胡畔

（貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽 550000）

追風(fēng)傘(Lysimachia paridiformis)是報(bào)春花科珍珠菜屬植物，又名狹葉落地梅。在我國主要分布于四川、云南、貴州、廣東、廣西、湖南等地，全草可入藥，功效有祛風(fēng)、活血化瘀、定驚、生肌，用于骨折、跌打損傷、小兒驚風(fēng)、風(fēng)濕麻木、腳轉(zhuǎn)筋等[1]。黃酮類化合物是廣泛存在于各種植物的一類次生代謝產(chǎn)物，是藥用植物的主要活性成分之一。黃酮類化合物能夠抗菌、消炎、防病毒、抗腫瘤、保肝、止咳祛痰、抗氧化抗氧化和抗微生物、抑制炎癥反應(yīng)的作用[2-6]。但是以纖維素為主的細(xì)胞壁把植物中的總黃酮類化合物包圍，傳統(tǒng)的提取方法沒辦法使包圍黃酮類化合物的細(xì)胞壁破裂，黃酮類化合物向溶劑主體的擴(kuò)散受阻，致使提取效果受限嚴(yán)重，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)[7]。

本實(shí)驗(yàn)參考了目前的研究經(jīng)驗(yàn)，并做出了相關(guān)的分析與總結(jié)，從而使用乙醇法用纖維素酶輔助提取追風(fēng)傘中的總黃酮，并且在單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)進(jìn)行提取條件的優(yōu)化，使得追風(fēng)傘中總黃酮得到更高效的利用。目前對(duì)追風(fēng)傘的藥理作用、化學(xué)成分的報(bào)道和研究較少。但是對(duì)其同屬植物的黃酮苷類和三萜皂苷成分的報(bào)道和研究較多，而且黃酮苷類具有很好的抗腫瘤作用[8]。經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察、對(duì)料液比的考察、對(duì)回流時(shí)間的考察以及對(duì)回流溫度的考察，通過正交試驗(yàn)得出追風(fēng)傘中總黃酮的最佳提取工藝[9]。劉全德等[10]采取纖維素酶對(duì)野馬追總黃酮的提取進(jìn)行輔助，分別控制液料比、酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間，并與水煎煮法、乙醇提取法做對(duì)比，可借鑒性高。超臨界流體萃取法、半仿生提取、酶輔助提取法目前是黃酮類化合物的主要提取方法[11]。超臨界流體萃取技術(shù)和傳統(tǒng)的中藥提取分離技術(shù)相比，適用范圍更廣，對(duì)原料成分沒有破壞，對(duì)環(huán)境沒有污染，具備操作更方便和提取效率更高等一系列優(yōu)點(diǎn)[12]。但是其成本高，原料不易獲取。半仿生提取在一定程度上可以使有效成分更好地溶出，能夠縮短生產(chǎn)周期、降低成本，而且對(duì)于制劑和使用更有利，但對(duì)于單一成分可能不是最佳選擇[13]。微波提取法的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)率高、能耗低、操作時(shí)間短、溶劑用量少等；大量試驗(yàn)結(jié)果表明微波提取法可以使黃酮類化合物的提取率大幅度提高，但微波提取法的應(yīng)用廣度很大程度被微波泄漏問題限制，目前微波提取法正處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，在熱敏性物質(zhì)領(lǐng)域還是空白，是否能夠用于工業(yè)化生產(chǎn)還需要更進(jìn)一步研究[14]。酶解法在天然產(chǎn)物的提取中屬于新興技術(shù)，植物細(xì)胞壁可以利用酶制劑進(jìn)行降解，使細(xì)胞內(nèi)有效成分最大限度溶出，與此同時(shí)酶制劑可以把植物組織較溫和地分解，進(jìn)一步保證了所提取物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的穩(wěn)定。追風(fēng)傘植物的細(xì)胞壁主要由半纖維素、纖維素構(gòu)成，因此實(shí)驗(yàn)用酶制劑選用纖維素酶[15]。相對(duì)其他有著成本高，對(duì)儀器操作要求高等缺點(diǎn)的方法而言，酶解法由于材料易得、成本較低、易操作、無污染、作用明顯等特征，可用性更高，因此選擇酶解法作為試驗(yàn)方法。

