徐如意 曾麗云 陳輝 鄭琳 於學(xué)嬋 虞亦鳴 莊起東 陳眾博 鄧在春

[摘要]?目的?總結(jié)并分析支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar?lavage?fluid，BALF）宏基因組二代測序（metagenomic?next-generation?sequencing，mNGS）檢出低序列耶氏肺孢子菌（Pneumocystis?jirovecii，PJ）的非HIV患者的危險因素、臨床特點、治療及預(yù)后。方法?回顧性分析2018年5月至2022年6月在寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院因不明原因肺炎行氣管鏡檢查且BALF-mNGS檢出PJ的13例非HIV患者的臨床資料。結(jié)果?13例患者中，危險因素以使用糖皮質(zhì)激素最為常見，最常見的癥狀是咳嗽、咳痰，12例患者有血感染指標異常，影像學(xué)特點以兩肺彌漫性病變、多發(fā)磨玻璃影為主。12例患者接受抗PJ治療，其中11例患者在治療期間病情好轉(zhuǎn)，1例因重癥感染治療無效死亡；1例患者未接受抗PJ治療，在經(jīng)驗性抗感染治療后好轉(zhuǎn)。結(jié)論?經(jīng)BALF-mNGS檢出PJ的非HIV患者臨床特點不典型，結(jié)合mNGS結(jié)果與宿主因素綜合判斷，有助于早診、早治，改善患者的預(yù)后。

[關(guān)鍵詞]?非HIV患者；肺孢子菌肺炎；宏基因組二代測序；低序列

[中圖分類號]?R519??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.21.003

Clinical?analysis?of?non-HIV?patients?with?Pneumocystis?jirovecii?detected?by?metagenomic?sequencing

XU?Ruyi1，?ZENG?Liyun2，?CHEN?Hui1，?ZHENG?Lin3，?YU?Xuechan1，?YU?Yiming1，?ZHUANG?Qidong1，?CHEN?Zhongbo1，?DENG?Zaichun1

1.Department?of?Respiratory?and?Critical?Care?Medicine，?the?First?Affiliated?Hospital?of?Ningbo?University，?Key?Laboratory?of?Respiratory?Disease?of?Ningbo，?Ningbo?315010，?Zhejiang，?China;?2.Department?of?Technology，?Hangzhou?Matridx?Biotechnology?Co.，?Ltd，?Hangzhou?310030，?Zhejiang，?China;?3.Microbiology?Department，?the?First?Affiliated?Hospital?of?Ningbo?University，?Ningbo?315010，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?summarize?and?analyze?the?risk?factors，?clinical?characteristics，?treatment，?and?prognosis?of?non-HIV?patients?with?low-sequence?Pneumocystis?jirovecii?（PJ）?detected?by?metagenomic?next-generation?sequencing?（mNGS）?of?bronchoalveolar?lavage?fluid?（BALF）.?Methods?The?clinical?data?of?13?non-HIV?patients?with?PJ?detected?by?BALF-mNGS?who?underwent?bronchoscopy?due?to?unexplained?pneumonia?in?the?First?Affiliated?Hospital?of?Ningbo?University?from?May?2018?to?June?2022?were?retrospectively?analyzed.?Results?Among?the?13?patients，?the?use?of?glucocorticoids?was?the?most?common?risk?factor，?the?most?common?symptom?was?cough?and?expectoration，?12?patients?had?abnormal?blood?infection?indicators，?and?the?main?imaging?features?were?diffuse?lesions?in?both?lungs?and?multiple?ground?glass?shadows.?12?patients?received?anti-PJ?treatment，?of?which?11?patients?were?improved?during?treatment，?and?one?patient?died?due?to?ineffective?treatment?of?severe?infection.?One?patient?did?not?receive?anti-PJ?therapy?and?improved?after?empirical?anti-infective?therapy.?Conclusion?The?clinical?characteristics?of?non-HIV?patients?with?PJ?detected?by?BALF-mNGS?are?not?typical.?The?combination?of?mNGS?results?and?host?factors?is?helpful?for?early?diagnosis，?treatment?and?improving?the?prognosis?of?patients.

