周善學(xué) 陸蓉丹 朱春霞 邵永富 倪超 余筱燕 嚴(yán)嘉寧 鄭四鳴

胃癌是世界上第四大常見的惡性腫瘤，在胃腸道惡性腫瘤中最為多見，嚴(yán)重威脅人類生命和健康[1-2]，尤其是晚期胃癌患者，預(yù)后相對較差[3-4]。胃癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制具有多因素性和復(fù)雜性，研究胃癌分子機(jī)制十分必要[5]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種不具備編碼蛋白質(zhì)功能、長度超過200 bp 的RNA 分子[6]，在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 可通過與微小RNA（microRNA，miRNA）互相作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，是調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和miRNA 作用的關(guān)鍵內(nèi)源性RNA[9]。lncRNA 在胃癌中異常表達(dá)，與腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移分期（tumor node metastasis classification，TNM）、腫瘤浸潤，淋巴和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[10]。如lncRNA Linc01270在胃癌中高表達(dá)，通過上調(diào)肝配蛋白A3（ephrin A3，EFNA3）表達(dá)加速細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]；lncRNA CASC11 在胃癌中過表達(dá)，可有效抑制胃癌細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞周期[12]；lncRNA Linc01133 在胃癌中高表達(dá)，誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，從而抑制胃癌腫瘤的轉(zhuǎn)移[13]；lncRNA MT1JP 在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，通過下調(diào)F-框WD 重復(fù)域蛋白7（recombinant F-Box and WD repeat domain containing protein 7，F(xiàn)BXW7）表達(dá)來抑制腫瘤的生長[14]。目前l(fā)ncRNA717 在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的功能和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究擬分析lncRNA717 對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及調(diào)控機(jī)制，以期為胃癌的治療提供新的潛在靶點。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 TRIzol 試劑購自美國Ambion 公司，批號：350102；NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒、NovoStart?SYBR qPCR SuperMix plus 試劑盒均購自中國Novoprotein 公司，批號分別為0520891、05229413；Lipofectamine 2000 試劑盒購自美國Invitrogen 公司，批號：2220839；細(xì)胞增殖和毒性檢測（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）膠購自中國NCM Biotech 公司，批號分別為20220814、20220713；4%多聚甲醛購自中國Biosharp 公司，批號：70071800；結(jié)晶紫染液、RIPA 細(xì)胞裂解液、TBST 緩沖液購自Solarbio 公司，批號分別為20220508、20221013、20220615；Pierce Renilla 熒光素酶雙檢測試劑盒購自美國Thermo 公司，批號：ML165248；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自中國Beyotime 公司，批號：092221220517；干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）7 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自英國Abcam 公司，批號分別為GR3368578-12、GR3107462-11；電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）液購自美國Advansta 公司，批號：210414-73。

1.2 組織標(biāo)本 收集2021 年1 至12 月寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除或活檢的31 例胃癌組織及配對癌旁組織標(biāo)本，液氮凍存。納入標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)前未接受任何治療；經(jīng)病理檢測證實。排除標(biāo)準(zhǔn)：無行為能力或不完全行為能力者，妊娠期或哺乳期婦女，患有心肌梗死、肌肉組織病變患者，劇烈運動和強(qiáng)體力勞動者，意識障礙或嚴(yán)重精神疾病者，重要臟器功能衰竭不能耐受全麻者；急性感染合并高熱、感染性休克患者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（批準(zhǔn)文號：2020KY52）。所有患者均簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞系 胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27 購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所，人正常胃黏膜細(xì)胞系GES-1 購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院。使用含有10% FBS 和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，在5% CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代。取對數(shù)生長期AGS、HGC-27 細(xì)胞接種于6 孔板，待長至50%～60%融合度后，對細(xì)胞進(jìn)行分組，并使用Lipofectamine 2000試劑盒方法處理細(xì)胞。分組（1）：分為過表達(dá)對照組和lncRNA717 過表達(dá)組，分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)對照質(zhì)粒和lncRNA717 過表達(dá)質(zhì)粒；分組（2）：分為miR-762 過表達(dá)組、miR-762 敲低組和對照組，分別轉(zhuǎn)染miR-762模擬物、miR-762 抑制物和模擬物對照；分組（3）：分為敲低對照組、lncRNA717 敲低組、過表達(dá)對照組和lncRNA717 過表達(dá)組，分別轉(zhuǎn)染敲低對照干擾miRNA、lncRNA717 敲低miRNA、過表達(dá)對照質(zhì)粒和lncRNA717過表達(dá)質(zhì)粒；分組（4）：分為對照組、miR-762 過表達(dá)組和共表達(dá)組，分別轉(zhuǎn)染模擬物對照、miR-762 模擬物和miR-762模擬物+lncRNA717過表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒用100 μL DMEM培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)5 min，轉(zhuǎn)移到含有Lipofectamine 2000 的培養(yǎng)基中，輕柔混勻，靜置20 min；混合后的培養(yǎng)基加入到用無血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的6 孔細(xì)胞板中，十字混勻后培養(yǎng)4 h，換成含血清的DMEM 完全培養(yǎng)基。5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.4 檢測方法