1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

主要儀器（型號(hào)）：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（SENCOR201L）、水浴鍋（B-220）、紫外分光光度計(jì)（7230G）、循環(huán)水式真空泵（SHZ-D）、分析天平（AUY220）、干燥箱（DHG-9070A）。主要試劑：追風(fēng)傘（安徽省亳州市三義堂藥業(yè)有限公司提供）、蘆丁對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所提供）、纖維素酶（湖南米純生物科技有限責(zé)任公司提供）、乙醇（AR）、NaNO2（AR）、Al(NO3)3（AR）、NaOH（AR）。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[16]

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.462 mg，加適量50%的乙醇溶液進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加50%的乙醇定容，配制成濃度為0.1092 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL 分別轉(zhuǎn)移到6 支25 mL 容量瓶中，各加5% NaNO2溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min；加10%Al(NO3)3溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min；加4% NaOH溶液10.00 mL，再加入50%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min。在510 nm 波長處以試劑空白為參比測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y = 12.229x + 0.0081，其線性相關(guān)系數(shù)為R2= 0.9995。

1.2.2 總黃酮的提取與含量測(cè)定

稱取一定量預(yù)處理好的追風(fēng)傘粉末置于錐形瓶中，然后稱取一定質(zhì)量的纖維素酶加入，再量取一定體積的50%乙醇加入，在一定溫度下提取一段時(shí)間后，將提取液過濾，定容，得總黃酮的粗提取液。按“1.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算濃度，求得提取率。

其中C 是總黃酮提取液中總黃酮濃度（g/mL），V 是總黃酮提取液體積（mL），M 是稱取追風(fēng)傘的質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)纖維素酶用量對(duì)追風(fēng)傘中總黃酮提取率的影響。稱取0.50 g 的追風(fēng)傘粉末5 份分別置于50 mL 錐形瓶中，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1：20（g/mL），纖維素酶用量分別為0.5 mg、1 mg、1.5 mg、2 mg、3 mg，在40℃條件下反應(yīng)1.5 h 之后置于70 ℃水浴中滅酶活，5 min 之后過濾，濾液用50%乙醇定容至50 mL，得總黃酮提取液，測(cè)定其吸光度并計(jì)算總黃酮提取率。

(2)酶解時(shí)間對(duì)追風(fēng)傘中總黃酮提取率的影響。稱取0.50 g 的追風(fēng)傘粉末5 份分別置于50 mL 錐形瓶中，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1 ∶20（g/mL），纖維素酶用量1 mg，在40℃條件下分別酶解1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h 之后置于70℃水浴中滅酶活，5 min 之后過濾，濾液用50%乙醇定容至50 mL，得總黃酮提取液，測(cè)定其吸光度并計(jì)算總黃酮提取率。

(3)酶解溫度對(duì)追風(fēng)傘中總黃酮提取率的影響。稱取0.50 g 的追風(fēng)傘粉末5 份分別置于50 mL 錐形瓶中，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1 ∶20（g/mL），纖維素酶用量1 mg，分別在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃條件下酶解2.0 h 之后置于70℃水浴中滅酶活，5 min 之后過濾，濾液用50%乙醇定容至50 mL，得總黃酮提取液，測(cè)定其吸光度并計(jì)算總黃酮提取率。

(4)料液比對(duì)追風(fēng)傘中總黃酮提取率的影響。稱取0.50 g 的追風(fēng)傘粉末5 份分別置于50 mL 錐形瓶中，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，纖維素酶用量1 mg，料液比分別為1 ∶20（g/mL）、1 ∶30（g/mL）、1 ∶35（g/mL）、1 ∶40（g/mL）、1 ∶45（g/mL），在40℃條件下反應(yīng)1.5 h 之后置于70℃水浴中滅酶活，5 min 之后過濾，濾液用50%乙醇定容至50 mL，得總黃酮提取液，測(cè)定其吸光度并計(jì)算總黃酮提取率。

