劉俊麗 張竣 賀清波 張秀珍 孫萍 胡曉君

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤[1]。早期篩查使患者發(fā)病率和死亡率減少[1]。然而,宮頸癌轉(zhuǎn)移直接對(duì)受影響的患者生存產(chǎn)生負(fù)面影響,但其潛在的分子機(jī)制仍不清楚,因此探討宮頸癌發(fā)病機(jī)制具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (LncRNAs)是一組內(nèi)源性非編碼轉(zhuǎn)錄本,長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸,LncRNA參與了不同的細(xì)胞過程[2]。已經(jīng)證明LncRNA的異常表達(dá)與人類疾病相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA FEZF1-AS1在腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用,如LncRNA FEZF1-AS1通過miR-34a促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲[4]。還有文獻(xiàn)報(bào)道LncRNA-FEZF1-AS1通過調(diào)節(jié)PKM2通路促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤的增殖[5]。提示FEZF1-AS1的異常表達(dá)可能是預(yù)測(cè)癌癥轉(zhuǎn)移和預(yù)后的分子標(biāo)記。本研究探討LncRNA FEZF1-AS1對(duì)Hela細(xì)胞增殖、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響,闡明宮頸癌的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取我院45例宮頸癌組織和35例癌旁正常組織標(biāo)本,保存在液氮中。宮頸癌Hela細(xì)胞和人宮頸上皮細(xì)胞H8細(xì)胞來自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品。MTT檢測(cè)試劑盒、GAPDH抗體來自上海碧云天生物科技有限公司。FEZF1-AS1 siRNA、pcDNA-FEZF1-AS1、Sphk2 siRNA等質(zhì)粒來自北京擎科生物公司,miR-363-3p抑制劑(miR-363-3p inhibitor)、miR-363-3p模擬物(miR-363-3p mimics)來自Genepharma公司。E-cadherin、N-cadherin抗體購自英國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):Hela和H8細(xì)胞在含10%FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),添加100 U/L的青霉素和鏈霉素,放在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:Hela細(xì)胞鋪于12孔板,觀察密度約70%時(shí),添加無血清DMEM培養(yǎng)基,取Turbofect轉(zhuǎn)染試劑、重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,細(xì)胞培養(yǎng)板放在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞活力測(cè)定:Hela細(xì)胞接種至96孔板12 h后用Turbofect進(jìn)行轉(zhuǎn)染,48 h后棄培養(yǎng)基,加入100 μl PBS洗滌,加入20 μl濃度為5 mg/ml的 MTT, 4 h后將150 μl DMSO加入每孔細(xì)胞,搖動(dòng)10 min,讀取570 nm處的吸光度。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè):預(yù)測(cè)LncRNA FEZF1-AS1及其miR-363-3p的靶基因,擴(kuò)增全長(zhǎng)后,構(gòu)建LncRNA FEZF1-AS1 wt載體和Sphk2 wt載體,點(diǎn)突變?cè)噭┖袑⒁吧唾|(zhì)粒進(jìn)行點(diǎn)突變,命名為L(zhǎng)ncRNA FEZF1-AS1 mut和Sphk2 mut。按照Turbofect轉(zhuǎn)染說明書將LncRNA FEZF1-AS1 wt、LncRNA FEZF1-AS1 mut分別與miR-363-3p mimics、mimics NC,Sphk2 wt、Sphk2 mut分別與miR-199a-5p mimics、mimics NC共轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):Transwell上室中加入200 μl稀釋的 Matrigel 基質(zhì),靜置12 h。Hela細(xì)胞接種于12孔板,并進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將1×105個(gè)(200 μl)重懸的細(xì)胞懸液加入上室,下室加入400 μl DMEM培養(yǎng)基,24 h后加入PBS清洗,4%多聚甲醛固定,PBS洗滌,新鮮的0.1%結(jié)晶紫染色浸染15 min,觀察細(xì)胞侵襲情況。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR:Trizol試劑加入收取的細(xì)胞RNA中,Trizol法提取總RNA,測(cè)定濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄細(xì)胞總RNA為cDNA,進(jìn)行RT-qPCR,SYBR Green法分析基因表達(dá)量。見表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot:細(xì)胞蛋白樣中加入RIPA裂解液裂解30 min,BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度,10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,再濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上;與5% 脫脂奶粉封閉2 h后分別與特異性一抗孵育過夜,TBST洗3次,加入二抗后孵育1.5 h,蛋白曝光后通過Image J 灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)LncRNA FEZF1-AS1抑制Hela細(xì)胞增殖、侵襲及EMT RT-qPCR結(jié)果顯示,宮頸癌組織中LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)(1.89±0.32)高于癌旁正常組織(1.05±0.54);Hela細(xì)胞中LncRNA FEZF1-AS1表達(dá)(1.89±0.32)高于H8細(xì)胞(1.05±0.54)(P<0.01)。LncRNA FEZF1-AS1 siRNA細(xì)胞內(nèi)FEZF1-AS1表達(dá)明顯低于siRNA NC組(P<0.01)。FEZF1-AS1 siRNA組細(xì)胞活力、侵襲數(shù)目、N-cadherin表達(dá)低于siRNA NC組(P<0.05),E-cadherin表達(dá)高于siRNA NC組(P<0.01)。見圖1,表2。

