劉文鵬 曹經(jīng)琳 趙鑫 竇劍 馬路園 趙彩彥

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝臟最常見(jiàn)的惡性腫瘤,流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,其發(fā)病率位于所有腫瘤中的第五位,腫瘤致死性疾病中的第三位,并且具有一定的性別差異,于男性中排名第三位,女性中排名第八位[1,2]。HCC發(fā)病隱匿、生長(zhǎng)速度快、惡性程度高,常伴有血管侵犯、肝內(nèi)及肝外轉(zhuǎn)移、治療后復(fù)發(fā)等,臨床預(yù)后較差,其5年生存率僅為3%～25%,嚴(yán)重危害人類的健康[3,4]。甲狀腺激素受體和視黃醛激活因子(activator of thyroid and retinoid receptor,ACTR, also known as SRC-3/AIB1/NCoA3), 其編碼的蛋白是一種類固醇激素受體的轉(zhuǎn)錄輔激活因子,為細(xì)胞核激素受體共激活劑P160家族的成員之一,被定義為原癌基因,通過(guò)與核激素受體和其他轉(zhuǎn)錄因子作用而發(fā)揮生物學(xué)功能[5,6]。有研究證實(shí),ACTR在大約68%的肝癌中呈高表達(dá),并可以在體內(nèi)外促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[7-9]。胰島素樣生長(zhǎng)因子及其受體(insulin-like growth factors, IGFs)是能量代謝和生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)控因子,現(xiàn)在越來(lái)越多的學(xué)者也發(fā)現(xiàn),IGFs及其調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮了關(guān)鍵的作用,可以調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成等過(guò)程,成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。IGFs受體系統(tǒng)由多種受體組成,其中IGF-1R介導(dǎo)了其大多數(shù)的生物學(xué)作用[10,11]。現(xiàn)階段的研究仍未完全闡明HCC的發(fā)病機(jī)制,因此,探究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)調(diào)控肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的新分子、新機(jī)制將為肝癌的診斷和治療提供重要的理論依據(jù)和分子靶標(biāo),具有重要的科研及臨床意義。本研究采用免疫共沉淀、細(xì)胞免疫熒光共定位、Western blot及qRT-PCR、細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定等方法探究ACTR與IGF-1R二者之間的相互作用,及對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和意義。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HepG2,HEK293T,美國(guó)ATCC;兔抗ACTR多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體,Santa Cruz Biotechnology;兔抗IGF-1R多克隆抗體、兔抗Myc、Flag多克隆抗體、DAPI,美國(guó)Cell Signaling Technology公司; Myc-IGF-1R、Flag-ACTR質(zhì)粒,SinoBiological公司;質(zhì)粒提取試劑盒,Promega公司;RNA提取分離試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR預(yù)混試劑盒,北京天根生化科技有限公司;Cell Counting Kit-8試劑盒,Dojindo公司;Lipofectamine 2000、Lipofectamine RNAiMAX 賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,37℃,5%二氧化碳。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,按照實(shí)驗(yàn)分組,根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求配置轉(zhuǎn)染溶液,應(yīng)用Lipofectamine 2000 用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,Lipofectamine RNAiMAX 用于siRNAs轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.2 免疫共沉淀:外源性免疫共沉淀,收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞,裂解緩沖液處理30 min(含有50 mmol/L Tris pH 值8.0, 500 mmol/L NaCl, 0.5% Nonidet P-40, 1 mmol/L DTT,蛋白酶抑制劑),超聲碎裂細(xì)胞后,加入抗Flag瓊脂糖珠子,置于4℃過(guò)夜充分結(jié)合,裂解緩沖液洗滌,SDS洗脫,行Western blot檢測(cè)。內(nèi)源性免疫共沉淀,直接收集細(xì)胞,用IGF-1R行交聯(lián)結(jié)合,余步驟同外源性免疫共沉淀。

1.2.3 免疫熒光行ACTR、IGF-1R細(xì)胞內(nèi)共定位:取培養(yǎng)好的細(xì)胞,PBS洗滌后4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌,0.5%Triton-100+1%NGS于冰上裂解并固定10 min,1%NGS+PBS封閉,加一抗并置于4℃孵育2 h,1%NGS洗滌3遍,后續(xù)步驟避光操作,加二抗孵育1 h,PBS洗滌3遍,DAPI染色,PBS洗滌3遍,封片,于顯微鏡下觀察。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中IGF-1R mRNA表達(dá):實(shí)驗(yàn)分為3組:陰性對(duì)照組、ACTR敲低組、ACTR敲低并回轉(zhuǎn)組。利用RNA提取分離試劑盒,根據(jù)說(shuō)明書(shū),提取細(xì)胞中總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后,再行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃,15 min。三步法反應(yīng)94℃,15 s;55℃,30 s;72℃,30 s;進(jìn)行40個(gè)循環(huán),于每個(gè)循環(huán)的第三步72℃,30 s收集熒光信號(hào)。熔解曲線,60℃,5 s收集信號(hào),至95℃,每一步增加0.5℃。結(jié)束。引物序列:IGF-1R:正向5’-GAGGAGATGGAGCCTGGCTTC-3’,反向5’-GTGTCTGTCGGGCAGTGGCAG-3’。β-actin:正向5’-ATCACCATTGGCAATGAGCG-3’,反向5’-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3’。

