎等重要器官疾病;(3)失訪;(4)術(shù)前接受過放療、化療、靶向治療或其他抗腫瘤藥物治療。

1.2 方法

1.2.1 收集資料:收集所有研究對(duì)象的臨床資料及術(shù)后5年的隨訪記錄,包括性別、年齡、吸煙指數(shù)(每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))、腫瘤大小、腫瘤部位、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、T分期、TNM分期及預(yù)后情況(將隨訪終點(diǎn)事件為復(fù)發(fā)或死亡判定為預(yù)后不良,無復(fù)發(fā)或死亡判定為預(yù)后良好)。

1.2.2 c-IAP1表達(dá)情況檢測(cè):從病理科獲取患者術(shù)中喉癌組織與距離癌組織5 cm的癌旁組織標(biāo)本,常規(guī)石蠟包埋組織后切片,采用免疫組織化學(xué)的ABC法檢測(cè)c-IAP1的表達(dá)情況。具體步驟如下:將固定好的切片放在切片架上并置于46 ℃烤片機(jī)中,20 min后取出,再將切片依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ中,各10 min,取出后再依次置于100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ、95%酒精、80%酒精、70%酒精中,各2 min,取出后放入蒸餾水中2 min,并使用0.01 mol/L的PBS沖洗3次,2 min/次。將脫蠟、水化后的載玻片放入3%的過氧化氫中,室溫條件下孵育10 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,取出載玻片后使用0.01 mol/L的PBS沖洗3次,2 min/次。進(jìn)行抗原熱修復(fù)后使用0.01 mol/L的PBS沖洗3次,2 min/次。然后在切片上滴加按1 ∶100比例稀釋的兔抗人c-IAP1,置于4 ℃冰箱孵育過夜,取出后再置于37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱復(fù)溫45 min,取出后用0.01 mol/L的PBS沖洗3次,2 min/次。再分別滴加增強(qiáng)劑、二抗、二氨基聯(lián)苯胺顯色后,置于顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。在400倍光學(xué)顯微鏡下,c-IAP1陽性表達(dá)的細(xì)胞呈棕黃色,陽性反應(yīng)顆粒主要位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中。隨機(jī)選擇8個(gè)視野,每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。根據(jù)觀察結(jié)果對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分,其中陽性細(xì)胞數(shù)為0時(shí)不計(jì)分,陽性細(xì)胞數(shù)占比≤25%記1分,占比為26%～50%記2分,占比為51%～75%記3分,占比>75%記4分。同時(shí)對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià),無著色記0分,淺黃色記1分,棕黃色記2分,棕褐色記3分。將陽性細(xì)胞評(píng)分與細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分相加作為c-IAP1表達(dá)情況的判斷標(biāo)準(zhǔn),其中0～3分為低表達(dá),4～7分為高表達(dá)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析;采用多因素COX回歸模型分析喉癌患者預(yù)后的影響因素。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 喉癌組織與癌旁組織中c-IAP1表達(dá)情況的比較 喉癌組織中c-IAP1高表達(dá)率為73.33%(44/60),低表達(dá)率為26.67%(16/60)。癌旁組織中c-IAP1高表達(dá)率為6.67%(4/60), 低表達(dá)率為93.33%(56/60)。喉癌組織中c-IAP1高表達(dá)率高于癌旁組織(χ2=50.562,P<0.001)。

2.2 不同預(yù)后患者喉癌組織中c-IAP1表達(dá)情況的比較 至隨訪終點(diǎn),60例患者中有26例(43.33%)復(fù)發(fā)、16例(26.67%%)死亡,且死亡患者在隨訪終點(diǎn)前均經(jīng)相關(guān)檢查證實(shí)為腫瘤相關(guān)性死亡,最終本組病例中,預(yù)后不良42例(70.00%,42/60),預(yù)后良好18例(30.00%,18/60)。復(fù)發(fā)患者中c-IAP1高表達(dá)率為84.62%(22/26),c-IAP1低表達(dá)率為15.38%(4/26);死亡患者中c-IAP1高表達(dá)率為100%(16/16),c-IAP1低表達(dá)率為0。預(yù)后不良患者喉癌組織c-IAP1高表達(dá)率高于預(yù)后良好患者(χ2=21.039,P<0.001)。見表1。

