張俊勤 李亞星 韓華

藥物流產(chǎn)作為一種非手術(shù)終止妊娠的方法,簡(jiǎn)便、安全、高效,在臨床應(yīng)用廣泛[1]。目前比較成熟的藥物流產(chǎn)方案主要為米非司酮150 mg或200 mg口服,48 h后米索前列醇600 μg頓服,完全流產(chǎn)率>90%[2,3]。但此種方法所需時(shí)間較長(zhǎng),若能將兩藥的用藥間隔時(shí)間縮短,可極大方便患者。本研究觀察停經(jīng)49 d以內(nèi)的早孕婦女頓服米非司酮12 h、24 h、48 h后絨毛組織中基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)(matrix metalloproteinase system,MMPs)/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制途徑因子系統(tǒng)(matrix metalloproteinase tissure inhibition pathway factors,T1MPs)中MMP-2、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制途徑因子-1(matrix tissure inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的表達(dá),明確米非司酮對(duì)MMPs/TIMPs的具體作用,從作用機(jī)制上分析米非司酮不同作用時(shí)間對(duì)早孕絨毛組織的影響,探討縮短其與米索前列醇用藥間隔的可行性,為臨床簡(jiǎn)化藥物流產(chǎn)方案提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),選擇2019年9月至2021年5月我院婦科門診自愿要求終止早期妊娠的女性,共80例。患者隨機(jī)分為4組(對(duì)照組,12 h組,24 h組及48 h組),每組20例。患者均簽署知情同意書。對(duì)照組年齡、停經(jīng)天數(shù)、胎囊大小與與12 h組(t=0.4928、0.1063、0.4929,P=0.6250、0.9159、0.6249)、24 h組(t=0.6322、1.0431、0.8649,P=0.5311、0.3035、0.3925)、48 h組研究對(duì)象(t=0.2710、0.3594、0.1959,P=0.7879、0.7213、0.8457)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性。見表1。

表1 4組孕婦一般資料比較 n=20,

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡18～40歲;②停經(jīng)<49 d,且經(jīng)B超證實(shí)為宮內(nèi)早孕,宮內(nèi)妊娠;③胎囊直徑<3 cm;④平時(shí)月經(jīng)規(guī)則,半年內(nèi)未服用任何激素類藥物。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn):①生殖系統(tǒng)炎癥及腫瘤;②精神疾病,無(wú)法正常交流。

1.3 方法

1.3.1 米非司酮用藥方法:米非司酮,規(guī)格:25 mg/片(浙江仙琚制藥股份有限公司)。12 h組:口服米非司酮150 mg,12 h后行負(fù)壓吸引術(shù);24 h組:口服米非司酮150 mg,24 h后行負(fù)壓吸引術(shù);48 h組:口服米非司酮150 mg,48 h后行負(fù)壓吸引術(shù);對(duì)照組:未服用任何藥物,直接采用常規(guī)負(fù)壓吸引術(shù)終止妊娠。分別留取4組吸宮術(shù)后的新鮮絨毛組織。

1.3.2 MMP-2、MMP-9、TIMP-1檢測(cè)

1.3.2.1 主要試劑及儀器:兔抗人MMP-2、MMP-9、TIMP-1(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)、SP9001試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。水浴箱201-0(天津泰斯特儀器有限公司),普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式公司),Nikon尼康全自動(dòng)顯微照相機(jī)(日本株式會(huì)社尼康),Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)(廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司)。

1.3.2.2 免疫組化染色方法檢測(cè)MMP-2、MMP-9、TIMP-1表達(dá)情況:術(shù)中所取組織切片脫蠟至水;磷酸緩沖液(PBS)清洗;3%甲醇-雙氧水孵育;枸櫞酸鹽微波抗原修復(fù);10%正常山羊血清37℃下孵育10 min;滴加一抗(兔抗人MMP-2、MMP-9、TIMP-1),4℃冰箱過(guò)夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液(MMP-2、MMP-9、TIMP-1為山羊抗兔IgG); DAB顯色劑顯色,陽(yáng)性顯色為棕黃色;蘇木素復(fù)染,1%鹽酸分化,氨水返藍(lán);脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片;每次染色均同步設(shè)有陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.3.2.3 免疫組化結(jié)果判斷:細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜有明顯棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性表達(dá), Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)處理,測(cè)得陽(yáng)性細(xì)胞染色的平均光密度(OD)值來(lái)表示抗原表達(dá)量。

