董海城 許榕榕 王雯菲 張瑤 朱世峰

肥胖病是全球最常見的流行病之一,是心腦血管疾病、2型糖尿病等的危險因素[1,2]。針刺治療肥胖療效肯定,其確切機(jī)制目前尚不明確。近年來較多研究表明肥胖與線粒體功能受損關(guān)系密切[3,4],線粒體作為能量代謝的重要場所,其數(shù)量和功能的“質(zhì)量控制”能維持健康的線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài),線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失衡在肥胖發(fā)生發(fā)展的過程中起重要作用。而腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作為能量感受器,對線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的各個方面具有特定的調(diào)節(jié)作用,已成為防治肥胖、糖尿病等代謝性疾病的重要靶點(diǎn)[5,6]。本文擬從AMPK、線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的角度闡釋兩者之間的相關(guān)性,并初步探討針刺干預(yù)肥胖的潛在機(jī)制,為后續(xù)的相關(guān)研究提供理論指導(dǎo)。見圖1。

圖1 AMPK調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)示意圖

1 線粒體與肥胖

肥胖發(fā)生的根本原因是能量攝入大于消耗,線粒體有“能量工廠”之稱,是細(xì)胞能量產(chǎn)生的關(guān)鍵。肥胖及相關(guān)疾病發(fā)生的早期事件是各組織中線粒體密度減少和氧化代謝減少。研究表明,高脂喂養(yǎng)大鼠脂肪滴堆積,線粒體受損、腫脹或融合,纖維排序紊亂或纖維結(jié)構(gòu)異常[7]。

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化(OXPHOS)的場所,能氧化三大營養(yǎng)物質(zhì)生成為細(xì)胞生命活動提供能量的三磷酸腺苷(ATP),是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場所,也是細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的最主要來源。大多數(shù)線粒體蛋白質(zhì)由核基因(nDNA)編碼,而極小部分由線粒體基因(mtDNA)編碼,mtDNA缺乏nDNA中核小體的保護(hù),也沒有一個DNA修復(fù)機(jī)制,容易導(dǎo)致mtDNA的損傷和消耗[8,9]。肥胖的動物模型和人類脂肪組織中mtDNA拷貝數(shù)及蛋白表達(dá)均減少。mtDNA損傷的量化以及mtDNA拷貝數(shù)的分析和量化可能是肥胖及相關(guān)疾病進(jìn)展和預(yù)后的生物標(biāo)志物[10]。

線粒體主要分布在能量需求大的組織,如骨骼肌、心臟、肝臟等,人體骨骼肌中線粒體的含量隨著運(yùn)動而增加并在停止訓(xùn)練期間減少,骨骼肌缺失引起少肌型肥胖[11]。棕色脂肪組織(BAT)也含有大量線粒體,其特異性解偶聯(lián)作用,使脂肪酸分解產(chǎn)生的能量的轉(zhuǎn)化為熱能,起到減肥的作用?？傊?骨骼肌與BAT中線粒體的數(shù)量與超重、肥胖呈負(fù)相關(guān)[12]。

線粒體是高度動態(tài)運(yùn)行的細(xì)胞器,經(jīng)歷不斷的線粒體融合和裂變、線粒體生物合成和線粒體自噬,協(xié)調(diào)控制線粒體的形態(tài)、數(shù)量、質(zhì)量、周轉(zhuǎn)和遺傳,能維持健康的線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài),維持穩(wěn)定的ATP產(chǎn)出。肥胖是一種慢性營養(yǎng)障礙性疾病,而營養(yǎng)狀態(tài)的改變可以雙向調(diào)節(jié)線粒體的形態(tài)和功能[13],肥胖狀態(tài)下線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡。

2 AMPK與肥胖

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,結(jié)構(gòu)上由α、β和γ這3個亞基組成,用作細(xì)胞能量感受器,可以促進(jìn)骨骼肌葡萄糖攝取和脂肪酸氧化,減少肝糖原合成,抑制脂肪酸和蛋白合成。ATP作為能量來源,相繼被分解為二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)。當(dāng)體內(nèi)能量缺乏時,如低氧、缺血及OXPHOS受抑制時,伴隨著AMP/ATP、ADP/ATP比值的升高,AMPK被磷酸化和激活,從而激活A(yù)TP再生途徑,同時抑制ATP消耗途徑。

肥胖是慢性能量失衡引起的,肥胖與AMPK之間呈負(fù)相關(guān),AMPK活性降低與重度肥胖個體的內(nèi)臟脂肪組織炎癥和全身胰島素抵抗增加有關(guān)[14]。多項(xiàng)研究表明,肥胖大鼠肝臟、腎臟、骨骼肌和脂肪等外周組織中AMPK磷酸化水平下降[15-18],而AMPK激動劑AICAR處理肥胖大鼠可以促進(jìn)脂肪酸氧化,增加能量的消耗,降低大鼠體質(zhì)量[19]。