1.4.1 不同組織和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA717 表達(dá)的檢測 采用qRT-PCR 法。使用TRIzol 試劑從組織標(biāo)本（胃癌組織、癌旁組織）和3 種細(xì)胞、分組（1）和分組（2）各組細(xì)胞中提取總RNA。使用NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用NovoStart?SYBR qPCR SuperMix plus 進(jìn)行qRT-PCR 檢測。qRT-PCR 反應(yīng)體系：模板1.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，SYBR 5.0 μL，用DEPC水補(bǔ)足10.0 μL。qRT-PCR 反應(yīng)程序：90 ℃，2 min 變性；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s。循環(huán)40 次。以GAPDH 為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法計算各樣本中l(wèi)ncRNA717 相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-762 表達(dá)的檢測 采用qRTPCR 法。取分組（3）各組細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行qRT-PCR 檢測。反應(yīng)體系：模板1.0 μL，miR-762 上、下游引物各1.0 μL，SYBR 10.0 μL，用DEPC 水補(bǔ)足20.0 μL。反應(yīng)程序：90 ℃，3 min 變性；95 ℃，12 s；62 ℃，40 s；72 ℃，30 s。循環(huán)40 次。以U6為內(nèi)參。根據(jù)2-ΔΔCt法計算各樣本中miR-762 相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.4.3 細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8 法。取分組（1）和分組（4）各組細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104個/mL，接種于96 孔板，100.0 μL/孔，分別培養(yǎng)0、24、48、72 和96 h，每孔加入10.0 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h，測定各組細(xì)胞在450 nm 波長處的吸光度，吸光度值越高表明活細(xì)胞數(shù)目越多，即細(xì)胞活力越強(qiáng)。

1.4.4 細(xì)胞增殖能力檢測 采用克隆形成實驗。取分組（1）和分組（4）各組細(xì)胞，調(diào)整密度為1×104個/mL，接種于6 孔板，100.0 μL/孔，每隔4 d 更換培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)14 d。待觀察到明顯的細(xì)胞集落后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定15 min，再用1 mL 結(jié)晶紫染液染色15 min，對細(xì)胞集落直接拍照記錄，對藍(lán)色細(xì)胞集落進(jìn)行計數(shù)分析。

1.4.5 細(xì)胞遷移能力檢測 采用劃痕試驗。取分組（1）和分組（4）各組細(xì)胞，接種于6 孔板，待各組細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿孔底，使用200.0 μL 黃色槍頭在孔底劃1 條筆直的線，用PBS 洗去脫落細(xì)胞；加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。在0、24 h 時取出細(xì)胞，使用倒置光顯微鏡4×鏡下觀察并拍照，用Image J 分析細(xì)胞遷移面積，計算相對遷移率。

1.4.6 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell 試驗。取分組（1）和分組（4）細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104個/mL，加入到細(xì)胞上室中，同時加入200.0 μL 無血清培養(yǎng)基；下室中加入750.0 μL 含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。孵育48 h 后取出小室，加入750.0 μL 4%多聚甲醛固定15 min，再用750.0 μL 結(jié)晶紫染液染色15min，用濕棉簽擦去表面細(xì)胞，使用倒置光顯微鏡10×鏡下觀察拍照，統(tǒng)計并比較穿過小室的細(xì)胞數(shù)目。

1.4.7 細(xì)胞熒光素酶活性檢測 采用熒光素酶報告基因?qū)嶒?。通過工具網(wǎng)站TargetScan預(yù)測分析lncRNA717與miR-762 的堿基結(jié)合位點，構(gòu)建lncRNA717-野生型和lncRNA717-突變型雙熒光素酶載體。取分組（2）中的miR-762 過表達(dá)組和對照組細(xì)胞，使用Lipofectamine 2000 試劑盒分別對lncRNA717-野生型、lncRNA717-突變型共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h 后取出細(xì)胞，裂解液裂解后根據(jù)熒光素酶雙檢測試劑盒說明書方法測定共轉(zhuǎn)染的4 組細(xì)胞相對熒光素酶活性。

