李玲玲 林斯曉 周文英 彭曉謀

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤,也是我國第三大腫瘤致死病因[1]。其發(fā)病隱匿、進展快、惡性程度高、預(yù)后差,嚴(yán)重威脅著人類健康。在治療上Ⅰ和Ⅱ期患者以手術(shù)(肝切除術(shù)和肝移植術(shù))為主,對Ⅲb期的晚期患者除了放療、經(jīng)導(dǎo)管動脈化學(xué)栓塞( transcatheter arterial chemoembolization,TACE)等治療手段外結(jié)合靶向治療亦可使患者獲益[1]。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)作為細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,密切參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,可作為癌癥治療的重要靶點[2]。目前,以 STAT3 為靶點開發(fā)抗腫瘤藥物的研究越來越多。S3I-201是近年來鑒定出的一個 STAT3小分子抑制劑,能特異結(jié)合在STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域,從而阻斷STAT3的磷酸化/活化、STAT3-STAT3復(fù)合物形成及細胞核內(nèi)STAT3-DNA結(jié)合活性,并最終抑制依賴于STAT3的轉(zhuǎn)錄活性[3]。S3I-201優(yōu)先作用于持續(xù)性表達STAT3活化蛋白的腫瘤細胞,誘導(dǎo)其生長抑制和凋亡發(fā)生[4-6]。本文旨在探討S3I-201對肝癌細胞BEL-7402的增殖、細胞周期和細胞凋亡等的影響,為肝癌相關(guān)的靶向藥物研發(fā)和治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM、FBS、PBS 購自美國 Gibco公司;BEL-7402保存于中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院中心實驗室;細胞培養(yǎng)皿(板);STAT3 抑制劑( 商品名 S3I-201)購自美國MCE公司;Cell Couting Kit-8(CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒及Annexin V-FITC 凋亡試劑盒購自日本Dojindo公司;磷酸化STAT3、Bcl-2、Bax抗體購自美國Cell Signaling Technology (CST)公司;內(nèi)參抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗小鼠購自Proteintech公司;EdU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司;預(yù)染蛋白質(zhì)Marker為Thermofisher產(chǎn)品;蛋白提取RIPA試劑、BCA蛋白定量試劑盒、脫脂奶粉、PVDF膜浸潤活化液、細胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;預(yù)制蛋白電泳凝膠為EZBiolab產(chǎn)品; Western blot 化學(xué)發(fā)光劑購自上海天能(Tanon)科技有限公司;FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗、DAPI染色液、抗淬滅封片劑購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;Q-PCR引物、RT試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTM購置TakaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人肝癌細胞BEL-7402 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(100 U/mL青霉素,100 μg/mL鏈霉素),在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。1～2 d換液,每3～4 d 進行傳代,實驗時選用對數(shù)生長期的細胞,取生長良好的3～6代用于實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 以對數(shù)生長期的BEL-7402細胞進行實驗,按照不同實驗條件處理后進行檢測。每孔加入10 μl CCK-8溶液,培養(yǎng)箱中孵育2 h,置于酶標(biāo)儀中于450 nm下讀取OD值,根據(jù)公式:細胞存活率%=(加藥孔OD-空白OD)/(對照孔OD-空白OD)×100%,計算不同S3I-201濃度的細胞存活率,實驗重復(fù)3次,繪制細胞增殖曲線,計算IC50值。