藥物二甲雙胍除了降糖還能減輕體重,主要通過激活A(yù)MPK[20]發(fā)揮作用。許多AMPK活化療法,在肥胖及糖尿病等代謝疾病中具有巨大的治療潛力。研究表明,電針高脂喂養(yǎng)大鼠后骨骼肌AMPK蛋白表達(dá)水平升高[7]。糖尿病心肌病小鼠經(jīng)電針干預(yù)后AMPK磷酸化水平顯著升高,并降低血糖[21]。電針還能通過增強(qiáng)AMPK表達(dá),改善大鼠缺血性腦中風(fēng)、失眠及慢性疲勞綜合征等[22-24]。針刺通過激活A(yù)MPK,如何調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài),達(dá)到減肥目的是本文探討的方向。

3 基于線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)探討針刺調(diào)控AMPK表達(dá)治療肥胖的機(jī)制

3.1 線粒體生物合成 線粒體生物合成能產(chǎn)生更多新的線粒體,提高ATP水平,增加能量消耗,改善肥胖。有研究表明,肥胖機(jī)體的線粒體生物合成處于降低的狀態(tài)[25,26]。運(yùn)動和肌肉活動會誘導(dǎo)線粒體生物合成,運(yùn)動也是AMPK的有效激活劑,提示AMPK可能參與了線粒體生物合成。研究證明,慢性AMPK激活導(dǎo)致線粒體生物合成增加[27]。此外,在小鼠中過度表達(dá)的構(gòu)成型活性AMPKγ3亞基突變會誘導(dǎo)線粒體生物合成[28];而AMPKα亞基敲除和AMPK顯性失活的小鼠均呈現(xiàn)線粒體生物合成和功能的缺陷[29,30]?？傊?AMPK為線粒體生物合成的主要調(diào)節(jié)因子之一。

AMPK可直接調(diào)節(jié)過氧化物酶體增值物激活受體γ輔助活化因子-1α(PGC-1α)的功能促進(jìn)線粒體生物合成:AMPK可直接磷酸化PGC-1α蛋白的Thr177和Ser538殘基[31],能激活不同的轉(zhuǎn)錄因子如核呼吸因子(NRFS)1和2,及雌激素相關(guān)受體-α(ERR-α),促進(jìn)線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)的表達(dá),驅(qū)動mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[32-34];同時,NRFS誘導(dǎo)參與OXPHOS的基因轉(zhuǎn)錄,并將細(xì)胞核編碼的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體[35,36],從而促進(jìn)線粒體生物合成[27,37,38]。

有研究表明,在癌細(xì)胞中,PGC-1α、NRF1和TFAM表達(dá)增加的同時線粒體數(shù)量卻在減少[39,40],TFAM水平的提高和mtDNA拷貝數(shù)、mtDNA編碼多肽的表達(dá)不一定呈正相關(guān)[41]。故線粒體生物合成發(fā)生的標(biāo)志是mtDNA拷貝數(shù)、mtDNA/nDNA的比值升高及mtDNA表達(dá)水平升高[41]。

湯倩倩[42]通過電針提高肥胖大鼠腹股溝白色脂肪組織(WAT)中AMPK磷酸化的蛋白水平,上調(diào)PGC-1α-TFAM-UCP1通路的表達(dá),降低大鼠體質(zhì)量可能與促進(jìn)WAT線粒體生物合成有關(guān),但該實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行mtDNA拷貝數(shù)、nDNA拷貝數(shù)的測量。筆者認(rèn)為,在線粒體生物合成方面,今后研究探討方向?yàn)?針刺提高肥胖大鼠AMPK表達(dá)水平,激活下游因子PGC-1α及相關(guān)通路,能否促進(jìn)mtDNA拷貝數(shù)、mtDNA/nDNA的比值升高及mtDNA表達(dá)水平升高,而AMPK基因敲除后,針刺是否還能激活下游因子促進(jìn)線粒體合成。

3.2 線粒體自噬 線粒體自噬是一種選擇性清除線粒體的模式[43],主要負(fù)責(zé)消除受損的線粒體,受損線粒體被隔離在雙膜囊泡中,形成稱為自噬體的雙膜結(jié)構(gòu),自噬體與溶酶體融合形成自溶酶體,其中自噬體的內(nèi)容物將發(fā)生水解降解[44]。在低氧條件下,線粒體的OXPHOS功能受到抑制,導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生更多的ROS,對mtDNA、線粒體脂質(zhì)和蛋白造成氧化損傷,而線粒體自噬能通過特異性降解受損的線粒體來防止進(jìn)一步的損傷,保護(hù)細(xì)胞存活。