1.4 觀察指標(biāo) (1) 4組臨床基本資料:包括年齡、停經(jīng)天數(shù)及胎囊大小。(2) 4組絨毛組織形態(tài)學(xué)觀察:分析對(duì)照組、12 h組、24 h組、48 h組絨毛組織形態(tài)學(xué)。(3)分析4組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的OD值差異。(4)比較4組絨毛組織MMP-2、 MMP-9、 TIMP-1、TIMP-1表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 絨毛組織形態(tài)學(xué)觀察 早孕絨毛組織由外向內(nèi)分別為合體滋養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞及間質(zhì)中心索。合體滋養(yǎng)細(xì)胞核大深染而不規(guī)則,游離緣呈刷毛樣,細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞邊界清晰,單核,絨毛間質(zhì)疏松。3個(gè)用藥組絨毛組織均出現(xiàn)一定程度的變性、壞死,絨毛間質(zhì)擴(kuò)張水腫,合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿減少呈多空泡,核固縮,深染等退變。細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞正?；蜃兓p微:細(xì)胞界限不清,核固縮,著色不良。見圖1。

對(duì)照組 12 h組 24 h組 48 h組

2.2 4組絨毛組織MMPs/TIMPs OD值比較 12 h組、24 h組、48 h組的MMP-2、MMP-9、MMP-9/TIMP-1在絨毛組織的陽(yáng)性目標(biāo)OD值均明顯高于對(duì)照組[(12 h組vs對(duì)照組t=2.5690、20.8139、19.6514,P=0.0142、0.0000、0.0000)、(24 h組vs對(duì)照組t=2.7901、17.8057、16.5854,P=0.0082、0.0000、0.0000)、(48 h組vs對(duì)照組t=2.8076、17.6131、25.9878,P=0.0078、0.0000、0.0000)];12 h組、24 h組、48 h組之間的MMP-2、MMP-9、MMP-9/TIMP-1在絨毛組織的陽(yáng)性目標(biāo)OD值比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(12 h組vs 24 h組t=1.7595、0.5199、0.8165,P=0.0865、0.6061、0.4193)、(12 hvs 48 h組t=1.9417、1.7879、1.9029,P=0.0596、0.0818、0.0647)、(24 h組vs 48 h組t=0.1054、1.2117、0.6989,P=0.9166、0.2331、0.4888)];12 h組、24 h組、48 h組TIMP-1在絨毛組織的OD值均明顯低于對(duì)照組(t=6.1648、6.5872、8.3553,P=0.0000、0.0000、0.0000),12 h組、24 h組、48 h組之間TIMP-1的OD值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(12 h組vs 24 h組t=0.0000,P=1.0000)、(12 h組vs 48 h組t=1.7594,P=0.0866)、(24 h組vs 48 h組t=1.7594,P=0.0866)]。見表2。

表2 4組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1的OD值 n=20,

2.3 4組絨毛組織MMP-2、 MMP-9、 TIMP-1表達(dá)情況 MMP-2、MMP-9、TIMP-1均為胞漿表達(dá),在12 h組、24 h組、48 h組的MMP-2、MMP-9、TIMP-1細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿內(nèi)和胞膜較對(duì)照組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),表現(xiàn)為棕黃色物質(zhì)在細(xì)胞胞漿內(nèi)呈網(wǎng)狀分布,其中各用藥組之間無(wú)明顯差異;對(duì)照組中TIMP-1的表達(dá)高于12 h組、24 h組、48 h組,各用藥組之間無(wú)明顯差異。見圖2。

對(duì)照組MMP-2的表達(dá) 對(duì)照組MMP-9的表達(dá) 對(duì)照組TIMP-1的表達(dá)

