寇祝，卿純，袁昌果，李平

1.中國地質(zhì)大學（武漢）/生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國家重點實驗室，湖北 武漢 430074；2.長江流域環(huán)境水科學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430074

硫是生命物質(zhì)的基本組分之一，是構(gòu)成生物有機體的重要元素，在自然界中廣泛分布。硫可通過物理化學以及微生物作用進行轉(zhuǎn)化，因此硫循環(huán)在全球生物地球化學循環(huán)中具有重要作用（Zhao et al.，2020）。陸地熱泉存在硫化物、單質(zhì)硫、硫代硫酸鹽、硫酸鹽、硫化礦物等多種形態(tài)的硫，且具有溫度高、有機質(zhì)含量低、pH 值范圍廣，溶解氧含量低等特點（Shu et al.，2022），這些特征與早期地球環(huán)境相似。因此，研究熱泉環(huán)境中硫的轉(zhuǎn)化過程，對理解早期地球元素循環(huán)具有重要意義。

熱泉中的硫能為微生物提供能源，而微生物在硫的形態(tài)轉(zhuǎn)化中又起到重要作用。在好氧、微氧和厭氧條件下，微生物能夠以氧氣或硝酸鹽作為電子受體進行硫氧化（劉陽等，2018）。由于硫元素價態(tài)較多，硫氧化菌（Sulfur-Oxidizing Bacteria，SOB）可能通過不同的氧化途徑、酶和電子傳遞機制對不同價態(tài)的硫進行氧化。Paracoccus 硫氧化途徑（Paracocus Sulfur Oxidation，PSO）介導硫代硫酸鹽的氧化，該途徑的sox基因簇包含soxRSVWXYZABCDEFGH 15 個基因，且該基因簇編碼PSO 途徑的重要蛋白，其中SoxB 是硫代硫酸鹽氧化生成SO42?的關鍵蛋白（Wang et al.，2019）。由反向異化亞硫酸鹽還原酶主導（reverse Dissimilatory sulfite reduction，rDsr）的單質(zhì)硫氧化過程稱為Dsr 途徑，包含的主要基因有rhd、tusA、dsrE2和dsrAB，其中關鍵基因為dsrAB。除以上兩種途徑之外，sqr、aprA等基因也編碼微生物不同硫氧化途徑中的關鍵蛋白（Wu et al.，2021）。

以往的研究多使用soxB作為標記基因研究各種環(huán)境中的硫氧化菌，結(jié)果表明不同環(huán)境中優(yōu)勢SOB 可能存在差異?；鹕酵寥溃罾诘?，2020）與沿海沉積物（Alonso-Sáez et al.，2020）中基于soxB基因的優(yōu)勢硫氧化菌綱均為Alphaproteobacteria；而鹽堿湖中soxB基因硫氧化菌多為Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria 以 及Gammaproteobacteria（Tourova et al.，2013）。陸地熱泉中也存在大量硫氧化菌，主要分布于Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria 和Betaproteobacteria、Aquificae 等菌綱（Jaffer et al.，2019；甄莉等，2019；Castelán-Sánchez et al.，2020）。除soxB基因外，其他硫氧化功能基因也用于各種環(huán)境中的硫氧化菌研究，某些研究還進行了功能基因豐度比較以及環(huán)境因子的影響分析。例如，aprA基因也用于熱泉（Kubo et al.，2011）及海底熱液沉積物（Wang et al.，2018）中硫氧化菌的研究，其中與熱液噴口的距離影響著海底熱液沉積物硫氧化菌的群落結(jié)構(gòu)。在海洋高溫油藏采出水（Zhou et al.，2020）硫氧化菌的研究中使用soxB、dsrA和aprA基因作為標記因子，qPCR（Real-time Quantitative PCR）結(jié)果表明aprA基因豐度最大，soxB與dsrA基因豐度較低且相差不大。soxB、sqr以及dsrA基因用于研究淡水湖（Kojima et al.，2014）和江河（Luo et al.，2018）中的硫氧化菌，珠江水體中，基于不同基因的主導硫氧化菌在綱水平均為Betaproteobacteria 與Alphaproteobacteria，但目水平上，基于soxB基因的主要SOB 為Burkholderiales，而Nitrosomonadales 是基于dsrA基因的優(yōu)勢SOB。此外，珠江水體中環(huán)境因子對不同功能基因硫氧化菌群落結(jié)構(gòu)的影響也不同，基因豐度結(jié)果表明SoxB是該環(huán)境中的關鍵硫氧化酶（Luo et al.，2018）。前人研究表明，同一區(qū)域水體與沉積物中的硫氧化菌群落結(jié)構(gòu)可能也不同，例如鹽堿湖沉積物中Gammaproteobacteria 的相對豐度高于水體中Gammaproteobacteria 的相對豐度（Yang et al.，2013）；存在于云南熱泉沉積物與水體中的硫氧化菌也存在差異（Hou et al.，2013）。綜上所述，前人已在鹽堿湖、淡水湖、江河等環(huán)境中對硫氧化菌的多樣性及分布特征方面開展了大量的研究，但在硫廣泛分布的熱泉水中，不同類型的硫氧化菌的相關研究還較為少見。

