夏瑩 王世全 路偉

胰腺癌是目前死亡率較高,生存期較短的惡性腫瘤之一。胰腺癌在我國屬于高發(fā)性疾病,發(fā)病率為7/10萬,然而胰腺癌的發(fā)病率仍逐年上升[1]。胰腺癌早期癥狀不明顯,有癥狀出現(xiàn)時多為中晚期,加之胰腺所處的位置關(guān)系,治療效果一直不佳。胰腺癌的5年生存率非常低,大約在5%[2]。近年來由于治療技術(shù)的發(fā)展,對胰腺癌的治療取得了一定的效果,但胰腺癌5年生存率仍是癌癥中最低的。因此,尋找新的治療藥物及方法對提升胰腺癌患者生存率有重要意義。從天然藥物中篩選治療胰腺癌的有效成分是目前重要的研究方向,柚皮素(Naringenin,NA)分子量為272,是一種天然黃酮類化合物,具有多種生物活性和藥理作用。有研究發(fā)現(xiàn),NA可以抑制肝癌、胃癌、乳腺癌等[3],有文獻(xiàn)報道NA可以抑制胰腺癌細(xì)胞的浸潤[4],但對胰腺細(xì)胞增殖和凋亡是否有影響,以及可能的機制需要進一步驗證。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β) 是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶。GSK-3β能調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、存活和凋亡[5]。胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)GSK-3β[6]。因此,本實驗探討NA對人胰腺細(xì)胞PANC-1細(xì)胞活力、增值及凋亡的影響,以及GSK-3β在其中的作用,為臨床應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 PANC-1 細(xì)胞(西京醫(yī)院消化病醫(yī)院保存),胎牛血清(澳大利亞),NA(sigma,美國),96孔板及24孔板(Costar,美國);總蛋白提取試劑盒,BCA蛋白定量試劑盒(康維試劑,中國);CCK 8試劑盒(七星,中國);兔源Ki-67、Cleaved caspase-3、GSK-3β、p-GSK-3β 和GAPDH一抗(abcam,英國);HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(GenTex,美國);Annexin VFITC凋亡檢測試劑盒(四季青生物,中國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):PANC-1細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng),第3天進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染:根據(jù)上海吉凱生物公司慢病毒手冊,在1 ml培養(yǎng)液中加入6 mg/ml 聚凝胺1 μl,在含有聚凝胺的培養(yǎng)液中加入對照慢病毒(上海吉凱生物,貨號:GIDV0210639)或GSK-3β過表達(dá)慢病毒(上海吉凱生物,貨號:GIDV0210640);轉(zhuǎn)染12 h后更換為正常培養(yǎng)基,72 h后通過倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞GFP的表達(dá),并分析病毒轉(zhuǎn)染效率,然后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 藥物配制:用微量二甲基亞砜將NA全部溶解,使得NA的濃度為100 μmol/ml,然后將液體作為原液儲存于-20℃冰箱中,用前用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將儲存液稀釋到實驗所需濃度。

1.2.4 實驗分組:將PANC-1細(xì)胞分為0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L組,分別用0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L的NA處理PANC-1細(xì)胞,進行后續(xù)檢測。

1.2.5 CCK-8檢測細(xì)胞活性:5組細(xì)胞分別在24 h、48 h和72 h,每個濃度4個復(fù)孔,每孔中加入10 μl的CCK 8試劑。37℃繼續(xù)溫育4 h后酶標(biāo)儀450 nm 測定細(xì)胞活性。

1.2.6 細(xì)胞計數(shù):在0 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol/L組,每組4孔,培養(yǎng)48 h后,胰酶消化,收集細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù),計算細(xì)胞增值倍數(shù)。

1.2.7 蛋白印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá):RIPA裂解液提取各組細(xì)胞蛋白,每組4孔,BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白進行聚丙稀酰胺凝膠電泳,按濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%的胎牛血清白蛋白常溫封閉1 h,分別加入一抗Ki-67、GSK-3β、p-GSK-3β、Cleaved caspase-1和GAPDH,4℃孵育過夜;辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,滴加發(fā)光液(Milipore,貨號:wbklso500)凝膠成像儀采集圖像。

1.2.8 RT-PCR GSK-3β引物序列為:上游5’-AGTGGTGAGAAGAAAGATGAG-3’,下游3’-TGACATAAATCACAGGGAG-5’,具體操作步驟按照SYBR定量熒光PCR試劑盒進行操作。

1.2.9 流式細(xì)胞儀Annexin V-PI雙染檢測細(xì)胞凋亡:使用0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、control virus和GSK-3β,培養(yǎng)48 h后,使用胰酶消化,在4℃離心機中1 000 r/min離心10 min,收集細(xì)胞;然后加入100 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞并加入5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI,混勻;室溫避光孵育15 min,流式細(xì)胞檢測。

