酈文捷 潘永良 黃曉敏 顧 俊

(1 南通大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科、南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇省南通市 226001;2 南通大學(xué)附屬丹陽醫(yī)院老年科,江蘇省丹陽市 212300)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種以肺泡滲透性增加和持續(xù)嚴(yán)重低氧血癥為特征的危重疾病,是急診ICU(emergency ICU,EICU)患者死亡的主要原因之一[1]。盡管關(guān)于ARDS發(fā)病機(jī)制和治療手段的研究已取得重大進(jìn)展,但ARDS的原發(fā)疾病多樣、致病環(huán)節(jié)多、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,病死率仍高達(dá)40%～50%[2]。因此,早期評估ARDS患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后意義重大。研究表明,炎癥反應(yīng)在ARDS發(fā)生與發(fā)展過程中扮演重要角色[3]。miRNA能通過剪切mRNA和抑制蛋白表達(dá)調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄,在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。研究表明,miR-146b能通過抑制髓樣分化因子88/核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路,減輕肺炎患兒的炎癥程度[5]。細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)-1是一種跨膜糖蛋白,能促進(jìn)組織中受炎癥影響的效應(yīng)器-靶細(xì)胞的相互作用[6]。本研究探討ARDS患者血清miR-146b、ICAM-1水平與其疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2021年5月南通大學(xué)附屬丹陽醫(yī)院收治的186例ARDS患者作為研究對象。男性131例、女性55例,年齡28～76(52.68±4.47)歲,體質(zhì)指數(shù)18～26(22.44±2.59)kg/m2;合并癥:高血壓34例、糖尿病18例、冠心病8例;病因:手術(shù)7例、肺挫傷13例、多發(fā)傷22例、重癥肺炎18例、嚴(yán)重感染126例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南(2006)》[7]中的ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)年齡18～80歲;(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并心源性肺水腫、慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核、肺心病、肺栓塞等疾病者;(2)合并血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病者;(3)心、肝、腎等重要臟器損害者;(4)妊娠及哺乳期婦女;(5)合并惡性腫瘤者。本研究已經(jīng)過南通大學(xué)附屬丹陽醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 收集資料:收集患者基線資料,包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、合并癥、病因、機(jī)械通氣時間、EICU入住時間、入院時心率。

1.2.2 生化指標(biāo)和ICAM-1的檢測:(1)于患者入院后6 h內(nèi),使用Radiometrie公司ABL80型動脈血?dú)夥治鰞x測定PaO2水平,計(jì)算氧合指數(shù),氧合指數(shù)=PaO2/吸氧濃度;使用Philips公司M3012AC10型脈搏指示連續(xù)心排血量監(jiān)測儀測量血管外肺水指數(shù)(extravascular lung water index,EVLWI)。(2)采集患者入院時靜脈血3 mL,以3 000 r/min離心10 min (離心半徑為8 cm),取上清液備用。取部分上清液,采用ELISA測定血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10、ICAM-1水平,所有操作嚴(yán)格按照上海梵態(tài)生物科技有限公司提供的試劑盒(批號:FT-P32761R、FT-P31372R、FT-P31375R、FT-P37980R)說明書進(jìn)行。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-146b表達(dá)水平:取另一部分上清液,采用TRIzol試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,批號:R401-01)提取血清總RNA,用超微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度,用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京麥瑞博生物科技有限公司,批號:RR001A-1)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。miR-146b正向引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCA-3′,反向引物序列為5′-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′;內(nèi)參U6正向引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′,反向引物序列為5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3′。反應(yīng)體系(共20 μL):1 μL cDNA,2 μL正向引物,2 μL反向引物,10 μL SYBR Green Master Mix,5 μL ddH2O。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性15 s,62℃ 退火及延伸40 s,共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-146b相對表達(dá)水平。

1.3 ARDS嚴(yán)重程度和預(yù)后評估 于患者入院時,根據(jù)2012年柏林標(biāo)準(zhǔn)[8]評估其疾病嚴(yán)重程度:輕度指氧合指數(shù)>200 mmHg,中度指氧合指數(shù)處于100～200 mmHg,重度指氧合指數(shù)≤100 mmHg。根據(jù)疾病嚴(yán)重程度將患者分為輕度組(n=45)、中度組(n=58)、重度組(n=83)?；颊呷朐汉蟾鶕?jù)《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南(2006)》[7]進(jìn)行治療,根據(jù)治療28 d后的預(yù)后情況將其分為死亡組(n=52)和存活組(n=134)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法;偏態(tài)分布的計(jì)量資料以[M(P25,P75)]表示,組間比較采用秩和檢驗(yàn);采用Pearson相關(guān)分析法分析指標(biāo)間的相關(guān)性;采用多因素Logistic回歸模型分析ARDS患者預(yù)后不良的影響因素;采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清miR-146b、ICAM-1水平對ARDS患者預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同疾病嚴(yán)重程度患者的基線資料和血清miR-146b、ICAM-1、炎癥因子水平的比較 3組患者的性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、合并癥、病因、入院時心率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。輕度組、中度組、重度組患者的機(jī)械通氣時間、EICU入住時間、EVLWI和血清ICAM-1、TNF-α、IL-6水平均依次升高,氧合指數(shù)和血清miR-146b、IL-10水平均依次降低(均P<0.05)。見表1。