(5)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)追風(fēng)傘中總黃酮提取率的影響。稱取0.50 g 的追風(fēng)傘粉末5 份分別置于50 mL 錐形瓶中，控制纖維素酶用量1 mg，控制料液比1 ∶20（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%，在40℃條件下反應(yīng)1.5 h 之后置于70℃水浴中滅酶活，5 min之后過濾，濾液用50%乙醇定容至50 mL，得總黃酮提取液，測(cè)定其吸光度并計(jì)算總黃酮提取率。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，針對(duì)纖維素酶對(duì)提取率的影響，選取酶解溫度、酶解時(shí)間、酶用量三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 纖維素酶用量對(duì)追風(fēng)傘中總黃酮提取率的影響

纖維素酶可使追風(fēng)傘細(xì)胞壁破裂分解，可以提高追風(fēng)傘中總黃酮的提取率。加入不同質(zhì)量的纖維素酶時(shí)追風(fēng)傘粉末中總黃酮的提取率結(jié)果隨加入纖維素酶質(zhì)量的增加總體呈上升趨勢(shì)，酶用量少于3.0 mg 時(shí)不能使細(xì)胞壁完全破解，酶用量為3.0 mg 時(shí)總黃酮提取率最高。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)追風(fēng)傘中總黃酮提取率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明總黃酮提取率隨著酶解時(shí)間的增長而呈降低態(tài)勢(shì)。所以并不是酶解時(shí)間越長總黃酮的提取率越高，隨著酶解時(shí)間的增長，提取出的總黃酮物質(zhì)可能會(huì)分解。當(dāng)酶解為1 h 時(shí)提取率最高，超過1 h 后，隨著酶解時(shí)間的增長，總黃酮類物質(zhì)分解量逐漸增加。

2.1.3 酶解溫度對(duì)追風(fēng)傘中總黃酮提取率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在45℃～65℃之間，總黃酮提取率隨溫度升高總體呈下降趨勢(shì)，在45℃時(shí)總黃酮提取率最高，在50℃～60℃之間變化較小，隨著溫度持續(xù)升高總黃酮提取率有明顯下降，表明在45℃時(shí)纖維素酶活性最大，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，纖維素酶逐漸失活。

2.1.4 料液比對(duì)追風(fēng)傘中總黃酮提取率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠看出總黃酮的提取率隨著料液比中溶劑的增加逐漸降低。隨著溶劑的增加，提取出的總黃酮類物質(zhì)可能會(huì)更多地溶解在溶劑中，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。在料液比為1 ∶20（g/mL）時(shí)總黃酮的提取率最高。

2.1.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)追風(fēng)傘中總黃酮提取率的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能夠看出總黃酮提取率先隨著乙醇的體積分?jǐn)?shù)升高而升高，之后下降?？傸S酮提取率在乙醇的體積分?jǐn)?shù)處于40%～60%區(qū)間時(shí)呈上升趨勢(shì)，在60%～80%區(qū)間呈下降趨勢(shì)，在60%的時(shí)候總黃酮提取率最高，說明該黃酮類化合物與體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇的極性相似。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇反應(yīng)條件酶解溫度50℃，酶解時(shí)間1.0 h，纖維素酶用量1.5 mg，此時(shí)測(cè)得吸光度為0.454，提取率為3.65%，正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

從以上單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果可知得到最佳提取條件工藝為在0.50 g 追風(fēng)傘粉末中加入1.5 mg 纖維素酶、酶解時(shí)間為1.0 h、酶解溫度為50℃、液料比1 ∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。在最佳提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3 可知該條件下總黃酮提取率可達(dá)3.65%，與在其他條件下的結(jié)果相比相對(duì)較高，因此該條件為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

在這項(xiàng)研究中采取纖維素酶輔助提取追風(fēng)傘中的總黃酮類物質(zhì)，在單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)得出3 個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的主次影響順序?yàn)槊附鉁囟龋久赣昧浚久附鈺r(shí)間。得到最佳條件下總黃酮提取率可達(dá)3.65%，該提取條件為在追風(fēng)傘粉末中加入纖維素酶1.5 mg、酶解時(shí)間為1.0 h、酶解溫度為50℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1 ∶20（g/mL）。