西藏地熱區(qū)是世界上最活躍的地熱區(qū)域之一，陸地熱泉分布廣泛。以往對西藏陸地熱泉中的微生物研究多以16S rRNA 基因為主（韓天賜，2018；Ma et al.，2021），并發(fā)現(xiàn)如Thiobacillus等硫氧化菌群的存在。近年來，甄莉等（2019）采用硫氧化功能基因soxB克隆文庫的方法，分析了西藏南部5 個地熱區(qū)的25 個熱泉沉積物樣點中的硫氧化菌多樣性。其研究采樣點僅限于西藏南部，且該研究僅分析了熱泉沉積物中基于soxB基因的硫氧化菌，而對于熱泉分布眾多的西藏東北地區(qū)，熱泉水中不同硫氧化途徑的SOB 多樣性及分布特征的研究并未涉及。

因此，本研究旨在通過構(gòu)建西藏東北地區(qū)熱泉水中SOB 的soxB基因和dsrA基因克隆文庫，并結(jié)合實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）技術，分析對比soxB與dsrA硫氧化途徑SOB 在西藏東北部熱泉水中的多樣性、分布特征及其主控環(huán)境因子。本研究可完善對西藏熱泉水體環(huán)境中SOB 多樣性的認識，厘清影響不同硫氧化基因SOB 群落分布的關鍵環(huán)境因子，為全面理解熱泉微生物硫循環(huán)及其環(huán)境意義奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

西藏處于喜馬拉雅地熱帶，該地區(qū)熱液系統(tǒng)分布廣泛，且已發(fā)現(xiàn)340 余處熱水（呂苑苑等，2014）。西藏地區(qū)地熱水中砷含量普遍偏高，從10－126 mg·L?1，控制地熱水砷含量的關鍵因素為巖漿流體的地質(zhì)成因及其化學成分，其中硫化物的濃度也影響地熱水中的砷含量（Guo et al.，2019）。本文研究區(qū)域位于西藏東北部的那曲市與昌都市，該區(qū)域處于亞東-谷露-那曲裂谷系，斷裂帶水熱活動頻繁（呂苑苑等，2014），擁有許多不同環(huán)境梯度的熱泉。西藏北部的高溫沸泉的水化學特征主要是HCO3-Na 型；西藏東部地區(qū)熱泉的水化學特征以HCO3-Na 為主，也存在少量HCO3-Cl-Na 型熱泉。熱泉水化特征的不同可能與其形成方式相關，HCO3-Na 型的熱泉水通常是大氣降水通過大斷裂深循環(huán)形成，而花崗巖巖體中的放射性元素可能是HCO3-Cl-Na型熱泉的熱量來源（王尚，2015）。

1.2 樣品采集及理化參數(shù)測定

本研究采集的熱泉水樣來自西藏東北部的5 個地區(qū)：達巴、卓瑪、濱達微、卻色以及嘎弄，包括13 個熱泉，分別為達巴熱泉（DB1、DB41、DB45、DB5、DB6、DB7、DB8、DB10）、卓瑪熱泉（ZM1、ZM2）、濱達微熱泉（BDW）、卻色熱泉（QS）和嘎弄熱泉（GN）。采樣點如圖1。

圖1 西藏熱泉采樣點分布圖Figure 1 Distribution of hot springs water sampling sites in Tibet

采用過濾法收集熱泉微生物樣品。使用裝有0.22 μm×142 mm 濾膜的Millipore 不銹鋼過濾器過濾約10 L 熱泉水，將用于實驗室測量HCO3?、SO42?、As5+、AsT（總砷）質(zhì)量濃度的水樣分別收集到50 mL 酸洗聚丙烯瓶和棕色玻璃瓶中。過濾后含微生物的膜放入50 mL 無菌聚丙烯管，立即儲存于干冰中。按照Jiang et al.（2016）的方法收集測砷的水樣，將每個水樣的10 mL 通過硅基強陰離子交換筒（Supelco，美國），用50%的甲醇和去離子水進行預處理。As5+保留在筒中，As3+保留在過濾后的溶液中。隨后，用10 mL 1 mol·L?1HCl 洗脫，釋放結(jié)合的As5+以洗脫樣品。所有用于微生物群落分析的樣品在野外和運輸過程中保存在干冰中，然后在實驗室?80 ℃的超低溫冰箱中保存，直到進一步分析。每個熱泉水樣及微生物樣品均平行采集3 份。