1.2.5 CCK8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng):實(shí)驗(yàn)分為4組:陰性對(duì)照組,轉(zhuǎn)染ACTR組,敲低IGF-1R組,敲低IGF-1R+轉(zhuǎn)染ACTR組。轉(zhuǎn)染前1 d接種細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%轉(zhuǎn)染; 48 h后胰蛋白酶消化,加入適量DMEM培養(yǎng)基吹打混勻,配制成單細(xì)胞懸液;取10 μl單細(xì)胞懸液,應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)濃度;將細(xì)胞稀釋至合適濃度,分別接種于96孔板,每孔3 000個(gè)細(xì)胞,設(shè)置復(fù)孔,周圍孔內(nèi)加入PBS緩沖液作為保護(hù)孔;置于37℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng);按照說(shuō)明書(shū),配制實(shí)驗(yàn)溶液,將CCK-8試劑與DMEM培養(yǎng)基按照1∶9比例配制,吸棄96孔板中培養(yǎng)基,每孔加入100 μl配置好的CCK-8,1 h后于波長(zhǎng)450 nm測(cè)定樣品OD值;于每日同一時(shí)間測(cè)定OD值。

1.2.6 Western blot技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)量:收集細(xì)胞,RIPA裂解細(xì)胞,利用煮沸方法制備蛋白樣品,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,牛奶封閉膜上蛋白的非特異性抗原后,加入一抗,4℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜,再用二抗37℃孵育1 h,TBST洗膜,加化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影。

2 結(jié)果

2.1 外源性免疫共沉淀 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的ACTR與IGF-1R存在相互作用。見(jiàn)圖1、2。

圖1 外源性免疫共沉淀檢測(cè)ACTR和IGF-1R之間相互作用

2.2 內(nèi)源性免疫共沉淀 肝癌HepG2細(xì)胞系內(nèi)ACTR與IGF-1R之間存在相互作用。見(jiàn)圖2。

圖2 內(nèi)源性免疫共沉淀檢測(cè)ACTR和IGF-1R之間相互作用

2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 肝癌HepG2細(xì)胞系內(nèi),ACTR與IGF-1R在細(xì)胞內(nèi)存在共定位。見(jiàn)圖3。

圖3 免疫熒光檢測(cè)ACTR和IGF-1R細(xì)胞內(nèi)共定位

2.4 ACTR抑制IGF-1R mRNA表達(dá) qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)IGF-1R mRNA表達(dá)水平,敲低ACTR后,IGF-1R mRNA表達(dá)水平為(0.54±0.09),較對(duì)照組(1.00±0.04)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);回轉(zhuǎn)ACTR后IGF-1R mRNA表達(dá)水平可恢復(fù)為(1.26±0.10),與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 ACTR對(duì)IGF-1R mRNA表達(dá)水平的影響

2.5 ACTR抑制IGF-1R蛋白表達(dá) Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中IGF-1R、ACTR目標(biāo)蛋白的表達(dá),與對(duì)照組相比,敲低ACTR后IGF-1R表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而回轉(zhuǎn)ACTR后IGF-1R表達(dá)可恢復(fù)。見(jiàn)圖4。

圖4 ACTR對(duì)IGF-1R 蛋白表達(dá)水平的影響

2.6 ACTR通過(guò)IGF-1R調(diào)控肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)作用 CCK8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)并繪制曲線。與IGF-1R Wild type+Empty Vector組相比,轉(zhuǎn)染并過(guò)表達(dá)ACTR組能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與IGF-1R Wild type+Empty Vector組相比,敲低IGF-1R可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與敲低IGF-1R組相比,敲低IGF-1R+轉(zhuǎn)染ACTR組促生長(zhǎng)作用減弱,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),即敲低IGF-1R后ACTR的促細(xì)胞生長(zhǎng)作用減弱。見(jiàn)圖5,表2。

表2 ACTR調(diào)控IGF-1R對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖5 ACTR調(diào)控IGF-1R對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(*P<0.05)