1.2.3 EdU細胞增殖檢測 取對數(shù)生長期的細胞,以每孔1×105細胞接種于12孔板中,培養(yǎng)24 h后,S3I-201處理48 h,之后用20 μM溶液孵育標(biāo)記6 h,PBS洗滌1～2次,每次5 min,4%多聚甲醛固定30 min,2 mg/mL的甘氨酸孵育5 min中和過量的醛基,PBS洗滌,0.5% TritonX-100通透細胞,1×Apollo和1×Hoechst33342染色、PBS洗滌后,用抗熒光淬滅封片劑封片,于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 流式細胞術(shù)進行細胞周期和細胞凋亡檢測 細胞凋亡檢測:藥物處理后的細胞經(jīng)胰酶消化后用1×AnnexinⅤ Binding Solution制備成終濃度為1×106/mL的單細胞懸液,取100 μL該細胞懸液依次加入AnnexinⅤ,FITC結(jié)合物及PI Solution,室溫下避光孵育15 min,加入400 μL 1×AnnexinⅤBinding Solution,在1h內(nèi)完成檢測。對照細胞設(shè)置了未染色組、AnnexinⅤ-FITC染色組及PI染色組,分別用于上機(Beckman Coulter Epics-XL)檢測中的電壓和補償調(diào)節(jié)。細胞周期檢測:采用PI染色法。用6孔細胞培養(yǎng)板接種細胞,每孔1.5×106個,細胞處于對數(shù)生長期,60%～70%匯合度后更換成含藥培養(yǎng)液,分別處理0 h、24 h、48 h后,收集細胞檢測;胰酶消化細胞1000 rpm,5 min沉淀細胞后,先用預(yù)冷的PBS洗2次,再1000 rpm,5 min沉淀細胞;重懸后的細胞懸液1000 rpm,5 min離心后,用1 mL預(yù)冷的70%乙醇輕混勻,4 ℃固定2 h以上,然后1000 g離心5 min沉淀細胞,預(yù)冷PBS洗一次,1000 g離心5 min再次沉淀細胞,加RNase A溶液及PI染色后上機檢測,應(yīng)用ModFit LT 5.0軟件對細胞周期檢測的原始數(shù)據(jù)進行擬合。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)檢測 收集處理后的細胞,RIPA提取總蛋白,BCA法測定總蛋白濃度,取30 μg蛋白樣品上樣,經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,洗膜后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h,磷酸化STAT3、Bcl-2、Bax及內(nèi)參抗體均以1∶1000 4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌后,加入HRP標(biāo)記的特異性二抗以1∶10000室溫孵育1 h,ECL發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 S3I-201對BEL-7402細胞增殖的影響

S3I-201對BEL-7402細胞體外增殖的影響分別采用CCK-8和EdU法進行檢測,結(jié)果分別見圖1和圖2。經(jīng)不同濃度的S3I-201作用48 h后,隨著藥物濃度的增加BEL-7402細胞存活率呈現(xiàn)不同程度的下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.50,P=0.0001),其中藥物濃度為280 μM時即對細胞增殖的抑制作用達顯著水平(P<0.05)。IC50=343.9 μM。

圖1 S3I-201作用48 h對BEL-7402細胞體外增殖的劑量依賴性抑制作用

圖2 S3I-201對BEL-7402細胞增殖的抑制作用(×200)

采用EdU增殖法檢測S3I-201對BEL-7402細胞增殖的影響, 結(jié)果顯示:與對照組相比280 μM的S3I-201能顯著抑制BEL-7402細胞的增殖(圖2)。

2.2 S3I-201對BEL-7402細胞凋亡的影響

根據(jù)CCK-8結(jié)果,S3I-201的工作濃度采用230 μM,在此濃度下藥物可以發(fā)揮作用而又能使細胞保持較高的存活率。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示(圖3),S3I-201作用24 h后,發(fā)生早期凋亡(右下象限)的細胞比對照組顯著增加(P<0.05),藥物作用48 h后,發(fā)生早期凋亡的細胞急劇增加(P<0.001),達60.7%;S3I-201誘導(dǎo)BEL-7402細胞發(fā)生晚期凋亡的情況與誘導(dǎo)發(fā)生早期凋亡類似,即:藥物作用24 h后,發(fā)生晚期凋亡(右上象限)的細胞比對照組顯著增加(P<0.05), 48 h后,發(fā)生晚期凋亡的細胞數(shù)目急劇增加(P<0.001),達28.5%。

A為流式散點圖; B為析因設(shè)計的方差分析。圖3 S3I-201對BEL-7402細胞凋亡的影響

2.3 S3I-201對BEL-7402細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

用230 μM的S3I-201處理BEL-7402細胞后,提取細胞總蛋白進行Western blotting檢測。結(jié)果表明,S3I-201能極顯著下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(P<0.05),顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(P<0.05)(圖4)。