現(xiàn)場采集熱泉水樣，使用Thermo 水化測定儀（Hach Corp.美國）現(xiàn)場檢測熱泉水體溫度、pH 和氧化還原電位（Oxidation-Reduction Potential，ORP）（Qing et al.，2023）。使用Hach DR850 分光光度計（美國）現(xiàn)場測試熱泉水樣中的S2?和FeT（總鐵）的質(zhì)量濃度，其中，S2?質(zhì)量濃度的測定采用亞甲基藍分光光度法（Qing et al.，2023），檢測限為0.01 mg·L?1；FeT質(zhì)量濃度的測定采用FerroZine 分光光度法（Viollier et al.，2000），檢測限為0.03 mg·L?1。采用滴定法（DZ/T 0064.49—1993）測量HCO3?的質(zhì)量濃度，檢測限為5 mg·L?1。使用離子色譜儀（ICS1100，Dionex，USA）測量SO42?的質(zhì)量濃度（姜舟，2016），測定時使用1.7 mmol·L?1碳酸鈉+1.8 mmol·L?1碳酸氫鈉溶液為流動相。As5+、AsT的質(zhì)量濃度使用液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜儀（LC-HG-AFS，海光AFS-9780，北京）測定（姜舟，2016），分別配制質(zhì)量濃度為10、20、40、80、100μg·L?1的As3+、As5+標準溶液，為測量時制作標準曲線使用；As3+和As5+的檢出限分別為2×10?9和4×10?9；AsT的質(zhì)量濃度為As3+、As5+質(zhì)量濃度之和。測量各理化參數(shù)時均測量3 組平行樣品，理化參數(shù)得到的數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

1.3 DNA 的提取和硫氧化基因PCR 擴增

樣品DNA 的提取采用FastDNA?SPIN Kit for Soil（MP BIO company，美國），提取過程參考試劑盒提供的操作步驟。以提取的總DNA 為模板，使用引物soxB-710F（5′-ATCGGYCAGGCYTTYCCS TA-3′）/soxB-1184R（5′-MAVGTGCCGTTGAARTT GC-3′）（楊磊等，2020）和dsrA-625F（5′-TTCAAG TTCTCCGGCTGCSCNAAYGACTG-3′）/dsrA-877R（5′-CGTTSANRCAGTGCATGCAGCG-3′）（Luo et al.，2018）進行西藏熱泉水樣中soxB和dsrA基因PCR 擴增，反應體系為2.5 μL 10×buffer，1 μL dNTP，19 μL ddH2O，正反向引物各1 μL，0.5 μL r-Taq DNA聚合酶以及1 μL DNA 模板，共計25 μL。擴增反應條件參照文獻（Luo et al.，2018；楊磊等，2020），PCR 產(chǎn)物采用質(zhì)量濃度為10 g·L?1的瓊脂糖凝膠（1 g 瓊脂糖粉溶于100 mL 1×TAE 緩沖液中）電泳檢測，在紫外燈下觀察，并切取目標條帶，其中soxB基因目的片段長度為511 bp，dsrA基因目的片段長度為252 bp。用試劑盒E.Z.N.A?Gel Extraction Kit（Omega Bio-Tek，美國）純化PCR 產(chǎn)物，回收DNA。

1.4 硫氧化基因克隆文庫構(gòu)建及系統(tǒng)發(fā)育分析

克隆文庫的構(gòu)建結(jié)合前人的方法（Wang et al.，2018）以及試劑盒操作步驟，將純化后的目的片段連接到 pClone007 Versatile Simple Vector 質(zhì)粒（TSINGKE，中國）載體上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞Trelief5α（TSINGKE，中國）中。將轉(zhuǎn)化后的細胞均勻涂布到含Amp（Ampicillin，氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基上，將平板倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。針對每1 個采樣點建立1 個克隆文庫，每個克隆文庫隨機挑選克隆子，使用引物M13F（5′-TGTAAAACGACGGCCAG-3′ ） /M13R （ 5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′）進行PCR（反應程序為：94 ℃預變性10 min；35 次循環(huán)（94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min）；72 ℃終延伸10 min）及凝膠電泳確定克隆子是否為陽性，得出結(jié)果后選擇20－45 個陽性克隆子送往武漢艾康健生物技術公司測序。使用MEGA 7 軟件裁剪測序獲得的核苷酸序列；核酸序列對齊后，使用Mothur進行可操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）的劃分，cutoff 值為0.03；劃分得到的每個OTU 選取1 個代表序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫中進行blastx，得到與本研究OTU 相近的氨基酸序列；下載相似性最高的氨基酸序列為參考序列，導入MEGA 7 軟件，與本研究的OTU 序列裁剪對齊后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。該研究中測定的克隆序列已經(jīng)遞交至GenBank 中，獲得登錄號為ON012851－ON012956。

1.5 qPCR 定量實驗

從1.4 的克隆文庫中挑選陽性克隆，在含Amp的LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，使用Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美國）微量紫外分光光度計測定質(zhì)粒DNA 濃度，得到的質(zhì)粒DNA 用于標準曲線的繪制。標準曲線的制備采用7 個系列10 倍稀釋，范圍為每毫升102－108個基因拷貝。通過測定相關功能基因的拷貝數(shù)、濃度和堿基對組成對DNA 進行量化。