表1 不同預(yù)后患者喉癌組織中c-IAP1表達(dá)情況的比較[n(%)]

2.3 影響喉癌患者預(yù)后的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示,不同腫瘤大小、腫瘤部位、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期、吸煙指數(shù)的喉癌患者預(yù)后不良發(fā)生率比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);不同性別、年齡的喉癌患者預(yù)后不良發(fā)生率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表2。

表2 影響喉癌患者預(yù)后的單因素分析[n(%)]

2.4 影響喉癌患者預(yù)后的多因素分析 以患者預(yù)后情況為因變量(預(yù)后良好=0,預(yù)后不良=1),以單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量及喉癌組織c-IAP1表達(dá)情況為自變量,進(jìn)行多因素COX回歸分析,賦值情況見表3。結(jié)果顯示,喉癌組織c-IAP1表達(dá)情況、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期是喉癌患者預(yù)后的影響因素(均P<0.05),見表4。

表3 自變量的賦值情況

表4 影響喉癌患者預(yù)后的多因素COX回歸分析

3 討 論

喉癌是臨床常見的惡性腫瘤之一,主要以鱗狀細(xì)胞癌為主,患者常伴有聲嘶、呼吸困難、吞咽困難等臨床癥狀,嚴(yán)重影響其健康與生活質(zhì)量。目前,治療喉癌的方式主要有手術(shù)、放化療、分子靶向治療等[8-9],其中手術(shù)切除是首選方式之一,在盡可能保留喉功能的情況下徹底切除腫瘤組織。但腫瘤過大、機(jī)體情況較差、術(shù)后不配合放化療的患者,局部復(fù)發(fā)率較高[10-13]。尋找可以早期診斷、評(píng)估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)提高喉癌患者療效,改善預(yù)后有重要意義。

正常的細(xì)胞凋亡是機(jī)體消除有害細(xì)胞[14]、防止細(xì)胞過度增殖[15]的一種生理過程,而細(xì)胞凋亡的調(diào)控是機(jī)體維持正常細(xì)胞更新與增殖的關(guān)鍵[16]。c-IAP1是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員之一,是一種具有抗凋亡活性的蛋白質(zhì),主要通過抑制Caspase活性及參與調(diào)節(jié)核因子κB的作用來抑制細(xì)胞凋亡[17]。已有研究表明,c-IAP1在肝癌組織、宮頸癌組織等組織中均呈高表達(dá),且c-IAP1高表達(dá)與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學(xué)分級(jí)等因素密切相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示,喉癌組織中c-IAP1高表達(dá)率高于癌旁組織,提示c-IAP1可能參與了喉癌的發(fā)生。還有研究表明,喉癌組織中c-IAP1陽性表達(dá)率高于癌旁組織,且其表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[19],本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),預(yù)后不良患者喉癌組織中c-IAP1高表達(dá)率高于預(yù)后良好患者(P<0.05),說明c-IAP1參與了喉癌的發(fā)生與進(jìn)展,且可能與患者預(yù)后有關(guān)。

死亡受體通路、線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是細(xì)胞凋亡的三條通路,三者關(guān)系密切[20],并與p53、B細(xì)胞淋巴瘤2家族、凋亡抑制蛋白家族、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),精細(xì)調(diào)控細(xì)胞凋亡通路;而c-IAP1可通過抑制Caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制上述三條凋亡通路的表達(dá)[21]。當(dāng)c-IAP1在腫瘤組織中呈高表達(dá)時(shí),腫瘤細(xì)胞凋亡被抑制,細(xì)胞的增殖與凋亡平衡被打破,腫瘤細(xì)胞壽命延長、數(shù)量增加、生長迅速,導(dǎo)致預(yù)后不良。本研究的COX回歸分析結(jié)果也顯示,c-IAP1表達(dá)情況、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期是影響喉癌患者預(yù)后的影響因素(均P<0.05)。提示c-IAP1表達(dá)情況或可用于喉癌患者的預(yù)后評(píng)估。

綜上所述,喉癌患者癌組織中c-IAP1陽性表達(dá)率升高,喉癌組織c-IAP1表達(dá)情況、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期是影響喉癌患者預(yù)后的影響因素。檢測(cè)喉癌組織中c-IAP1的表達(dá)情況對(duì)評(píng)估喉癌患者預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。