表1 不同疾病嚴(yán)重程度患者基線資料和血清miR-146b、ICAM-1、炎癥因子水平的比較

2.2 ARDS患者血清miR-146b、ICAM-1水平與氧合指數(shù)和炎癥因子水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,ARDS患者血清miR-146b水平與氧合指數(shù)、血清IL-10水平呈正相關(guān),與血清ICAM-1、TNF-α、IL-6水平呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05);血清ICAM-1水平與氧合指數(shù)、血清IL-10水平均呈負(fù)相關(guān),與血清TNF-α、IL-6水平均呈正相關(guān)(均P<0.05)。見表2。

2.3 不同預(yù)后患者的基線資料和血清miR-146b、ICAM-1、炎癥因子水平的比較 死亡組患者的機(jī)械通氣時間、EICU入住時間均長于存活組,氧合指數(shù)和血清miR-146b、IL-10水平均低于存活組,EVLWI和血清TNF-α、IL-6、ICAM-1水平均高于存活組(均P<0.05);兩組患者其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 不同預(yù)后患者的基線資料和血清miR-146b、ICAM-1、炎癥因子水平的比較

2.4 ARDS患者預(yù)后不良的影響因素分析 以機(jī)械通氣時間、EICU入住時間、EVLWI、氧合指數(shù),以及血清TNF-α、IL-6、IL-10、miR-146b、ICAM-1水平為自變量(均以原值納入),以ARDS患者的預(yù)后情況為因變量(死亡=1,存活=0),納入多因素Logistic回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,機(jī)械通氣時間延長、EVLWI和血清TNF-α、IL-6、ICAM-1水平升高是ARDS患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,氧合指數(shù)和血清IL-10、miR-146b水平升高為其獨(dú)立保護(hù)因素(均P<0.05)。見表4。

表4 ARDS患者預(yù)后不良的影響因素分析

2.5 血清miR-146b、ICAM-1水平對ARDS患者預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清miR-146b、ICAM-1水平分別為0.63 ng/mL、852.20 ng/mL時,預(yù)測ARDS患者預(yù)后不良的曲線下面積分別為0.802(95%CI：0.738,0.857)、0.811(95%CI：0.748,0.865),敏感度分別為76.92%、88.46%,特異度分別為74.65%、64.18%。見圖1。

圖1 血清miR-146b、ICAM-1水平預(yù)測ARDS患者預(yù)后不良的ROC曲線圖

3 討 論

ARDS是臨床常見的重癥呼吸系統(tǒng)疾病,以肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、通氣/血流值失常為主要病理生理特征,因其致病因素繁多且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,一直是EICU醫(yī)護(hù)人員面臨的難題。目前研究認(rèn)為,炎癥反應(yīng)參與ARDS的發(fā)生和發(fā)展,肺臟在受到感染、創(chuàng)傷等損傷時能激活炎癥反應(yīng)以修復(fù)損傷,但過度的炎癥反應(yīng)會加劇肺泡上皮和血管內(nèi)皮損害,導(dǎo)致肺功能持續(xù)惡化,最終引起ARDS[3]。

miRNA是一種長度為18～25個核苷酸的高度保守的非編碼RNA,能根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則特異性結(jié)合目標(biāo)mRNA的3′-非翻譯區(qū),間接調(diào)節(jié)基因表達(dá),通過炎癥反應(yīng)參與ARDS的發(fā)生和發(fā)展[9],如miR-216a能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路來緩解脂多糖誘導(dǎo)的ARDS[10]。miR-146b定位于染色體10q24.32,作為參與免疫炎癥、癌癥等多種生物學(xué)過程的miR-146成員之一,其也被認(rèn)為是先天性免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑,在免疫炎癥、癌癥發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。Zhang等[11]使用脂多糖誘導(dǎo)構(gòu)建狼瘡性腎炎細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)腎系膜細(xì)胞中miR-146b表達(dá)受抑制,上調(diào)miR-146b表達(dá)能通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6抑制NF-κB信號通路,從而抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎癥損傷。Toll樣受體在炎癥反應(yīng)的啟動過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,Curtale等[12]發(fā)現(xiàn),抗炎性細(xì)胞因子IL-10能誘導(dǎo)miR-146b表達(dá),進(jìn)而通過與Toll樣受體相關(guān)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6、白細(xì)胞介素 1受體相關(guān)激酶1、髓樣分化因子88信號通路來抑制TNF-α、IL-6等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。上述研究說明miR-146b具有抗炎作用。