AMPK對線粒體自噬的調(diào)節(jié)主要通過絲氨酸/蘇氨酸激酶Atg1和Unc-51樣激酶1(ULK1)發(fā)揮作用,ULK1是酵母Atg1的同源物。其中,AMPK-ULK1軸對線粒體自噬很重要[45],AMPK通過ULK1在幾個主要位點(diǎn)(包括Ser555[46]、Ser317和Ser777)的磷酸化直接激活自噬和線粒體自噬,AMPK或ULK1的缺乏會導(dǎo)致自噬接頭p62的異常積累和線粒體自噬缺陷[46],而ULK1的突變體不能被AMPK磷酸化,則細(xì)胞表達(dá)出更多的受損線粒體。

有研究表明,經(jīng)針刺干預(yù)腦出血大鼠后腦內(nèi)結(jié)構(gòu)損傷較少,自噬泡多于模型組,而針刺干預(yù)前經(jīng)自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)處理后,線粒體自噬蛋白水平降低,并逆轉(zhuǎn)針刺療法對神經(jīng)功能缺損改善的情況,提示針刺可通過增強(qiáng)線粒體自噬來減輕腦出血后的神經(jīng)損傷[47-49],Zhou等[50]可視化和定量測量自噬活性結(jié)果表明大鼠衰老模型自噬能力下降,經(jīng)穴位埋線和自噬促進(jìn)劑干預(yù)后自噬能力下降趨勢緩和,但這種影響被3-MA處理消除,提示穴位埋線有介導(dǎo)線粒體自噬作用。董佳梓[51]發(fā)現(xiàn)針刺足三里可能是通過AMPK/ULK1信號通路,有效地提高大鼠骨骼肌線粒體自噬水平,維持大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

線粒體自噬與針刺治療腦病是目前主流的研究熱點(diǎn),現(xiàn)國內(nèi)外鮮見針刺調(diào)節(jié)線粒體自噬與肥胖關(guān)系的研究,且針刺能增強(qiáng)線粒體自噬是否與AMPK/ULK1信號通路有關(guān),有待進(jìn)一步證明。

3.3 線粒體融合、裂變 線粒體是不斷融合和裂變的動態(tài)細(xì)胞器[52],共同平衡控制著線粒體的形狀、數(shù)量和大小,對于線粒體功能和遺傳很重要[53]。2個受損線粒體相遇后經(jīng)歷融合、分裂產(chǎn)生電位不均勻的子線粒體,具有更健康膜電位的子線粒體將繼續(xù)參與線粒體網(wǎng)的融合和裂變循環(huán),但去極化的子線粒體不再執(zhí)行功能,常通過線粒體自噬降解。

在分子水平上,線粒體融合和裂變由關(guān)鍵的線粒體膜蛋白調(diào)節(jié)。線粒體外膜融合由MFN1/2介導(dǎo)[54],線粒體內(nèi)膜融合由視神經(jīng)萎縮1(Opa1)介導(dǎo)[55]。介導(dǎo)線粒體分裂的是一種大型GTP酶(Drp1),通過一組受體蛋白(MFF、Fis1、MiD49和MiD50)被募集到線粒體外膜參與線粒體裂變。

研究表明,在沒有線粒體損傷的情況下,通過直接小分子激活劑激活A(yù)MPK足以誘導(dǎo)線粒體裂變[56]。Toyama等[56]發(fā)現(xiàn)MFF上兩個磷酸化位點(diǎn)Ser155和Ser173是AMPK的新底物,活化的AMPK可以誘導(dǎo)MFF以促進(jìn)Drp1從胞質(zhì)溶膠募集到線粒體表面并參與線粒體裂變過程。而分子水平上關(guān)于AMPK與線粒體融合的研究較少,有研究表明蟲草素能激活A(yù)MPK同時也能上調(diào)糖尿病小鼠Mfn2相對mRNA及蛋白表達(dá)[57],AMPK可能是Mfn2的上游調(diào)節(jié)劑[58]。