在ABI 7500 Fast real-time PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems）上使用 SYBR Premix ExTaq?Ⅱ（TaKaRa，大連，中國）進行了3 個重復的定量PCR。16S rRNA 基因的引物對為bac-515F （ 5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′）/bac-806R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′），反應程序為：94 ℃預變性5 min；40 次循環(huán)（94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s）。soxB基因的引物對為soxB-432F（5′-GAYGGNGGNGAYACNTGG-3′）/soxB-693B（5′-ATCGGNCARGCNTTYCCNTA-3′），反應程序為：95 ℃預變性15 min；40 次循環(huán)（95 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s）。dsrA基因的引物對同1.3，反應程序為：95 ℃預變性5 min；40 次循環(huán)（95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s）。soxB、dsrA以及16S rRNA 基因的擴增效率（amplification efficiencies，%）分別為92.6、91.6 以及87.8。各個樣點中soxB與dsrA基因的相對豐度為其在各個樣點的基因拷貝數(shù)與16S rRNA 基因拷貝數(shù)的百分比。

1.6 統(tǒng)計學分析

硫氧化基因soxB與dsrA克隆文庫的覆蓋度使用公式計算：

其中：

C——覆蓋度；

n——文庫中只出現(xiàn)一次的克隆數(shù)量；

N——該文庫克隆總數(shù)（Jiang et al.，2016）。使用R 4.1.0 進行環(huán)境因子與硫氧化菌群落組成和分布的RDA（Redundancy analysis）分析，使用SPSS軟件進行環(huán)境因子之間的相關性分析、多樣性指數(shù)差異分析、環(huán)境因子與多樣性指數(shù)相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱泉水體理化特征

西藏東北部5 個地區(qū)的熱泉溫度為 (25.0±0.1)－(69.8±0.2) ℃，pH 為 (6.59±0.01)－(8.37±0.01)（表1），除BDW 熱泉為酸性熱泉外，其余熱泉均為中性或堿性熱泉。西藏熱泉硫離子質(zhì)量濃度較低，為 (0.80±0.04)－(2.56±0.02) mg·L?1。除DB10樣點外，其余達巴地區(qū)熱泉水樣中硫酸根質(zhì)量濃度較高，為 (455.6±2.1)－(643.3±0.9) mg·L?1。此外BDW 樣點也有較高的硫酸根質(zhì)量濃度，為(620.7±1.3) mg·L?1。西藏東北部熱泉中的砷多以五價砷的形式存在，其中達巴熱泉中總砷含量普遍偏高，最高可達 (9 298.58±1.08) μg·L?1，其余熱泉的總砷含量則較低。熱泉水化參數(shù)的Spearman 分析表明，ORP 與溫度（r= ?0.648，t= ?4.333，P=0.017）呈顯著負相關，SO42?質(zhì)量濃度與AsT質(zhì)量濃度呈顯著正相關（r=0.675，t= ?1.564，P=0.029）。

表1 采樣點主要地球化學參數(shù)Table 1 Main geochemical parameters of hot spring water in Tibet

2.2 硫氧化菌群落α 多樣性

從西藏東北部13 個熱泉樣品中擴增到541 條序列，其中dsrA基因共獲得227 條陽性克隆序列，分屬于47 個OTU；soxB基因共獲得314 條陽性克隆序列，分屬于61 個OTU（表2－3）?；赿srA基因的克隆文庫覆蓋度為92%－100%（表2），基于soxB基因的克隆文庫覆蓋度為92%－97%（表3）。α 多樣性指數(shù)（Chao 1、Shannon、Simpson_1?D）分析結(jié)果表明西藏東北部熱泉水中基于dsrA基因的Chao 1 指數(shù)為3－7，Shannon 指數(shù)為1.0－2.6，Simpson_1?D 指數(shù)為0.4－0.8；soxB基因的Chao 1指數(shù)為3.0－12.0，Shannon 指數(shù)為0.9－2.9，Simpson_1?D 指數(shù)為0.3－0.8。通過統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)西藏東北部熱泉中dsrA基因與soxB基因的Shannon 指數(shù)、Simpson_1?D 指數(shù)無明顯區(qū)別，但Chao 1 指數(shù)呈現(xiàn)出顯著差異（t=2.272，P=0.042）（圖2），結(jié)果顯示西藏熱泉中基于soxB的Chao 1指數(shù)大于基于dsrA基因的Chao 1 指數(shù)（圖2a），表示西藏東北部熱泉水中基于soxB的SOB 物種豐富度較高，在熱泉水體中可能發(fā)現(xiàn)更多種類的soxB基因型硫氧化菌。此外，探究環(huán)境因子對dsrA以及soxB基因α 多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)僅SO42?濃度與基于dsrA基因的Chao 1 指數(shù)顯著呈負相關（r= ?0.854，t= ?3.792，P=0.002）（表4），表明西藏東北部熱泉水中基于dsrA基因的SOB 的物種豐富度可能受到SO42?濃度的影響較大，SO42?濃度越高的熱泉水體中dsrA基因型SOB 物種數(shù)量可能越少。