TNF-α、IL-6是重要的促炎性細(xì)胞因子,IL-10是重要的抗炎性細(xì)胞因子,有研究表明這三者在ARDS炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[13]。本研究結(jié)果顯示,輕度組、中度組、重度組患者血清TNF-α、IL-6水平依次升高,IL-10水平依次降低(均P<0.05),說明ARDS患者機(jī)體存在明顯炎癥反應(yīng),與既往研究[3]結(jié)果相似。氧合指數(shù)是反映器官組織能否獲得足夠氧氣并進(jìn)行氧合作用的指數(shù),ARDS患者因頑固性低氧血癥、嚴(yán)重呼吸窘迫等原因而出現(xiàn)氧合指數(shù)顯著降低,因此2012年柏林標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)氧合指數(shù)對ARDS患者進(jìn)行病情分級[8]。本研究結(jié)果顯示,輕度組、中度組、重度組患者的血清miR-146b水平依次降低,且ARDS患者血清miR-146b水平與氧合指數(shù)呈正相關(guān) (均P<0.05),說明miR-146b參與ARDS的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果還顯示,ARDS患者血清miR-146b水平與血清IL-10水平呈正相關(guān),與血清TNF-α、IL-6水平呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05),提示miR-146b可能通過炎癥反應(yīng)參與ARDS的發(fā)生和發(fā)展。He等[14]通過脂多糖誘導(dǎo)構(gòu)建ARDS小鼠模型,發(fā)現(xiàn)miR-146b過表達(dá)能降低肺組織和肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1的表達(dá),改善小鼠肺通透性。本研究結(jié)果還顯示,血清miR-146b水平是ARDS患者預(yù)后的影響因素。ROC曲線分析結(jié)果顯示miR-146b預(yù)測ARDS患者預(yù)后不良的曲線下面積為0.802,說明miR-146b能作為評估ARDS預(yù)后的生物標(biāo)志物。

ICAM能介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間、內(nèi)皮細(xì)胞與基質(zhì)間的相互接觸和結(jié)合,參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程[15]。ICAM-1基因定位于染色體19pl3.3-13.2,是一種位于內(nèi)皮細(xì)胞表面的糖蛋白和黏附受體,在炎癥刺激時內(nèi)皮細(xì)胞可大量分泌ICAM-1,ICAM-1能特異性結(jié)合其受體,招募腫瘤細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、白細(xì)胞到內(nèi)皮細(xì)胞,促使內(nèi)皮細(xì)胞活化,增加內(nèi)皮通透性,引起器官組織損傷[6]。中性粒細(xì)胞的激活和向肺泡空間的轉(zhuǎn)移是ARDS炎癥激活和大量促炎介質(zhì)釋放的關(guān)鍵[3]。研究表明,ICAM-1廣泛表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞,并在中性粒細(xì)胞招募和運(yùn)輸?shù)椒尾康倪^程中起到關(guān)鍵作用[16]。研究表明,ICAM-1與哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等免疫炎癥疾病有關(guān)[17-18]。本研究結(jié)果顯示,輕度組、中度組、重度組患者的血清ICAM-1水平依次升高,且ARDS患者血清ICAM-1水平與氧合指數(shù)呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05),說明ICAM-1參與ARDS的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果還顯示,ARDS患者血清ICAM-1水平與IL-10水平呈負(fù)相關(guān),與TNF-α、IL-6水平呈正相關(guān)(均P<0.05),提示ICAM-1可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)參與ARDS的發(fā)生和發(fā)展。于海容等[19]通過脂多糖誘導(dǎo)構(gòu)建ARDS兔模型,發(fā)現(xiàn)ARDS兔肺組織中ICAM-1的表達(dá)水平隨著脂多糖干預(yù)時間的延長而升高,且隨著ICAM-1表達(dá)水平的升高,肺泡炎癥細(xì)胞浸潤加重、間隔增厚。本研究結(jié)果顯示,ICAM-1高表達(dá)的ARDS患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增加,ROC曲線也證實(shí)ICAM-1可作為評估ARDS預(yù)后的生物標(biāo)志物。此外,ARDS患者血清miR-146b水平與ICAM-1水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),說明二者參與了ARDS的發(fā)生和發(fā)展,并可作為評估ARDS患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。動物實(shí)驗(yàn)顯示,ARDS模型大鼠肺組織中的miR-146b表達(dá)下調(diào),ICAM-1表達(dá)上調(diào),給予miR-146b干預(yù)后,ARDS模型大鼠肺組織中的ICAM-1表達(dá)下調(diào),雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-146b能靶向結(jié)合ICAM-1的3′-非翻譯區(qū),負(fù)向調(diào)控ICAM-1的表達(dá)[20]。該研究進(jìn)一步證實(shí)了miR-146b和ICAM-1共同參與ARDS的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述,miR-146b、ICAM-1可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)參與ARDS的發(fā)生和發(fā)展,與ARDS患者的疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān),有望成為ARDS潛在的生物標(biāo)志物和臨床治療靶點(diǎn)。但本研究樣本量較小,研究結(jié)論還需進(jìn)行多中心、大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。