圖1 下調(diào)LncRNA FEZF1-AS1抑制Hela細(xì)胞侵襲及EMT;A Transwell檢測(cè)Hela細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色×200);B Western blot檢測(cè)Hela細(xì)胞EMT

表2 FEZF1-AS1表達(dá)、Hela細(xì)胞活力、侵襲數(shù)目與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

2.2 LncRNA FEZF1-AS1與miR-363-3p之間的關(guān)系 軟件預(yù)測(cè)的FEZF1-AS1和miR-363-3p之間的結(jié)合位點(diǎn)。與FEZF1-AS1 wt+mimics NC組相比,FEZF1-AS1 wt+miR-363-3p mimics組熒光素酶活性降低(P<0.01);與FEZF1-AS1 mut+mimics NC組相比,FEZF1-AS1 mut+miR-363-3p mimics組熒光素酶活性無明顯化(P>0.05)。見表3,圖2。

圖2 LncRNA FEZF1-AS1與miR-363-3p之間的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

表3 雙熒光素酶活性

2.3 下調(diào)miR-363-3p促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖、侵襲及EMT RT-qPCR結(jié)果顯示,宮頸癌組織miR-363-3p表達(dá)(0.57±0.26)低于癌旁正常組織(1.13±0.52)(P<0.05);Hela細(xì)胞中miR-363-3p表達(dá)(0.43±0.38)低于H8細(xì)胞(1.09±0.42)(P<0.01)。miR-363-3p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)miR-363-3p表達(dá)明顯低于inhibitor NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。miR-363-3p inhibitor組細(xì)胞活力、侵襲數(shù)目、N-cadherin表達(dá)高于inhibitor NC組(P<0.05),E-cadherin表達(dá)低于inhibitor NC組(P<0.01)。見圖3,表4。

圖3 下調(diào)miR-363-3p促進(jìn)Hela細(xì)胞侵襲及EMT;A Transwell檢測(cè)Hela細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色×200);B Western blot檢測(cè)Hela細(xì)胞EMT

表4 miR-363-3p表達(dá)、Hela細(xì)胞活力、侵襲數(shù)目與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 miR-363-3p與Sphk2之間的關(guān)系 TargetScan預(yù)測(cè)的miR-363-3p與Sphk2的結(jié)合位點(diǎn)。與 Sphk2 wt+mimics NC組相比,Sphk2 wt+miR-363-3p mimics組熒光素酶活性降低(P<0.01);與Sphk2 mut+mimics NC組相比,Sphk2 mut+miR-363-3p mimics組熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。見表5,圖4。

圖4 miR-363-3p與Sphk2之間的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

表5 雙熒光素酶活性

2.5 上調(diào)LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖、侵襲及EMT 與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比,pcDNA-FEZF1-AS1+mimics NC組細(xì)胞活力、侵襲數(shù)目、N-cadherin表達(dá)升高(P<0.05),E-cadherin表達(dá)下降(P<0.01);pcDNA-3.1(+)+miR-363-3p mimics組細(xì)胞活力侵襲數(shù)目、N-cadherin表達(dá)降低(P<0.01),E-cadherin表達(dá)升高(P<0.01)。與pcDNA-3.1(+)+miR-363-3p mimics組相比,pcDNA-FEZF1-AS1+miR-363-3p mimics組細(xì)胞活力侵襲數(shù)目、N-cadherin表達(dá)升高(P<0.01),E-cadherin表達(dá)下降(P<0.01)。見表6,圖5。

圖5 上調(diào)LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖、侵襲及EMT;A Transwell檢測(cè)Hela細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色×200);B Western blot檢測(cè)Hela細(xì)胞EMT;a pcDNA-3.1(+)+mimics NC組;b pcDNA-FEZF1-AS1+mimics NC組;c pcDNA-3.1(+)+miR-363-3p mimics組;d pcDNA-FEZF1-AS1+miR-363-3p mimics組

表6 Hela細(xì)胞活力、侵襲數(shù)目與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

2.6 下調(diào)Sphk2對(duì)Hela細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示,宮頸癌組織中Sphk2表達(dá)(1.97±0.33)高于癌旁正常組織(1.04±0.62)(P<0.01);Hela細(xì)胞中Sphk2表達(dá)(2.03±0.35)高于H8細(xì)胞(1.07±0.46)(P<0.01)。Sphk2 siRNA組細(xì)胞內(nèi)Sphk2表達(dá)明顯低于siRNA NC組(P<0.01)。Sphk2 siRNA組細(xì)胞活力、侵襲數(shù)目、N-cadherin表達(dá)低于siRNA NC組(P<0.01),E-cadherin表達(dá)高于siRNA NC組(P<0.01)。見圖6,表7。