[Key?words]?Non-HIV?patients;?Pneumocystis?pneumonia;?Metagenomic?next-generation?sequencing;?Low?sequence

耶氏肺孢子菌肺炎（Pneumocystis?jirovecii?pneumonia，PJP）是一種致命的機會性真菌感染，近年來，PJP在非HIV感染者中的發(fā)病率有所升高[1-2]。在非HIV感染者中，PJP的死亡率也在增加，HIV陰性的PJP患者的死亡率為25%～50%[3-6]。以往研究表明，在感染耶氏肺孢子菌（Pneumocystis?jirovecii，PJ）的患者中，與HIV陽性患者相比，HIV陰性患者的癥狀不典型，疾病進展更快，并發(fā)感染的風(fēng)險更高，預(yù)后更差，且死亡率更高[7]。這就要求臨床上對PJ應(yīng)早檢出、早治療。作為一種檢測手段，宏基因組二代測序（metagenomic?next-generation?sequencing，mNGS）無須事先根據(jù)臨床表現(xiàn)來預(yù)測可能的病原體，其診斷肺部真菌感染性疾病的敏感性和特異性優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法[8-9]。本研究對13例由mNGS檢出PJ陽性的非HIV患者的臨床資料進行回顧性分析和總結(jié)，現(xiàn)報道如下。

1??資料與方法

1.1??資料

回顧性分析2018年5月至2022年6月于寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院治療的13例經(jīng)支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar?lavage?fluid，BALF）-mNGS檢出PJ陽性的非HIV患者。從住院患者信息中提取每位病例的基本信息、危險因素、臨床特征、實驗室檢查結(jié)果和胸部CT表現(xiàn)，并收集患者的治療方案及隨訪治療效果。本研究經(jīng)寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：倫審2023研第082RS號），所有研究對象均被充分告知檢查內(nèi)容及相關(guān)風(fēng)險。

1.2??支氣管肺泡灌洗液收集

患者在全身麻醉下，由專業(yè)醫(yī)生進行支氣管鏡檢查，支氣管肺泡灌洗3次（每次20ml）。根據(jù)胸部CT顯示的病灶位置確定灌洗區(qū)域。若雙肺有彌漫性病變，則在右肺中葉進行灌洗，并立即密封兩管3ml?BALF，送至杭州杰毅生物技術(shù)有限公司用于mNGS檢測[10-11]。

1.3??mNGS的操作步驟

取1.2ml磷酸緩沖鹽溶液加入標本管，置于渦旋震蕩儀震蕩混勻10min。吸取1.2ml標本管中液體于2ml震蕩管中。將震蕩管置于生物樣本勻質(zhì)儀中，勻質(zhì)9min，利用高效三維高速碰撞破碎細胞，對樣品進行研磨、裂解、均質(zhì)。取出震蕩管放入離心機中，以12?000轉(zhuǎn)/min離心3min，吸取上清液400μl至小體積基因組核酸提取或純化試劑盒中，放入NGS?master全自動建庫儀進行核酸提取及文庫構(gòu)建。使用DNA降解和環(huán)化將雙鏈DNA文庫轉(zhuǎn)化為單鏈環(huán)狀DNA。最后在Illumina測序平臺進行高通量測序[12-13]。

2??結(jié)果

2.1??患者的基本特征及患PJP的危險因素

共13例非HIV患者通過BALF-mNGS檢測到PJ，男11例，女2例，年齡53～82歲；其中9例患者有兩種或以上基礎(chǔ)疾病，8例有全身糖皮質(zhì)激素使用史，5例有糖尿病，4例有實體器官惡性腫瘤病史，3例有血液系統(tǒng)惡性腫瘤，2例有肝硬化病史，1例有腎臟疾病，1例無感染PJ的危險因素，見表1。

2.2??臨床癥狀

在患病過程中，11例有咳嗽癥狀，8例出現(xiàn)勞力性呼吸困難，6例出現(xiàn)發(fā)熱，4例出現(xiàn)乏力，1例有胸痛表現(xiàn)，見表2。

2.3??實驗室檢查及影像學(xué)特點

在患病過程中，4例患者出現(xiàn)白細胞計數(shù)升高，12例患者出現(xiàn)C反應(yīng)蛋白升高，11例患者出現(xiàn)淋巴細胞計數(shù)下降，8例患者的乳酸脫氫酶水平升高。胸部CT提示多發(fā)磨玻璃影8例，滲出影4例，實變3例，胸腔積液2例。mNGS檢出的PJ序列數(shù)從1至962不等，3例患者僅檢出PJ，10例患者同時檢出其他病原體，見表3。

2.4??治療及效果

入院后，因呼吸道癥狀及肺部炎癥，所有患者均接受經(jīng)驗性抗生素治療。在BALF-mNGS檢出PJ后，12例患者在原抗感染治療方案基礎(chǔ)上加用磺胺甲唑–甲氧芐啶（sulfamethoxazole-trimethoprim，SMZ-TMP）治療，1例患者未接受針對PJ的治療。抗PJ治療后，11例患者癥狀好轉(zhuǎn)，其中8例患者在復(fù)查胸部CT時觀察到病灶吸收（典型胸部CT表現(xiàn)見圖1）；1例患者基礎(chǔ)狀態(tài)差，有肺惡性腫瘤、2型糖尿病、腦梗死病史，因“咳嗽咳痰伴氣促1周，加重1d”入院，雖在抗PJ治療后患者癥狀曾一度好轉(zhuǎn)，但后續(xù)因嚴重感染，經(jīng)多種抗生素治療后癥狀仍進一步惡化，出現(xiàn)呼吸衰竭、急性左心衰、肝功能異常等表現(xiàn)，住院期間因嚴重感染及多器官損傷經(jīng)治療無效后死亡。1例未接受抗PJ治療的患者在莫西沙星治療后癥狀明顯好轉(zhuǎn)，見表4。