3 討論

早前,有學(xué)者就曾進(jìn)行縮短米非司酮與米索前列醇用藥間隔的研究[4,5]。近年來(lái),臨床資料表明縮短兩種藥物的用藥間隔在臨床上具有可行性:一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究表明,米非司酮-米索前列醇間隔時(shí)間<12 h組,12～24 h組,24～48 h組在服用米索前列醇后至排出妊娠產(chǎn)物的臨床誘導(dǎo)時(shí)間相似(P>0.05)[6];Flynn等[7]通過(guò)對(duì)隨機(jī)試驗(yàn)資料進(jìn)行探索性二次分析表明,用藥間隔時(shí)間在7～20 h完全流產(chǎn)率最高,達(dá)到96.6%,遠(yuǎn)高于0～6 h組及21～48 h組(P<0.01)。

米非司酮作為一種孕激素拮抗劑,可引起蛻膜絨毛組織變性壞死,誘發(fā)流產(chǎn)[8]。有關(guān)米非司酮的作用機(jī)制涉及到多個(gè)方面,其中,基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)(MMPs)可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì),參與胚泡植入的生理過(guò)程,且與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制途徑因子系統(tǒng)(T1MPs)一起調(diào)控著滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤(rùn)程度[9],妊娠早期絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞可通過(guò)分泌MMP-2、MMP-9,促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞入侵子宮內(nèi)膜基質(zhì),TIMPs(如TIMP-1,TIMP-2) 能夠抑制 MMPs 的產(chǎn)生和活性,一定程度上維持二者平衡,保證胚胎形成和妊娠維持[10]。Nissi 等[11]通過(guò)測(cè)定129例正常妊娠以及89例早期自然流產(chǎn)患者血清中MMPs的表達(dá)發(fā)現(xiàn),MMP-2、MMP-9水平升高可能在早期自然流產(chǎn)中發(fā)揮作用。施林領(lǐng)等[12]報(bào)道了稽留流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生可能與絨毛組織中MMP-9的表達(dá)升高、MMP-9/TIMP-1的失衡有關(guān),說(shuō)明MMPs/TIMPs平衡的精準(zhǔn)調(diào)控在正常妊娠中發(fā)揮著重要作用。另?yè)?jù)蔣艷麗等[13-15]研究發(fā)現(xiàn),MMPs蛋白表達(dá)情況與早發(fā)性子癇前期的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲有關(guān),而MMPs高表達(dá),可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路、絨毛組織中IκB蛋白降解及活化NF-κB有關(guān),或與MMP-9表達(dá)水平下降、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3表達(dá)水平增加引起的MMPs/TIMPs失衡有關(guān),很容易增加流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)各用藥組MMP-2、MMP-9的表達(dá)及MMP-9/TIMP-1比值較對(duì)照組明顯升高(P<0.05),提示米非司酮可通過(guò)提高M(jìn)MP-2、MMP-9的活性,抑制TIMP-1的調(diào)節(jié)作用,打破MMPs/TIMPs平衡,滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度浸潤(rùn),子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)降解,宮頸組織水解剝脫,誘發(fā)流產(chǎn)[16]。在3個(gè)用藥組之間,MMP-2、MMP-9、TIMP-1表達(dá)及MMP-9/TIMP-1表達(dá)并無(wú)明顯差異,說(shuō)明服用米非司酮后12 h對(duì)絨毛組織即發(fā)揮作用,從而達(dá)到抗早孕的目的。

綜上所述,米非司酮作用后最早12 h就已對(duì)早孕絨毛組織產(chǎn)生影響,證明將米非司酮與米索前列醇用藥間隔縮短至12 h的服用方法理論上是可行的,這極大地縮短了藥物流產(chǎn)時(shí)間。有學(xué)者M(jìn)eta分析得出結(jié)論,兩種藥物同時(shí)應(yīng)用也能維持早期妊娠藥物流產(chǎn)的臨床效果[17];由此,我們大膽設(shè)想女性甚至可根據(jù)自己的需求在一定時(shí)間范圍內(nèi)自行掌握兩藥的時(shí)間間隔,從而接受更加便利及個(gè)體化的流產(chǎn)方案。