3 討論

肝細(xì)胞癌是全世界范圍內(nèi)病死率居高不下的惡性腫瘤之一,也是我國(guó)較常見(jiàn)且高發(fā)的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害著人們的健康,因此如何早期診斷HCC,進(jìn)行有效的預(yù)防和治療具有重大意義[12]。外科手術(shù)徹底切除腫瘤病灶是治療肝癌的最有效的手段,但大多數(shù)肝癌患者均伴有不同程度的肝纖維化、肝硬化等,發(fā)病隱匿,發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于晚期,僅有15%～30%的患者可以獲得臨床根治性手術(shù)切除,但是,即便手術(shù)順利切除,其復(fù)發(fā)率也很高,約為75%[13]。肝臟移植是治療終末期肝病及肝癌的一種有效手段,但受制于有限的肝源,只有極少數(shù)的患者可以得到及時(shí)救治,具有一定的限制性[14]。放化療、介入治療、分子靶向治療也為肝癌的治療提供了新的思路和方法,但由于肝癌發(fā)病隱匿,惡性程度高,復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率高等因素,嚴(yán)重影響了治療的療效及預(yù)后生存[15,16]。肝癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,如癌基因的激活、抑癌基因的失活、基因表達(dá)的調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變、細(xì)胞代謝方式的轉(zhuǎn)變等,從而使得癌細(xì)胞具備了異常增殖的特性,所以探索肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找新的分子靶點(diǎn),篩選早期診斷及靶向的分子標(biāo)記物,針對(duì)性的各種基因治療及生物治療方法,逐步成為肝癌研究的熱點(diǎn)[17,18]。

ACTR是一種比較明確的癌基因,在許多腫瘤中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)的狀態(tài),比如乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等,ACTR參與了腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程,不同的研究者對(duì)其詳細(xì)的機(jī)制進(jìn)行了深入的研究[19,20]。Liu等[21]研究證實(shí),肝癌中HBx蛋白可以促使ACTR更加穩(wěn)定,并且二者可以協(xié)同作用促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。下調(diào)ACTR的表達(dá)可以通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路阻斷細(xì)胞周期,進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。ACTR和細(xì)胞內(nèi)糖代謝密切相關(guān),例如有氧糖酵解途徑的關(guān)鍵酶PFKFB4可以使ACTR 857位絲氨酸磷酸化,從而激活其轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。ACTR與腫瘤耐藥相關(guān),研究發(fā)現(xiàn),ACTR可以促進(jìn)Warburg效應(yīng),從而導(dǎo)致索拉菲尼耐藥[22-24]。ACTR作用機(jī)制如此復(fù)雜,有無(wú)其他新的信號(hào)通路呢,我們通過(guò)研究證實(shí),ACTR可以與IGF-1R發(fā)生相互作用,調(diào)控IGF-1R的表達(dá)。

IGF-1R是定位于細(xì)胞膜表面的異四聚體結(jié)構(gòu)跨膜蛋白,由細(xì)胞外的2個(gè)α亞基和跨膜的2個(gè)β亞基所構(gòu)成,具有酪氨酸激酶活性,當(dāng)配體與IGF-1R結(jié)合時(shí),引起β亞基激酶結(jié)構(gòu)域的活化,導(dǎo)致受體及其底物的絲氨酸磷酸化,激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)導(dǎo)[25]。IGF-1R廣泛的存在于生物體內(nèi)各類細(xì)胞中,在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)上調(diào),例如肝癌、腎細(xì)胞癌、卵巢癌等,其可以通過(guò)caspase依賴的線粒體通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡,可通過(guò)PI3K/AKT、MAPK/ERK等信號(hào)通路調(diào)控腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[26,27]?？梢?jiàn)抑制IGF-1R的功能可能成為治療腫瘤的一個(gè)潛在靶點(diǎn),現(xiàn)在已有致力于靶向IGF-1R的藥物研究,并且已經(jīng)在進(jìn)行早期臨床實(shí)驗(yàn)。本研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)ACTR可以抑制IGF-1R的表達(dá)。ACTR本身可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖,當(dāng)敲低IGF-1R后,ACTR的促生長(zhǎng)作用減弱,說(shuō)明ACTR是通過(guò)IGF-1R發(fā)揮作用的。但是其下游通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展,仍有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述,ACTR與IGF-1R之間存在相互的作用,IGF-1R介導(dǎo)了ACTR促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程,ACTR/IGF-1R軸在肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)中發(fā)揮了必要的作用,有可能成為治療肝癌的靶點(diǎn)之一,為肝癌的防治提供新的思路。