徐慧鮮 劉振鋒

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一[1]。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計,胃癌發(fā)病率占新發(fā)癌癥病例的5.6%,排第五位;胃癌死亡率占癌癥總死亡病例的7.7%,排第四位[2]。中國是胃癌大國,胃癌已成為威脅國民生命健康的一大疾病,也是國家癌癥防治的重點[3,4]。因此,有必要研究胃癌惡性進展的潛在機制,為胃癌治療提供靶點。谷氨酰胺酶1(glutaminase1,GLS1)是一種代謝酶,通常在高度增殖的癌細胞中過表達,通過分解谷氨酰胺,滿足癌細胞快速增殖對能量的需求[5,6]。目前,GLS1已被證實是致癌過程中的一種重要靶點,且有證據(jù)表明,GLS1的抑制劑可能是癌癥治療的有效策略[7-9]。GLS1在胃癌中被報道與胃癌患者較差的預(yù)后有關(guān)[10]。但筆者發(fā)現(xiàn)GLS1表達調(diào)控胃癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的作用尚不清楚。因此,本研究通過干擾胃癌細胞中GLS1的表達,研究GLS1表達缺失對胃癌細胞惡性行為和體內(nèi)生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人胃黏膜上皮細胞GES-1和胃癌細胞N87、MKN28、BGC826和BGC803由中國科學院上海細胞庫提供。在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)液中,置于含5%CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細胞轉(zhuǎn)換 設(shè)計合成2條靶向GES-1的siRNA片段(記為si-GLS1-1#和si-GLS1-2#),分別轉(zhuǎn)染N87和BGC823細胞,并以無意義siRNA為對照(si-con)。轉(zhuǎn)染48 h后,實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和western blot檢測細胞中GLS1 mRNA和蛋白表達水平。

1.3 qRT-PCR實驗 Trizol法用于提取細胞總RNA。采用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后,采用SYBR Green法進行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列如下:GLS1正向5’- AAGAGAATGGGCTGGTGCTC-3’,反向5’-ACCGCGTAAGCAGATTTGGA-3’,內(nèi)參β-actin正向5’-CTTCGCGGGCGACGAT-3’,反向5’- CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3’。 GLS1 mRNA相對表達量采用2-ΔΔct法計算。

1.4 Western blot實驗 取適量RIPA裂解液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE),然后將電泳分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h后,分別與GLS1、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin或β-actin一抗稀釋液,4℃孵育過夜;然后與相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h。使用ECL化學發(fā)光液檢測目的條帶,拍照,ImageJ軟件分析目的條帶的灰度值。

1.5 CCK8和克隆形成檢測細胞增殖 CCK8試劑盒用于CCK8細胞增殖活性的檢測。取對數(shù)生長期的細胞,消化、離心、計數(shù)、重懸,將細胞懸液以1×104個/孔播種至96孔板,37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后,每孔加入10 μl CCK8溶液,繼續(xù)孵育4 h。在酶標儀下讀取每孔490 nm處的吸光度值(OD值),并且計算細胞的增殖活性。此外,通過克隆形成實驗評估細胞的增殖能力。將細胞以約2×102個/孔播種至6孔板,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2周后,采用10%甲醛溶液固定細胞,采用0.1%結(jié)晶紫染色,肉眼或在顯微鏡下計數(shù)克隆形成數(shù)目。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 Annexin V-FITC/PI雙染法試劑盒檢測細胞凋亡。收集取數(shù)生長期的細胞,用預(yù)冷的PBS洗滌細胞,加入1×Binding Buffer重懸細胞。然后分別加入5 μl的Annexin V-FITC,室溫下,避光染色15 min,再加入5 μl的PI染色5 min。流式細胞儀上機檢測細胞凋亡率。

1.7 Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲 將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板,Transwell小室作為上室,24孔板作為下室。用無血清的培養(yǎng)液重懸細胞,制備細胞懸液,取適量細胞懸液加入上室腔中,然后在下室腔中加入適量含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,取出上室,倒掉上室中的液體,放入甲醇溶液中固定30 min后,放入Giemsa染液中染色15 min,流水清洗后,用濕棉棒輕輕擦去上室底部膜表面未遷移的細胞,顯微鏡下觀察隨機5個視野區(qū)的細胞,并計數(shù),取平均數(shù)記為細胞遷移數(shù)目。細胞侵襲實驗中預(yù)先在Transwell小室的底部鋪一層Matrigel基質(zhì)膠,其他步驟同細胞遷移。