表2 硫氧化基因dsrA 克隆文庫的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices of dsrA gene clone libraries

表3 硫氧化基因soxB 克隆文庫的多樣性指數(shù)Table 3 Diversity indices of soxB gene clone libraries

表4 環(huán)境因子與dsrA 基因α 多樣性指數(shù)相關性分析Table 4 Correlation analysis between environmental factors and alpha diversity index of dsrA

圖2 soxB 與dsrA 基因α 多樣性指數(shù)差異圖Figure 2 Alpha diversity index difference between soxB and dsrA gene

2.3 硫氧化菌群落組成

對13 個熱泉水體樣本構(gòu)建克隆文庫后得到的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明西藏東北部熱泉水體中基于soxB基因的SOB 在綱水平上包含有Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia（圖3），而基于dsrA基因的 SOB 在綱水平上僅包含Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia（圖4），表明在綱水平上，dsrA基因型SOB 物種豐富度低于soxB基因型SOB 物種豐富度?；趕oxB基因的優(yōu)勢菌綱為Betaproteobacteria（圖3），其相對豐度在各樣點中占88.0%－100.0%。在基于soxB基因的系統(tǒng)發(fā)育中，達巴（DB）地區(qū)與卓瑪（ZM）地區(qū)熱泉樣點的SOB 包含有Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia，而濱達微（BDW）地區(qū)熱泉樣點 的 SOB 僅 含 有 Betaproteobacteria 與Alphaproteobacteria，表明綱水平上各地區(qū)熱泉中基于soxB基因的SOB 群落結(jié)構(gòu)存在差異。在屬水平上，各熱泉樣點的硫氧化菌不同，屬于Betaproteobacteria 的 OTU 多與Sphaerotilus、Sulfuricella、Sulfuriferula、Thiobacillus、Comamonas相近，存在于DB41、DB5、DB7、DB8、DB10 以及BDW 樣點中。屬于Gammaproteobacteria 的OTU僅在DB8 與ZM1 樣點中發(fā)現(xiàn)，其中DB8 樣點的OTU 與Thiocapsa相近，ZM1 樣點的OTU 與Thioalkalivibrio相近。屬于Alphaproteobacteria 綱soxB基因OTU 存在于DB1、DB41、DB5、DB8、DB10、ZM1 樣點中，這些OTU 序列與Paracoccus、Roseinatronobacter相近。基于dsrA基因的優(yōu)勢菌綱也為Betaproteobacteria，除樣點DB1、DB5、QS外，其余樣點中Betaproteobacteria 的相對豐度在50.0%以上（圖4）。在基于dsrA基因的系統(tǒng)發(fā)育中，達巴（DB）地區(qū)熱泉樣點的 SOB 包含有Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia，卻色（QS）和嘎弄（GN）地區(qū)熱泉樣點的 SOB 含有 Betaproteobacteria 和Hydrogenophilalia，而濱達微（BDW）地區(qū)熱泉樣點中僅發(fā)現(xiàn)Betaproteobacteria，其 中Gammaproteobacteria 僅存在于DB7 樣點中，表明各地區(qū)熱泉水體中dsrA基因型SOB 在綱水平上群落結(jié)構(gòu)也存在差異。在屬水平上，GN 樣點的1 個OTU 與Ideonella相近（相似度>90.0%），DB7 樣點中7 個OTU 與Thiothrix（相似度為96.9%）相近。

圖3 基于Neighbor-joining 方法構(gòu)建的soxB 基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Neighbor-joining tree showing the phylogenetic relationships of the deduced soxB amino acid sequences translated from the soxB gene OTU clone sequences

圖4 基于Neighbor-joining 方法構(gòu)建的dsrA 基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Neighbor-joining tree showing the phylogenetic relationships of the deduced dsrA amino acid sequences translated from the dsrA gene OTU clone sequences

目水平上，西藏熱泉基于dsrA與soxB基因的SOB 優(yōu)勢菌及群落結(jié)構(gòu)存在差異?；赿srA基因的SOB 屬于Rhodocyclales、Nitrosomonadales、Burkholderiales、Hydrogenophilales以 及Thiotrichales，優(yōu)勢菌目為Rhodocyclales，除GN 樣點外，其余樣點中均存在Rhodocyclales，其相對豐度在各樣點中為33.3%－96.0%?；趕oxB基因的SOB 屬于 Nitrosomonadales、Burkholderiales、Hydrogenophilales、Rhodobacterales、Chromatiales，優(yōu)勢菌目為Nitrosomonadales，除了BDW 樣點外，Nitrosomonadales 相對豐度在各個樣品中占30.0%及以上。