2 結(jié)果

2.1 NA對PANC-1細(xì)胞活力的影響 CCK-8檢測NA對胰腺癌PANC-1細(xì)胞的活力的影響,結(jié)果顯示100～400 μmol/L的NA均對PANC-1細(xì)胞的活力有抑制作用,隨著濃素的增加抑制作用越來越明顯,且100～200 μmol/L時抑制率變化最大(P<0.05),在200 μmol/L時抑制效果最明顯;當(dāng)NA濃度從200 μmol/L增加至400 μmol/L時,NA對PANC-1細(xì)胞的抑制作用未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。同一濃度隨時間的延長抑制效果越明顯,48 h時抑制效果最好(P<0.05),72 h的抑制效果與48 h無差異(P>0.05)。表明NA對PANC-1細(xì)胞活力的抑制作用在100～200 μmol/L時存在明顯濃度依賴性,濃度越大抑制作用越強;且NA對PANC-1細(xì)胞活力的抑制作用在0～48 h時存在時間依賴性,時間越長,抑制越明顯。見表1。

表1 NA對細(xì)胞活性的影響 n=4,%,

2.2 NA對PANC-1細(xì)胞增值的影響 根據(jù)以上預(yù)實驗結(jié)果,選擇濃度為0、100、200、400 μmol/L 的NA對PANC-1細(xì)胞作用48 h,觀察細(xì)胞增值倍數(shù)和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67的表達(dá)量。

2.2.1 與0 μmol/L組比較,100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol/L組PANC-1細(xì)胞的增殖倍數(shù)明線降低(P<0.05);與100 μmol/L組比較,200 μmol/L組和400 μmol/L組PANC-1細(xì)胞的增殖倍數(shù)進一步降低(P<0.05),200 μmol/L組和400 μmol/L組PANC-1細(xì)胞增殖倍數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 NA對細(xì)胞增值的影響 n=4,

2.2.2 免疫熒光法檢測ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量,Westeerm blot 法檢測Ki-67 蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與0 μmol/L組比較,100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol組ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量和Ki-67蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與100 μmol/L組相比較,200 μmol/L組和400 μmol/L組ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量和Ki-67蛋白的表達(dá)水平進一步降低(P<0.05),200 μmol/L組和400 μmol/L組表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。見圖1,表3。

圖1 NA對Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量及Ki-67表達(dá)水平的影響;A ki-67代表;B PANC-1細(xì)胞Ki-67相對表達(dá)量

表3 NA對Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)及表達(dá)量的影響 n=4,

2.3 NA對PANC-1細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞技術(shù)測定0、100、200、400 μmol/L 的NA對PANC-1細(xì)胞作用48 h用各組細(xì)胞凋亡百分比。結(jié)果顯示:與0 μmol/L組相比較,100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol/L組細(xì)胞凋亡百分比增加(P<0.05);與100 μmol/L組比較,200 μmol/L組和400 μmol/L組細(xì)胞凋亡百分比進一步增加(P<0.05),200 μmol/L組和400 μmol/L組無顯著變化(P>0.05)。Westerm blot法檢測Cleaved caspae-3的含量,結(jié)果顯示:100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol/L組Cleaved caspase-3的含量增加,且均與0 μmol/L比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與100 μmol/L組比較,200 μmol/L組和400 μmol/L組Cleaved caspase-3的含量增加(P<0.05),200 μmol/L組和400 μmol/L組間無差異(P>0.05)。見表4,圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組PANC-1細(xì)胞凋亡及cleaved caspase-3表達(dá)水平; A 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡比例分布;B PANC-1細(xì)胞中Cleaved caspase-3相對表達(dá)量

表4 NA對PANC-1細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響 n=4,

2.4 NA對PANC-1細(xì)胞GSK-3β含量及活性的影響 Westerm blot方檢測GSK-3β和p-GSK-3β的表達(dá)水平，RT-PCR檢測GSK-3β mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與0 μmol/L組比較,100 μmol/L組、200 μmol/L組和400 μmol/L組GSK-3β、p-GSK-3β和GSK-3β mRNA的表達(dá)水平降低(P<0.05);與100 μmol/L組比較,200 μmol/L組和400 μmol/L組GSK-3β、p-GSK-3β和GSK-3βmRNA的表達(dá)水平進一步降低(P<0.05),200 μmol/L組和400 μmol/L組間表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。見圖3,表5。

圖3 PANC-1細(xì)胞中p-GSK-3β和GSK-3β的表達(dá)水平

表5 NA對PANC-1細(xì)胞GSK-3β的影響n=4,

2.5 過表達(dá)GSK-3β對NA抑制PANC-1細(xì)胞增殖和促進細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)以上結(jié)果,選擇200 μmol/L/L NA進行以下實驗,進一步驗證GSK-3β在NA促進PANC-1凋亡中的作用。結(jié)果顯示:與control virus比較,過表達(dá)PANC-1細(xì)胞中的GSK-3β可以部分逆轉(zhuǎn)NA對PANC-1細(xì)胞的作用,表現(xiàn)為Ki-67陽性細(xì)胞百分比增加(P<0.05);Ki-67蛋白表達(dá)量增加(P<0.05),細(xì)胞凋亡百分比降低(P<0.05);Cleaved caspase-3表達(dá)水平下降(P<0.05)。見圖4,表6。