1.8 異種移植瘤實驗 將BALB/C裸鼠在本實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機分為sh-NC組、sh-GLS1-1#組和sh-GLS1-2#組,每組5只。根據(jù)分組,分別將轉(zhuǎn)染對應(yīng)shRNA的N87細胞經(jīng)皮下接種裸鼠。分別于接種第7、14、21、28天檢測小鼠體內(nèi)移植瘤生長體積,接種28 d后,使小鼠安樂死,剝離移植瘤稱重,并通過Western blot檢測移植瘤中N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的表達。

2 結(jié)果

2.1 GLS1在胃黏膜上皮細胞和胃癌細胞中的表達 qRT-PCR檢測GLS1 mRNA在胃黏膜上皮細胞GES-1和胃癌細胞N87、MKN28、BGC826和BGC803的表達,結(jié)果顯示,與GES-1細胞比較,N87、MKN28、BGC826和BGC803細胞中GLS1 mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.05)。Western blot檢測GLS1蛋白表達,結(jié)果顯示,與GES-1細胞比較,N87、MKN28、BGC826和BGC803細胞中GLS1蛋白表達上調(diào)(P<0.05)。見圖1,表1。

表1 GLS1在胃黏膜上皮細胞和胃癌細胞的表達

圖1 GLS1的蛋白表達

2.2 干擾GLS1表達對人胃癌N87和BGC823增殖的影響 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細胞中GLS1 mRNA和蛋白表達均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CCK8實驗顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細胞的增殖活性均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);克隆形成實驗結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細胞的克隆形成數(shù)目均明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2,表2。

圖2 干擾GLS1 表達對人胃癌N87和BGC823GLS1的表達和克隆形成的影響;A Western blot檢測人胃癌N87和BGC823中GLS1的表達;B 克隆形成檢測人胃癌N87和BGC823的增殖

表2 沉默GLS1 表達對人胃癌N87和BGC823增殖的影響

2.3 干擾GLS1 表達對人胃癌N87和BGC823細胞凋亡的影響 與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細胞的細胞凋亡率均明顯升高(P<0.05)。見圖3,表3。

圖3 流式細胞術(shù)檢測人胃癌N87和BGC823細胞凋亡

表3 干擾GLS1 表達對人胃癌N87和BGC823細胞凋亡的影響 n=9,

2.4 干擾GLS1 表達對人胃癌N87和BGC823遷移和侵襲的影響 Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲,結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細胞的遷移細胞數(shù)目和侵襲細胞數(shù)目均減少(P<0.05)。Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白表達,結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組N87和BGC823細胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表達降低(P<0.05),而E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)。見圖4,表4。

圖4 干擾GLS1 表達對人胃癌N87和BGC823遷移和侵襲以及N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白表達的影響;A transwell檢測人胃癌N87和BGC823遷移和侵襲;B Western blot檢測N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的表達

表4 干擾GLS1 表達對人胃癌N87和BGC823遷移、侵襲的影響

2.5 干擾GLS1 表達對人胃癌N87和BGC823體積和重量的影響 異種移植瘤實驗觀察干擾GLS1對胃癌細胞體內(nèi)生長的影響,結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#組和si-GLS1-2#組小鼠體內(nèi)移植瘤的體積明顯減小(P<0.05),腫瘤重量明顯減輕(P<0.05)。見圖5,表5、6。

圖5 干擾GLS1 表達對人胃癌N87和B GC823細胞小鼠移植瘤的影響

表5 干擾GLS1 表達對人胃癌N87 細胞小鼠移植瘤體積和重量的影響 n=9,

表6 干擾GLS1 表達對人胃癌BGC823細胞小鼠移植瘤體積和重量的影響 n=9,

2.6 干擾GLS1 表達對人胃癌N87和BGC823移植瘤EMT表達的影響 Western blot檢測移植瘤中EMT相關(guān)蛋白表達,結(jié)果顯示,與si-con組比較,si-GLS1-1#和si-GLS1-2#組移植瘤中N-cadherin和Vimentin表達明顯降低(P<0.05),而E-cadherin表達明顯升高(P<0.05)。見圖6,表7。