2.4 S3I-201對BEL-7402細胞周期的影響

將230 μM的S3I-201分別與BEL-7402細胞共培養(yǎng)24 h及48 h,結(jié)果顯示與對照組相比,共培養(yǎng)24 h后處于細胞周期不同時相(G0/G1,S,G2/M)的細胞數(shù)目沒有顯著變化(P>0.05);共培養(yǎng)48 h后G0/G1期的細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05),S期細胞數(shù)量顯著升高(P<0.05),而G2/M的細胞比例沒有顯著變化(P>0.05)?？梢?S3I-201能將BEL-7402阻滯于S期,從而影響其增殖(圖5)。

A為擬合的細胞周期圖; B為析因設(shè)計的方差分析。圖5 S3I-201對BEL-7402細胞周期的影響

3 討論

隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等組學(xué)及分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,肝癌靶向治療成為了傳統(tǒng)治療外非常重要的一種治療手段[7-8]。近年來,除索拉非尼(SOR)外,侖伐替尼、瑞戈非尼及卡博替尼等靶向藥物陸續(xù)在國內(nèi)外上市,很大程度上提高了對肝癌的療效[9-10]。因此,開發(fā)新的靶向藥物以用于改善晚期肝癌患者的生存質(zhì)量也是未來研究工作的重要方向之一。

Janus 激酶(Janus kinase,JAK)-STAT 信號通路主要介導(dǎo)由細胞膜向細胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并激發(fā)轉(zhuǎn)錄過程。其中,STAT3作為STAT家族成員在許多癌癥中持續(xù)性高表達。持續(xù)活化的 STAT3進一步促進癌腫發(fā)展以及產(chǎn)生抗癌藥物抵抗,STAT3已成為治療癌癥的引人注目的靶點。目前,STAT3 非多肽類小分子抑制劑得到了迅速的發(fā)展,其中,基于計算機輔助藥物篩選技術(shù)得到的化合物S31-201及其衍生物是直接靶向STAT3蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域的小分子抑制劑。在本研究中,我們用S31-201對人BEL-7402肝癌細胞進行了量效和時效關(guān)系研究,結(jié)果表明:藥物濃度在0～400 μM區(qū)間時,隨著藥物濃度逐漸加大,對細胞的殺傷作用越顯著,最高達80%以上;分別于0 h、12 h、24 h、48 h、60 h等時間點用230 μM的S31-201進行時效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn),藥物作用24 h以前未見對細胞的明顯殺傷作用,但隨著作用時間的延長細胞存活率明顯下降,48 h存活率約80%,60 h時下降到約60%。

阻滯細胞周期和誘導(dǎo)細胞凋亡是抗癌藥物發(fā)揮作用的重要方式。本實驗中我們的結(jié)果顯示:S31-201能阻斷BEL-7402肝癌細胞S期DNA的復(fù)制,發(fā)生細胞周期S期阻滯。當(dāng)前抗肝癌藥物引起肝細胞癌發(fā)生周期阻滯的諸多研究中,肝癌細胞發(fā)生G0/G1、S及G2/M期阻滯均有報道[11-13],但以S期阻滯最為多見,推測與受試對象如藥物、細胞株、動物或組織等的不同有關(guān)。

細胞凋亡是一個主動死亡過程,可以被多種內(nèi)在或外在的刺激誘發(fā),是細胞對刺激的應(yīng)答反應(yīng)。本研究根據(jù)CCK-8的結(jié)果,選擇了230 μM的S31-201流式Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測BEL-7402肝癌細胞的凋亡情況,結(jié)果顯示隨著S3I-201作用時間的延長不管是早期凋亡還是晚期凋亡率都明顯增加。進一步用Western blot檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達情況,結(jié)果顯示S3I-201能夠下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達。

綜上所述,STAT3小分子抑制劑S31-201能夠在體外阻滯BEL-7402肝癌細胞周期,使其停滯于S期,抑制BEL-7402的增殖,通過下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax 的表達誘導(dǎo)細胞凋亡,更深入的分子機制以及在動物模型中的驗證工作仍在進行中。

該研究結(jié)果將為靶向STAT3的小分子藥物的作用機理及潛在的臨床應(yīng)用提供一些有益的線索。