圖6 下調(diào)Sphk2抑制Hela細(xì)胞侵襲及EMT;A Transwell檢測(cè)Hela細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色×200);B Western blot檢測(cè)Hela細(xì)胞EMT

表7 Sphk2表達(dá)、Hela細(xì)胞活力、侵襲數(shù)目與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

2.7 LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p上調(diào)Sphk2表達(dá) FEZF1-AS1 siRNA+inhibitor NC組的Sphk2基因及蛋白表達(dá)低于siRNA NC+inhibitor NC組,siRNA NC+miR-363-3p inhibitor 組的Sphk2基因及蛋白表達(dá)高于siRNA NC+inhibitor NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。FEZF1-AS1 siRNA+miR-363-3p inhibitor組Sphk2 基因及蛋白表達(dá)低于siRNA NC+miR-363-3p inhibitor組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表8,圖7。

圖7 Western blot檢測(cè)Sphk2蛋白表達(dá);a siRNA NC+inhibitor NC組;b:FEZF1-AS1 siRNA+inhibitor NC組;c siRNA NC+miR-363-3p inhibitor 組;d FEZF1-AS1 siRNA+miR-363-3p inhibitor組

表8 Sphk2基因與蛋白表達(dá)

3 討論

研究表明一些LncRNA的失調(diào)已經(jīng)在各種類型的癌癥中出現(xiàn),包括宮頸癌[6]。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA在宮頸癌的發(fā)展過程中發(fā)揮作用,如LncRNA TUG1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和EMT[7]。上調(diào)LncRNA PANDAR可預(yù)測(cè)宮頸癌預(yù)后不良[8]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道LncRNA FEZF1-AS1參與了如非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、胃癌等癌癥的增殖及其轉(zhuǎn)移過程[9,10]。在宮頸癌Hela細(xì)胞中,我們選擇并關(guān)注LncRNAFEZF1-AS1,我們首次評(píng)估FEZF1-AS1在宮頸癌組織和Hela細(xì)胞中的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1在宮頸癌組織中表達(dá)增多,此外,RT-qPCR結(jié)果顯示Hela細(xì)胞中FEZF1-AS1表達(dá)也明顯高于H8細(xì)胞。提示FEZF1-AS1可作為預(yù)測(cè)宮頸癌發(fā)生及預(yù)后不良的指標(biāo)。

為了強(qiáng)調(diào)FEZF1-AS1在宮頸癌Hela細(xì)胞中的上調(diào)作用,我們通過功能喪失和功能上調(diào)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了FEZF1-AS1在宮頸癌進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。結(jié)果顯示,siRNA降低FEZF1-AS1表達(dá)顯著抑制Hela細(xì)胞增殖、侵襲和EMT。而FEZF1-AS1過表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和EMT。綜上所述,FEZF1-AS1可能是一種致癌基因,在宮頸癌發(fā)展中起促進(jìn)作用。LncRNA FEZF1-AS1參與了多種腫瘤的發(fā)展。因此,在癌癥中有效阻斷這些LncRNA可能是一種新的預(yù)防和治療策略。

LncRNA在人類癌癥中的重要性可能與它們通過各種機(jī)制影響細(xì)胞功能的能力有關(guān)。LncRNA的作用機(jī)制部分取決于其基因組位置,可能通過miRNA參與癌癥發(fā)展過程。我們通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LncRNA FEZF1-AS1與miR-363-3p具有靶向作用。因此,我們推測(cè)LncRNA FEZF1-AS1可能調(diào)控miR-363-3p參與宮頸癌的進(jìn)展。miR-363-3p在癌癥中的作用已被廣泛報(bào)道[11-13],進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),敲低miR-363-3p促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖、侵襲和EMT。本結(jié)果與miR-363-3p在其他癌癥中發(fā)揮的作用一致,能夠作為抑癌基因調(diào)控癌癥發(fā)展。另外,發(fā)現(xiàn)上調(diào)LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖、侵襲及EMT,也進(jìn)一步證明了我們的猜想。后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-363-3p靶向Sphk2,此外,我們驗(yàn)證了干擾Sphk2表達(dá)也能抑制Hela細(xì)胞增殖、侵襲和EMT,LncRNA FEZF1-AS1通過miR-363-3p上調(diào)Sphk2表達(dá)。提示LncRNA FEZF1-AS1/miR-363-3p/Sphk2軸在Hela細(xì)胞增殖、侵襲和EMT過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,本研究提供了FEZF1-AS1表達(dá)與宮頸癌發(fā)展之間的聯(lián)系。我們證實(shí)上調(diào)FEZF1-AS1通過miR-363-3p/Sphk2軸促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖、侵襲及EMT,表明FEZF1-AS1可能是一個(gè)候選的預(yù)后生物標(biāo)志物和新治療宮頸癌的靶點(diǎn)。