圖6 干擾GLS1 表達對人胃癌N87和BGC823細胞小鼠移植瘤EMT表達的影響

表7 干擾GLS1表達對人胃癌N87和BGC823細胞小鼠移植瘤N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的影響 n=9,

3 討論

谷氨酰胺代謝為癌癥細胞增殖提供能量,是癌癥的標志之一[11]。GLS1是催化谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵代謝酶,在多種人類腫瘤中檢測到GLS1的高表達,且GLS1異常表達與癌細胞的生長、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為有關(guān)[12,13]。賴明華等[14]報道,GLS1在乳腺癌細胞中高表達,抑制GLS1的表達可降低細胞增殖活性,誘導細胞凋亡。盧昭輝等[15]研究表明,人胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中GLS1高表達與細胞較強的增殖和侵襲能力有關(guān)。Liu等[16]發(fā)現(xiàn),敲低GLS1可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、集落形成和遷移能力,提示靶向GLS1可能是結(jié)直腸癌治療的一個新的潛在靶點。目前,在胃癌中,GLS1被發(fā)現(xiàn)與胃癌臨床預(yù)后有關(guān),GLS1表達越高,胃癌患者的3年總生存率越低[10];此外,李家秋等[17]研究表明,靶向抑制GLS1可以抑制胃癌細胞的增殖能力。

本研究體外培養(yǎng)胃癌細胞,qRT-PCR檢測證實GLS1在胃癌細胞中呈高表達。腫瘤細胞的遷移和侵襲是腫瘤發(fā)展過程中最具危險性的過程,當腫瘤細胞在遠處器官形成克隆時,往往會對機體產(chǎn)生嚴重破壞[18,19]。本研究細胞功能研究證實,干擾GLS1不僅能夠抑制胃癌細胞的增殖活性和克隆形成能力,還可抑制細胞的遷移和侵襲能力,誘導細胞凋亡。異種移植瘤實驗證實干擾GLS1阻礙了胃癌細胞的體內(nèi)生長。結(jié)果表明GLS1可能成為胃癌治療的有效的治療靶點。此外,有研究發(fā)現(xiàn)GLS1在癌細胞中的調(diào)控機制,如靶向GLS1可通過增加活性氧類和抑制Wnt/β-catenin途徑減弱肝細胞癌的干性特征[20];GLS1的下調(diào)降低一些與癌細胞存活有關(guān)的關(guān)鍵癌基因(如c-Myc、cdk4、NF-kB等)的表達,抑制多發(fā)性骨髓瘤進展,延長患者生存期[21]。但GLS1在胃癌細胞進展中的調(diào)控機制有待進一步研究。

EMT是一種將黏附上皮細胞轉(zhuǎn)化為侵襲性間充質(zhì)細胞的生物過程,其主要表現(xiàn)為細胞黏附蛋白標記物E-cadherin表達降低,而間充質(zhì)蛋白標記物N-cadherin和Vimentin水平升高[22,23]。數(shù)據(jù)顯示,EMT是腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵,也是一個可逆的生物過程[24]。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)干擾GLS1表達能夠使胃癌細胞中N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平降低,而E-cadherin蛋白表達明顯升高,表明干擾GLS1減弱了胃癌細胞的EMT過程。此外,在GLS1敲低表達的移植瘤中也檢測到了N-cadherin和Vimentin蛋白表達降低,而E-cadherin蛋白表達升高。提示干擾GLS1可能通過抑制胃癌細胞的EMT過程,抑制癌細胞的遷移和侵襲。

綜上所述,GLS1在胃癌細胞中呈現(xiàn)高表達,干擾GLS1能夠抑制癌細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT過程,促進癌細胞凋亡,并能減緩胃癌細胞的體內(nèi)生長。本研究結(jié)果為GLS1作為胃癌治療的潛在靶點提供了實驗參考。