2.4 影響微生物群落結(jié)構(gòu)的關鍵環(huán)境因子

通過環(huán)境因子與各樣點硫氧化菌相對豐度的RDA 分析表明，溫度、SO42?、S2?、pH、HCO3?等是影響西藏東北部熱泉水中硫氧化菌分布的關鍵環(huán)境因子（圖5）?；赿srA基因的RDA 分析表明（圖5a），GN、DB7 樣點的群落結(jié)構(gòu)分別明顯區(qū)別于其他樣點，其中影響DB7 樣點群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子為HCO3?濃度，而FeT濃度可能對GN 樣點群落結(jié)構(gòu)的影響較大（圖5a）。HCO3?是衡量堿度的離子之一，表明堿度可能對DB7 樣點中SOB 的影響較大。在基于soxB基因的RDA 分析中（圖5b），DB8 樣點的群落結(jié)構(gòu)區(qū)別于其他熱泉樣點，這可能是由于DB8 熱泉的水溫更低（(28.5±0.2) ℃）以及pH 值較高（8.01±0.01）（表1）。除DB8 樣點外，其他樣點的SOB 群落結(jié)構(gòu)的差異與SO42?濃度以及S2?濃度存在相關性（圖5b），表明除DB8 樣點外，其他樣點中SO42?濃度和S2?濃度更能影響熱泉中soxB基因型硫氧化菌的群落結(jié)構(gòu)。S2?與SO42?分別為硫氧化的底物與產(chǎn)物，其在熱泉中的含量影響SOB 的群落組成存在合理性。

圖5 基于各樣點dsrA 基因（a）與soxB 基因（b）的SOB 相對豐度與環(huán)境因子的相關性分析Figure 5 Correlation analysis of SOB relative abundance and environmental factors based on dsrA gene (a)and soxB gene (b)

2.5 不同硫氧化途徑微生物分布特征

通過qPCR 實驗得到西藏熱泉水體樣品中soxB、dsrA以及16S rRNA 基因的拷貝數(shù)，并計算出各個樣點中soxB與dsrA基因的相對豐度（表5），即樣品中soxB基因相對豐度范圍為 0.33%－11.80%，dsrA基因相對豐度范圍為0.61%－30.25%。由圖6 可以看出，雖soxB與dsrA基因相對豐度在各樣點中存在差異，但總體來看，這兩種基因的相對豐度在熱泉水體環(huán)境中相差不大，表明PSO 以及Dsr 均為熱泉水體中較為重要的硫氧化途徑。通過RDA 分析熱泉環(huán)境因子對硫氧化基因相對豐度的影響（圖7），結(jié)果顯示這兩種硫氧化基因的分布與熱泉水體的AsT濃度、ORP、SO42?濃度、S2?濃度等環(huán)境因子相關。RDA 分析顯示soxB基因相對豐度與SO42?濃度、ORP 呈正相關關系，與S2?濃度呈負相關關系（圖7），表明soxB基因型硫氧化菌更多地存在于偏氧化環(huán)境中，dsrA基因相對豐度與AsT濃度和HCO3?濃度呈正相關關系（圖7），表明dsrA基因型SOB 可能分布于砷濃度、堿度相對偏高的熱泉。

表5 各樣點中soxB 基因、dsrA 基因、細菌 16S rRNA 基因拷貝數(shù)及比例Table 5 Abundance and proportion of total bacterial 16S rRNA, soxB and dsrA genes as determined by qPCR

圖6 soxB 基因與dsrA 基因的相對豐度Figure 6 Relative abundance of soxB gene and dsrA gene

圖7 soxB 與dsrA 基因相對豐度與環(huán)境因子的RDA 分析Figure 7 RDA analysis of relative abundance of soxB and dsrA genes and environmental factors

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

以往的研究表明西藏熱泉沉積物基于soxB基因克隆文庫的 Chao 1 指數(shù)值為 1.0－13.0，Shannon_H 值最高為2.1（甄莉等，2019），與西藏東北部熱泉水體中基于soxB基因克隆文庫的Chao 1 指數(shù)值（3.0－12.0）和Shannon 指數(shù)值（0.9－2.9）相差不大，表明西藏熱泉的水體與沉積物中，基于硫氧化基因soxB的硫氧化菌群落α 多樣性指數(shù)差異不大。與其他環(huán)境中基于硫氧化基因soxB的硫氧化菌群落α 多樣性指數(shù)相比，該研究熱泉水中硫氧化基因soxB基因文庫的Chao 1 指數(shù)值（3.0－12.0）較小，Shannon 指數(shù)值（最大2.9）卻與其他環(huán)境的無明顯差異。例如海洋沉積物基于soxB基因的Chao 1 指數(shù)可達到104，但Shannon 指數(shù)最高只有4.46（張玉等，2018）；鹽堿湖基于soxB基因的Chao 1 指數(shù)可達25，而Shannon 指數(shù)最高也只有2.5（Yang et al.，2013）；五大連池火山群水體基于soxB基因Chao 1 指數(shù)最高為2 165.5，Shannon指數(shù)最低也只有3.71。熱泉基于soxB基因的Chao 1 指數(shù)值小于其他環(huán)境的Chao 1 指數(shù)值表明熱泉環(huán)境的SOB 物種數(shù)較低，這可能是由于熱泉具有有機物質(zhì)含量低、溫度高以及溶解氧含量低等特征（Shu et al.，2022）。甄莉等（2019）對西藏南部熱泉沉積物的研究也表明溶解有機碳含量越高，基于soxB基因的硫氧化菌α 多樣性越高。