3??討論

PJP是一種致命的機會性肺部感染性疾病，在非HIV患者中，PJ常定植于肺部，當(dāng)基礎(chǔ)疾病加重或全身情況惡化時，PJ可由定植轉(zhuǎn)為侵襲性感染，繼而出現(xiàn)肺部病灶擴大及發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等非特異性表現(xiàn)[1，5，14]。與HIV患者相比，非HIV患者感染PJ后癥狀更嚴重，疾病進展更快，呼吸衰竭比例更高，這使得非HIV患者感染PJ后面臨更高的死亡風(fēng)險[7]。

六胺銀（gomori?methenamine?silver，GMS）染色檢出PJ的特異性很高，有研究證明特異性達到100%，但敏感度低導(dǎo)致GMS染色在診斷PJP時非常容易漏診[15-16]。目前，BALF-mNGS技術(shù)廣泛用于PJ的檢測，在診斷肺部感染性疾病時，敏感度高是mNGS的一個重要優(yōu)勢。研究顯示，BALF-mNGS的敏感度、特異性均顯著高于血清（1，3）-β-D-葡聚糖試驗[17-18]。Jiang[19]等發(fā)現(xiàn)BALF-mNGS診斷PJP的敏感度明顯高于GMS染色。

有研究表明，PJP患者易出現(xiàn)其他致病菌的合并感染，如巨細胞病毒、EB病毒、單純皰疹病毒1型、念珠菌及細環(huán)病毒[17，?19]。在本研究的13例患者中，有10例患者mNGS檢出其他病原體的序列，以巨細胞病毒、EB病毒、單純皰疹病毒1型為主，這與之前的研究結(jié)果一致。由于PJP患者常有其他病原體的混合感染，mNGS因其診斷混合感染的優(yōu)勢，相比其他微生物學(xué)檢查更適用于PJP的診斷。

過去，臨床上主要根據(jù)mNGS檢出病原菌的序列數(shù)判斷是否需要治療，但序列數(shù)并不能完全真實反映患者體內(nèi)病原微生物的含量；在mNGS技術(shù)中，微生物讀數(shù)會隨著樣本中宿主細胞濃度的增加而降低[20]。mNGS檢出的PJ序列數(shù)變化很大（2～1?665?693）[21-24]。在本文回顧性研究的13例BALF-mNGS檢出PJ的非HIV患者中，同樣也觀察到低序列數(shù)的PJ，最小序列數(shù)為1。由于PJ在自然界廣泛存在并可能在呼吸道定植，故mNGS檢出PJ并不等同于感染，但目前仍沒有準確的閾值來判斷BALF-mNGS檢出的PJ是定植還是侵襲性感染[17]。對這些低序列數(shù)患者是否需要抗PJ治療？首先，雖然PJ可定植于肺部，但臨床上在免疫功能正?；蚣韧鶝]有肺部疾病的患者中很少見到PJ感染。本研究納入的患者中，免疫抑制狀態(tài)及肺部基礎(chǔ)疾病十分常見，這一特點與之前報道的PJ感染病例大致相同[1，?4，?25-27]。一項關(guān)于mNGS診斷疑似感染病灶的研究數(shù)據(jù)顯示，對免疫正常患者的樣本進行mNGS檢測時，很少報告PJ陽性[24]。其次，雖然定植在肺部的PJ有時不直接產(chǎn)生癥狀，但仍可參與激活炎癥反應(yīng)，造成肺部損傷，甚至導(dǎo)致其他肺部疾病的惡化[28]。最后，對免疫功能低下的非HIV患者，PJ定植轉(zhuǎn)為侵襲感染時，疾病進展快，預(yù)后差[3，?7]。所以筆者認為對有肺部基礎(chǔ)疾病或免疫損傷危險因素的非HIV患者，即使檢出的PJ序列數(shù)低，預(yù)防性抗PJ治療也非常重要。

綜上所述，BALF-mNGS檢出PJ陽性的非HIV患者臨床特點不典型，mNGS可幫助檢出PJ，并有助于發(fā)現(xiàn)混合感染的病原體。對mNGS檢出PJ陽性的低序列患者，若有肺部基礎(chǔ)疾病或免疫功能受損等危險因素，應(yīng)盡早開始抗PJ治療，以期改善患者的預(yù)后。

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