1.4.8 細(xì)胞IRF7 蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法。收集分組（2）和分組（4）各組細(xì)胞，PBS 洗滌2 次后加入RIPA 裂解液，4 ℃，12 000 r/m 離心20 min，收取上清液，使用BCA 法測量蛋白濃度；經(jīng)SDS-PAGE 120 V 恒壓電泳、濕法轉(zhuǎn)膜，TBST 清洗后將膜置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，分別加入稀釋好的IRF7 和GAPDH 抗體，4 ℃水平搖床孵育過夜。加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h，用ECL 化學(xué)發(fā)光液顯色，拍照記錄。使用Image J 軟件分析蛋白灰度值，以GAPDH 為對照計算IRF7 蛋白相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用GraphPad Prism 9 統(tǒng)計軟件。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。各項實驗均進(jìn)行3 次獨立重復(fù)。P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA717 在2 種組織和3 種細(xì)胞中表達(dá)的比較 相比癌旁組織，胃癌組織中l(wèi)ncRNA717 顯著低表達(dá)（P＜0.01）；相比人正常胃黏膜細(xì)胞系GES-1 細(xì)胞，胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、HGC-27 中l(wèi)ncRNA717 顯著低表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖1。

圖1 lncRNA717 表達(dá)的比較（A：胃癌組織和癌旁組織中；B：人正常胃黏膜細(xì)胞和胃癌細(xì)胞系中）

2.2 過表達(dá)lncRNA717 對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 相比過表達(dá)對照組，lncRNA717 過表達(dá)組細(xì)胞lncRNA717 表達(dá)水平上調(diào)3～5 倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2A（插頁）。細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，lncRNA717 過表達(dá)組細(xì)胞培養(yǎng)96 h 時吸光度值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示過表達(dá)lncRNA717 抑制細(xì)胞生長，見圖2B（插頁）。細(xì)胞克隆實驗表明，lncRNA717 過表達(dá)組細(xì)胞集落數(shù)顯著減少（P＜0.05），提示過表達(dá)lncRNA717 抑制細(xì)胞增殖，見圖2C（插頁）。細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測結(jié)果顯示，相比過表達(dá)對照組，lncRNA717 過表達(dá)組細(xì)胞相對遷移率顯著降低，穿過小室的細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），提示過表達(dá)lncRNA717 有效抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲，見圖2D、E（插頁）。

圖2 lncRNA717 對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響（A：兩組細(xì)胞lncRNA717 表達(dá)的比較；B：兩組細(xì)胞活力的比較；C：兩組細(xì)胞增殖能力的比較；D：兩組細(xì)胞遷移能力的比較；E：兩組細(xì)胞侵襲能力的比較）

2.3 lncRNA717 與miR-762 靶向結(jié)合的預(yù)測和驗證TargetScan 預(yù)測發(fā)現(xiàn)，lncRNA717 與miR-762 存在高度保守的堿基結(jié)合位點，見圖3A。與對照組相比，miR-762 過表達(dá)組的野生型相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），而突變型無顯著變化，提示lncRNA717 和miR-762 存在直接相互作用，見圖3B。相比對照組，miR-762 敲低組lncRNA717 相對表達(dá)量顯著上調(diào)，miR-762 過表達(dá)組lncRNA717 相對表達(dá)量顯著下調(diào)；同時，lncRNA717 敲低組miR-762 相對表達(dá)量顯著高于敲低對照組，lncRNA717 過表達(dá)組miR-762 相對表達(dá)量顯著低于過表達(dá)對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3C。Western blot 檢測結(jié)果顯示，miR-762 過表達(dá)組IRF7相對表達(dá)量低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3D。可見lncRNA717 可以負(fù)調(diào)控miR-762 和正調(diào)控IRF7 的表達(dá)，提示lncRNA717/miR-762/IRF7調(diào)節(jié)軸抑制胃癌的進(jìn)展。

圖3 lncRNA717 與miR-762 靶向結(jié)合的預(yù)測和驗證（A：miR-762 與lncRNA717 的結(jié)合位點；B：突變型和野生型相對熒光素酶活性比較；C：miR-762 干擾下的lncRNA717 的表達(dá)和lncRNA717 干擾下的miR-762 的表達(dá)比較；D：IRF7 蛋白相對表達(dá)量比較）

2.4 過表達(dá)miR-762 和lncRNA717 對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 相比對照組，miR-762 過表達(dá)組在培養(yǎng)96 h 時細(xì)胞吸光度值顯著升高，細(xì)胞集落數(shù)顯著增多，相對遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加，IFR7 蛋白相對表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），提示過表達(dá)miR-762 可促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖，提高遷移和侵襲能力；相比miR-762 過表達(dá)組，共表達(dá)組在培養(yǎng)96 h 時細(xì)胞吸光度值顯著降低，細(xì)胞集落數(shù)顯著減少，相對遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，IFR7 相對表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），提示lncRNA717 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-762 對細(xì)胞生長、增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用。見圖4（插頁）。