肥胖人群組織以線粒體裂變?yōu)橹?線粒體融合受到抑制。肥胖人群或小鼠2型糖尿病模型的肌肉中線粒體尺寸減小,并伴有Mfn2的表達(dá)減少[59],同樣,營養(yǎng)過剩會誘導(dǎo)胰腺β細(xì)胞中的線粒體斷裂,是由線粒體融合的抑制介導(dǎo)的[60]。研究發(fā)現(xiàn)Mfn1可以在高脂飲食刺激下保護(hù)線粒體呼吸功能[61],Mfn2也會通過AMPK途徑上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)[62],Mfn1和Mfn2均能改善胰島素抵抗,且骨骼肌中Mfn2的缺失會導(dǎo)致促糖尿病作用[63],提示促進(jìn)線粒體融合療法可能降低體質(zhì)量,改善胰島素抵抗。張婧怡[64]通過電針胰島素抵抗大鼠穴位改善了大鼠線粒體結(jié)構(gòu),骨骼肌Drp1、Fis1蛋白表達(dá)得到抑制,Mfn1、Mfn2表達(dá)等得到保護(hù)性維持,證明電針對胰島素抵抗大鼠具有抑制線粒體分裂、促進(jìn)線粒體融合的作用。

根據(jù)目前的研究,AMPK激活能誘導(dǎo)線粒體裂變,對于改善肥胖似無益處。是否能在MFN1/2、Opa1上發(fā)現(xiàn)AMPK新底物,針刺激活A(yù)MPK后最終達(dá)到促進(jìn)線粒體融合、抑制線粒體裂變的作用而緩解肥胖及相關(guān)并發(fā)癥是一個新的研究方向。

4 討論

中醫(yī)學(xué)對肥胖的認(rèn)識始于《黃帝內(nèi)經(jīng)·靈樞·衛(wèi)氣失常》:“人有肥、有膏、有肉…腘肉堅(jiān),皮滿者,肥。腘肉不堅(jiān),皮緩者,膏。皮肉不相離者,肉?！嗾?多氣而皮縱緩,故能縱腹垂腴。肉者,身體容大。脂者,其身收小……”將肥胖分為“脂人、膏人、肉人”,脂人肥大卻身形較小,似“均一性肥胖”;膏人肥肉多而松軟下垂,似“中心性肥胖”,肉人身體寬大,骨骼肌肉壯實(shí),似“壯實(shí)之人”。

朱丹溪《丹溪治法心要》提出“肥白人多痰濕”、“肥白之人,沉困怠惰是氣虛”,劉河間云:“肥人腠理致密,而多郁滯,氣血難以通利”,提示肥人多痰濕和少氣,病程日久,氣虛血瘀或痰濕瘀互結(jié)是病理發(fā)展的必然結(jié)果。針刺減肥有辨證取穴,達(dá)到平衡陰陽、調(diào)理臟腑、運(yùn)行氣血及疏通經(jīng)絡(luò)的作用,相對于藥物和手術(shù)療法,安全有效、不易反彈[65],在臨床上已被廣泛應(yīng)用。針刺減肥的主流方式主要有普通毫針針刺、電針和穴位埋線。穴位埋線是根據(jù)針灸學(xué)理論,通過針具將外科可吸收縫線埋在穴位內(nèi)產(chǎn)生針刺效應(yīng)來發(fā)揮作用,相對于普通針刺有作用持久、患者依從性好的優(yōu)點(diǎn)。

在肥胖條件下線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡被打破,線粒體不僅形態(tài)變小,而且線粒體的合成、自噬及融合能力均受到抑制[66],ROS產(chǎn)生增加,導(dǎo)致新線粒體合成減少,衰老、損傷線粒體增加。目前研究表明,針刺能有效激活A(yù)MPK,并間接通過PGC-1α依賴性轉(zhuǎn)錄刺激線粒體生物合成―增加線粒體數(shù)量,促進(jìn)ATP合成,增加能量消耗;又通過ULK1依賴性刺激線粒體自噬觸發(fā)受損線粒體的急性破壞―控制線粒體質(zhì)量,維持健康線粒體數(shù)量,穩(wěn)定ATP產(chǎn)能,防止肥胖進(jìn)展;還可能提高M(jìn)fn1/2蛋白表達(dá)水平促進(jìn)線粒體融合―調(diào)節(jié)線粒體網(wǎng)絡(luò)形狀,保護(hù)線粒體呼吸功能,這些都說明針刺干預(yù)AMPK調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮減肥作用。

筆者認(rèn)為,針刺能提高肥胖大鼠AMPK表達(dá)水平,潛在減肥機(jī)制研究方向建議如下:(1)激活下游因子PGC-1α及相關(guān)通路,促進(jìn)mtDNA拷貝數(shù)、mtDNA/nDNA的比值升高及mtDNA表達(dá)水平升高,以促進(jìn)線粒體生物合成;(2)是否通過AMPK/ULK1信號通路提高線粒體自噬水平;(3)磷酸化MFN1/2或Opa1上的AMPK新底物,促進(jìn)線粒體融合。因此,深入探究AMPK和線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的相互作用將有利于進(jìn)一步闡釋針刺減肥的作用機(jī)制,豐富中醫(yī)藥理論。