圖4 過表達(dá)GSK-3β對NA作用的影響;A PANC-1細(xì)胞中Ki-67和Cleaved caspase-3的表達(dá)水平;B 流失細(xì)胞術(shù)檢測不同組PANC-1細(xì)胞凋亡;C ki-67典型代表

表6 過表達(dá)GSK-3β對NA作用的影響 n=4,

3 討論

胰腺癌癥狀不明確、診斷手段有限,胰腺癌的5年生存率非常低。造成的主要原因是胰腺癌細(xì)胞的多重耐藥性。聯(lián)合用藥是解決耐藥性的主要方法,然而聯(lián)合用藥可以增加藥物毒性及不良反應(yīng)。中藥單體是從中藥材中提取出的天然化合物,具有安全性高、毒性低的特點。其分子結(jié)構(gòu)清晰,生物活性好,藥理作用相對明顯,且研究證實中藥單體在抗腫瘤細(xì)胞耐藥性方面發(fā)揮著重要作用[7]。NA是從中藥中提取的一種天然有機化合物,分子式為C15H12O5,具有多種生物學(xué)功效[8]。NA具有抗胃癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和乳腺癌的作用。主要分子機制包括抑制MMP-2、MMP-9、磷酸化AKT、MAPKs/AP-1以及Ikks/IκB/NF-κB等;激活caspase-3、PARP以及DR5等[9]。有研究證實NA可以通過TGF-B1/Smad3通路抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移[10]。本實驗表明,100～400 μmol/L的NA均可降低PANC-1細(xì)胞的活力,抑制增殖,同時促進胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用,在100～200 μmol/L有濃度依耐性,在200～400 μmol/L沒有濃度依耐性。相同濃度下,48 h的抑制率比24 h強,表明NA的作用具有時間依耐性;而在同一濃度下48 h的抑制率和72 h間無明顯差異。導(dǎo)致這種NA作用時間和濃度特點可能和NA在細(xì)胞的轉(zhuǎn)運方式是ATP依賴的被動轉(zhuǎn)運方式有關(guān)。

在有氧或無氧條件下,癌細(xì)胞比正常細(xì)胞代謝更多的糖并轉(zhuǎn)化為乳酸,為大分子的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ),也可以促進腫瘤細(xì)胞對周圍正常組織的侵襲。糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,大約有100個已知靶點,不僅參與調(diào)控糖代謝還參與調(diào)控多種細(xì)胞途徑,包括正常細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),也可以促進腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。GSK-3有兩種亞型:GSK-3α和GSK-3β。兩種亞型在組織中的分布不同,GSK-3α在神經(jīng)系統(tǒng)、卵巢和皮膚中低表達(dá),而在網(wǎng)織紅細(xì)胞和闌尾中高表達(dá)。GSK-3β在網(wǎng)織紅細(xì)胞、淋巴結(jié)和胰腺組織中低表達(dá),而在NK細(xì)胞和骨髓粒細(xì)胞中高表達(dá)。有文獻(xiàn)證實GSK-3β在胰腺癌的發(fā)展過程中表達(dá)量逐漸增加,并在腫瘤侵襲和對化療耐受方面發(fā)揮重要作用[12]。GSK-3β通過自身磷酸化來調(diào)控其活性,在216和279位點酪氨酸磷酸化可以增加其活性。在胰腺癌細(xì)胞種216位點酪氨酸磷酸化水平增高。GSK-3β可以促進STAT3的磷酸化從而增加NFATc2-STAT3復(fù)合物,調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)促進癌細(xì)胞增殖[13]。GSK-3β抑制劑可以降低GLI1組織G1到S期的轉(zhuǎn)換抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。GSK-3β不但促進胰腺癌細(xì)胞增殖外,還可以通過磷酸化MDM2抑制細(xì)胞凋亡[14]。本實驗證實NA可以降低GSK-3β的蛋白含量和mRNA表達(dá)水平,同時可以降低216位點磷酸化GSK-3β的表達(dá),說明NA不但降低胰腺癌細(xì)胞PANC-1種GSK-3β的含量也降低GSK-3β的活性。進一步用慢病毒過表達(dá)PANC-1細(xì)胞中GSK-3β,發(fā)現(xiàn)NA對PANC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響減弱。

綜上所述,NA通過降低GSK-3β的表達(dá)及活性抑制PANC-1細(xì)胞增殖,促進凋亡。