該研究熱泉水中的SOB 主要為Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia，這與以往陸地熱泉硫氧化菌研究的結(jié)果具有一定相似性，但還缺少熱泉優(yōu)勢菌綱Aquificae。以往的研究發(fā)現(xiàn)Aquificae 廣泛存在于60 ℃以上、高硫化物（12 mg·L?1）熱泉中（Skirnisdottir et al.，2000），而本研究中西藏東北部熱泉的溫度普遍低于60 ℃且硫化物質(zhì)量濃度較低[(0.80±0.04)－(2.56±0.02) mg·L?1]。西藏東北部熱泉的SOB 優(yōu)勢菌綱（Betaproteobacteria）與深海熱液的 SOB 優(yōu)勢菌綱（ Gammaproteobacteria、Epsilonproteobacteria）（Wang et al.，2018）存在差異，雖然深海熱液與陸地熱泉同為熱環(huán)境，但這兩種環(huán)境的形成機制與化學成分的差異（Lu et al.，2021）可能導致兩種熱環(huán)境的優(yōu)勢SOB 不同。此外，Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria 與Gammaproteobacteria 也是西藏南部熱泉沉積物中發(fā)現(xiàn)的主要硫氧化菌綱（甄莉等，2019），這表明在綱水平上，西藏熱泉水體與沉積物兩種介質(zhì)中的基于soxB基因的硫氧化菌具有一致性。熱泉水中不同的硫氧化途徑可能由不同的SOB 主導，結(jié)合前人研究還發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境中主導相同硫氧化途徑的SOB 也可能不同。例如本研究西藏東北部熱泉中基于dsrA基因與soxB基因的優(yōu)勢菌目分別為Rhodocyclales 與Nitrosomonadales；而前人對珠江水體中硫氧化菌的研究表明基于dsrA基因與soxB基因優(yōu)勢菌目分別為 Nitrosomonadales 與Burkholderiales（Luo et al.，2018）。此外，在本研究的熱泉水與前人研究的熱泉沉積物這兩種介質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)了 Rhodocyclales、Nitrosomonadales、Burkholderiales、Rhodobacterales 以及Chromatiales，但熱泉水中未發(fā)現(xiàn) Neisseriales、Rhizobiales、Rhodospirillales；沉積物中未發(fā)現(xiàn)Thiotrichales（甄莉等，2019），這可能是由于研究介質(zhì)和區(qū)域的不同，溫度、pH 等各種理化參數(shù)也存在較大差異。總的來說，結(jié)合以往的研究，可以發(fā)現(xiàn)，各環(huán)境中優(yōu)勢SOB 在綱水平上多為Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria 和Epsilonproteobacteria，由此可見，Proteobacteria 門可能是各環(huán)境中硫氧化的主導微生物。

在屬水平上，西藏東北部熱泉水中基于soxB基因的硫氧化菌多是常見的硫氧化菌，如Thiobacillus、Sulfuricella、Sulfuriferula，Sphaerotilus、Comamonas的某些菌株能進行硫代硫酸鹽的氧化（Pandey et al.，2009；Watanabe et al.，2016）。Paracoccus是常見的無色硫細菌屬，在好氧條件下進行硫氧化。Thiocapsa與Thioalkalivibrio均為紫硫菌，在光照厭氧條件下進行硫代硫酸鹽的氧化，并可能產(chǎn)生代謝中間產(chǎn)物單質(zhì)硫（劉陽等，2018）。RoseinatronobacterthiooxidansALG1 是一個嚴格的有氧和專性異養(yǎng)菌，在硫代硫酸鹽存在的情況下，其對有機碳的利用效率顯著提高（Sorokin et al.，2000），表明西藏熱泉中的硫循環(huán)與碳循環(huán)可能存在聯(lián)系。在基于dsrA基因的硫氧化菌中，Thiothrix能將H2S 氧化為硫粒積累在菌體內(nèi)，后又能將硫粒氧化為SO42?（Chernitsyna et al.，2020）。研究發(fā)現(xiàn)Thiothrix能在高堿度（750 mg·L?1）好氧顆粒污泥中存在，與堿度呈一定的正相關關系（Gao et al.，2019）且Thiothrix更適應低溫環(huán)境（Abusam et al.，2019）?；赿srA基因的硫氧化菌還包含有Ideonella，該菌屬在熱泉中并不常見，僅在2002 的一篇文章中發(fā)現(xiàn)熱泉篩選到的某菌株的16S rRNA 基因與Ideonelladechloratans相似性較高（相似度92.1%）（Takeda et al.，2002），而Ideonella的硫氧化功能鑒定還未見相關報道。從結(jié)果來看，關于熱泉dsrA基因型SOB 在屬水平上的多樣性有待進一步研究。