圖4 miR-762 和lncRNA717 對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響（A：3 組細(xì)胞吸光度的比較；B：3 組細(xì)胞增殖的比較；C：3 組細(xì)胞遷移能力的比較；D：3 組細(xì)胞侵襲能力的比較；E：3 組細(xì)胞IRF7 表達(dá)的比較）

3 討論

lncRNA 是一種通常情況下不編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA 分子，近年來被證實在胃癌中起到重要調(diào)控作用[15-17]。如Zhang 等[18]發(fā)現(xiàn)lncRNA CRNDE 通過富含絲氨酸/精氨酸剪接因子6（rich in serine/arginine splicing factor 6，SRSF6）調(diào)節(jié)的磷脂酰肌醇結(jié)合網(wǎng)格蛋白裝配蛋白（phosphatidylinositol binding network protein assembly protein，PICALM）替代拼接削弱了胃癌的抗藥性。lncRNA LINC00942 通過抑制武藏RNA 結(jié)合蛋白2（RNA-binding protein Musashi homolog 2，MSI2）降解提高了細(xì)胞性骨髓細(xì)胞增多病毒癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）mRNA 的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)胃癌的耐藥性[19]。本研究結(jié)果顯示，敲低lncRNA717 能顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，過表達(dá)lncRNA717 則顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這表明lncRNA717 可能在胃癌的發(fā)展中起到重要作用。

競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenouse RNA，ceRNA）假說認(rèn)為，lncRNA 可以作為miRNA 的海綿負(fù)向調(diào)節(jié)miRNA 的活性，減弱其對靶基因的抑制作用[20-21]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-762 在腫瘤中具有調(diào)節(jié)作用。如miR-762 通過靶向假定腫瘤抑制亮氨酸拉鏈蛋白1（leucine zipper putative tumor suppressor 1，LZTS1）調(diào)節(jié)參與胃癌發(fā)展的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）和Hippo 通路的激活[22]，活化miR-762 可賦予非小細(xì)胞肺癌吉非替尼的抗性[23]。Tarager-Scan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析，lncRNA717 可能與miR-762 存在相互結(jié)合的位點。本研究發(fā)現(xiàn)miR-762 與lncRNA717 的表達(dá)量成負(fù)相關(guān)，雙熒光素酶實驗驗證了miR-762 與lncRNA717 的靶向作用。即lncRNA717 通過靶向結(jié)合miR-762 來抑制胃癌發(fā)展。

IRF7 是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控Ⅰ型干擾素，而Ⅰ型干擾素的異常與癌癥等疾病有關(guān)[24]。Xing等[15]篩選了miRDIP、TargetScan 和miRTarBase 等3 個成熟的數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)IRF7 是共享的唯一靶基因；熒光素酶報告測定顯示，miR-762 顯著抑制了野生型的IRF7活性，但突變型不受影響。IRF7 蛋白表達(dá)水平在miR-762 表達(dá)下降后反而增加，提示miR-762 能靶向結(jié)合IRF7 基因，抑制IRF7 的抗癌作用。本研究結(jié)果證明IRF7 的表達(dá)與miR-762 負(fù)相關(guān)，過表達(dá)miR-762會顯著降低IRF7 表達(dá)水平，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而共轉(zhuǎn)染lncRNA717 使得這一現(xiàn)象被顯著逆轉(zhuǎn)，表明IRF7 是lncRNA717/miR-762 的下游靶標(biāo)，lncRNA717 結(jié)合miR-762 來促進(jìn)IRF7 表達(dá)起到抑制癌細(xì)胞的作用。

本研究還存在一定局限，后續(xù)可開展以下深入探索，一是檢測lncRNA717 在胃癌患者血清中的表達(dá)水平，比較其在胃癌患者和健康對照之間的差異表達(dá)。二是結(jié)合臨床病理數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探討lncRNA717 表達(dá)水平與胃癌分期、患者預(yù)后及臨床病理資料的關(guān)系。本研究僅在體外驗證了lncRNA717/ miR-762/IRF7 軸在細(xì)胞中的作用，但缺乏體內(nèi)動物數(shù)據(jù)。因此，后續(xù)可通過構(gòu)建動物模型驗證lncRNA717 在胃癌模型動物中的調(diào)節(jié)機(jī)制。

綜上所述，lncRNA717 在胃癌發(fā)生、發(fā)展中存在重要作用。lncRNA717 通過競爭miR-762，抵消miR-762對IRF7 的抑制作用，從而抑制胃癌細(xì)胞侵襲、增殖和遷移。