西藏東北部熱泉水中硫氧化菌的群落結(jié)構(gòu)受堿度、pH、溫度、FeT、SO42?、S2?等環(huán)境因子的影響，這些環(huán)境因子在其他環(huán)境中也表現(xiàn)出對SOB 的影響。Gupta et al.（2022）的研究表明堿度影響著生物脫硫反應器中SOB 的群落組成。Luo et al.（2018）與楊磊等（2020）分別發(fā)現(xiàn)SO42?與S2?也對火山土壤、珠江中硫氧化菌的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。鐵離子與硫氧化菌存在一定相關性，例如硫氧化菌Sulfobacillusthermosulfidooxidans能在有氧條件下氧化亞鐵離子（Zhang et al.，2019）；Zhao et al.（2020）的研究表明Thiobacillussp.還能在厭氧條件下通過異化Fe(III)還原獲得能量，然后將單質(zhì)硫氧化為硫酸鹽。溫度和pH 是影響溫泉微生物分布的兩個最重要的控制因素，例如，在滇西南熱泉中，微生物的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與pH 以及溫度的相關性（Guo et al.，2021）。研究表明細菌群落可能會隨著pH 值的適度變動而變化，且pH 值可能通過直接生理機制影響細菌群落，也可能反映其他未測量因素的間接影響（Chen et al.，2020）。此外，在西藏南部熱泉沉積物硫氧化菌的研究中，基于soxB基因的SOB 群落組成也受到溫度、pH 以及硫化物濃度的影響（甄莉等，2019），表明溫度、pH 以及硫化物濃度可能是影響西藏熱泉水體以及沉積物中基于soxB基因SOB 群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子。

該研究熱泉水中soxB基因型硫氧化菌更多地存在于偏氧化環(huán)境中，邵博（2019）的研究也顯示氧氣濃度的增加能提高水體中soxB基因的表達豐度。另外，微生物硫氧化PSO 途徑的Sox 系統(tǒng)不僅能將硫代硫酸鹽直接氧化為硫酸鹽，而且還能將HS?和S0作為適當?shù)闹虚g體通過酶促或非酶促結(jié)合到載體蛋白SoxY 中氧化硫化物和硫（Wu et al.，2021），說明Sox 系統(tǒng)在熱泉更多的硫氧化途徑中起重要作用。砷在本研究熱泉水中濃度較高且可能影響含dsrA基因SOB 的分布，除熱泉外，前人的研究表明高砷地下水中dsrA基因豐度也與As 濃度存在關系，即呈正相關（Li et al.，2017），這可能是由于硫和砷往往共存于環(huán)境中，并具有相似的微生物氧化還原轉(zhuǎn)化（Wang et al.，2018）。此外，dsrA編碼的蛋白是一種雙向蛋白酶，能進行亞硫酸鹽的還原以及胞內(nèi)單質(zhì)硫的氧化，所以高砷地下水中基于dsrA基因的硫相關微生物不僅包括硫氧化菌，還發(fā)現(xiàn)典型硫酸鹽還原菌Desulfovibrio、Desulfobulbus等（Li et al.，2017），表明在高砷（規(guī)定飲用水中砷含量≤10 μg·L?1）環(huán)境中，As 濃度可能還影響著硫酸鹽還原菌，因此可看出砷可能是影響高砷環(huán)境中硫循環(huán)微生物的關鍵環(huán)境因子。反之，硫循環(huán)微生物又影響著高砷環(huán)境中砷形態(tài)和價態(tài)的轉(zhuǎn)變，例如某些硫循環(huán)微生物可直接氧化三價砷；或氧化硫/還原硫酸鹽造成亞砷酸鹽與硫代硫酸鹽之間的形態(tài)轉(zhuǎn)變（Wang et al.，2018）；或促進含砷硫化礦物的形成與溶解（Zecchin et al.，2019）。綜上所述，硫循環(huán)微生物與高砷環(huán)境中的砷含量息息相關，了解環(huán)境中硫循環(huán)微生物與砷的關系有助于了解環(huán)境中砷的遷移轉(zhuǎn)化以及對砷污染的修復。

3.2 結(jié)論

西藏東北部熱泉水中硫氧化菌主要為Betaproteobacteria，此外，還包括Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Hydrogenophilalia。不同硫氧化途徑由不同SOB 主導，其中基于dsrA基因的優(yōu)勢硫氧化菌目為Rhodocyclales（33.3%－96.0%），基于soxB基因的優(yōu)勢硫氧化菌目為Nitrosomonadales（30.0%－91.7%）。溫度、SO42?、S2?、pH 等環(huán)境因子是影響西藏熱泉水樣中SOB 的分布的關鍵環(huán)境因子，soxB基因型SOB 主要分布于偏氧化的熱泉，而dsrA基因型SOB 主要分布于砷濃度和堿度相對偏高的熱泉。